دانشگاه شهید باهنر کرمان (دانشکده کشاورزی و پژوهشکده فناوری تولیدات گیاهی) و انجمن بیوتکنولوژی جمهوری اسلامی ایران مجله بیوتکنولوژی کشاورزی 2228-6705 5 2 2013 08 23 Cloning, over Expression and Characterization of Alkalin Phytase Enzyme in Escherichia Coli همسانه‌سازی، بیش بیان و بررسی خصوصیات آنزیم قلیایی فیتاز (phyC) در باکتری اشرشیا کلی 1 16 1197 10.22103/jab.2013.1197 FA حمید آریان نژاد محمدرضا نصیری علی اصغر اسلمی نژاد احمد آسوده حسام دهقانی Journal Article 2012 08 08 Phytase (myo-inositol hexakisphosphate) is the hydrolysis enzyme of phytic acid that produces inorganic phosphate. The gene phyC encoding phytase was isolated from Bacillus subtilis ATCC12711 genomic library and sequenced. The nucleotide sequence of the phytase gene contained an open reading frame of 1089 bp, which codes for 90 bp signal peptide and a mature protein with a deduced molecular mass of 42 kDa. Target gene was inserted in pET32a (+) as expression vector and transformed to Escherichia coli BL21 (DE3) as host expression. The fusion phytase phyC-Trx gene was successfully overexpressed in E. coli as an active and cytoplasmic phytase. Recombinant protein production was induced with 1mM IPTG in shaking ﬂasks at 300C in presence of 10 mM calcium. Samples were taken at 0-5 h after induction by 1 hour time intervals, and then protein electrophoresis was done. phyC-Trx protein was expressed in the cytoplasm of E. coli successfully. Molecular weight of recombinant phytas was estimated about 64 kDa. Phytase activity was 7.44 U/ml with using standard phosphates method. Optimum pH for the degradation of phytate was 7. The results of current study showed that thermal stability and cost effective production make this enzyme attractive for using in feed supplements. فیتاز (مایواینوزیتول هگزا کیس فسفات فسفو هیدرولاز) آنزیمی هیدرولیزی است که فسفات معدنی تولید می‌کند. ژن کد کننده فیتاز phyC از باکتری باسیلوس سابتیلیس ATCC12711 جداسازی و توالی یابی شد. توالی نوکلوتیدی ژن فیتاز حاوی ناحیه کدکننده به طول 1089 جفت باز است که 90 نوکلوتید ابتدایی آن، مربوط به سیگنال پپتید ژن می‌باشد. به منظور تولید آنزیم فیتاز نوترکیب، ژن هدف به وکتور بیانی pET32a (+) وارد شد و وکتور نوترکیب پس از تکثیر در باکتری اشرشیا کلی DH5α به باکتری اشرشیا کلی BL21(DE3) به عنوان میزبان بیان منتقل شد. تحریک بیان ژن با استفاده از IPTG در غلظت نهایی 1 میلی مولار در دمای 30 درجه سانتیگراد و حضور کلرید کلسیم 10 میلیمولار صورت گرفت. نمونه‌گیری در زمان‌های صفر تا پنج ساعت انجام شد و میزان تولید پروتئین نوترکیب با استفاده از الکتروفورز بررسی گردید. فیتاز محلول حاصل از ژن phyC-Trx با موفقیت به شکل درون‌سلولی در باکتری اشرشیا کلی بیان شد. وزن مولکولی فیتاز نوترکیب تولید شده در حدود 64 کیلو دالتون تخمین زده شد. اندازهگیری فعالیت آنزیمی با استفاده از روش استاندارد فسفاتاز، فعالیت آنزیم نوترکیب تولید شده را 44/7 واحد در میلی‌لیتر نشان داد. همچنین pH بهینه برای فعالیت آنزیم فیتاز قلیایی نوترکیب در حدود 7 برآورد شد. نتایج نشان داد که فیتاز بدست آمده از باکتری باسیلوس سابتیلیس به جهت پایداری حرارتی و همچنین هزینه پایین تولیدی گزینه مطلوبی جهت استفاده در صنعت می‌باشد.

https://jab.uk.ac.ir/article_1197_f9b37cf0c71e69586d7b5b3948b20f46.pdf