دانشگاه شهید باهنر کرمان (دانشکده کشاورزی و پژوهشکده فناوری تولیدات گیاهی) و انجمن بیوتکنولوژی جمهوری اسلامی ایران مجله بیوتکنولوژی کشاورزی 2228-6705 5 2 2013 08 23 A home-made T/A vector for simplification of cloning DNA fragments obtained from PCR تهیه آزمایشگاهی وکتور T/A برای تسهیل همسانه سازی قطعات DNA حاصل از PCR 157 169 1207 10.22103/jab.2013.1207 FA ناهید مسعودی نعمت سخندان بشیر Journal Article 2012 06 11 Today, genetic engineering is an indispensable component of modern biological research and DNA cloning, as one of the most important applications of this technology, has a wide-range application. Plasmids are the most commonly used vectors that provide replication of a desired gene usually in a bacterial host. T/A cloning vectors are one type of plasmids which facilitate cloning of a DNA fragment provided that the DNA is amplified by Taq DNA polymerase through polymerase chain reaction (PCR). In cases where the resources are limited, purchasing commercial T/A cloning kits may be hardly possible. So, availability of a home-made T/A vector with a good performance in the laboratory would be important. In this study, after preparation of competent Echerchia coli cells, the circular plasmid pTZ57R (without insert) was transformed into the cells. After plasmid extraction by alkaline lysis method, the plasmid was cut with EcoRV to make it linear. Then, the enzyme was inactivated and thymine nucleotide was added to the free 5‘ ends of the linear plasmid. The efficiency of the vector was demonstrated during ligation reactions and subsequent transformations. In addition, a segment of potyvirus genome that was amplified by a pair of universal primers was inserted into the T/A vector and subjected to sequencing. Comparison of the sequencing data with that of the counterpart regions available in GenBank has ended in identification of the virus as Soybean mosaic virus. امروزه مهندسی ژنتیک جزء اجتناب ناپذیر پژوهشهای زیست شناسی نوین میباشد و همسانهسازی به عنوان یکی از اصلیترین بخشهای این علم، کاربرد گستردهای دارد. پلاسمیدها یکی از پرکاربردترین حاملها میباشند که امکان تکثیر ژن مورد نظر را به صورت نامحدود در میزبان عمدتا" باکتریایی فراهم میکنند. وکتورهای T/A نوعی از حاملهای پلاسمیدی میباشند که امکان همسانهسازی قطعه دیانای تکثیر شده با آنزیم Taq DNA polymerase (در واکنش زنجیرهای پلیمراز) را تسهیل می کنند. با توجه به محدودیت امکانات، خرید کیت همسانهسازی حاوی این پلاسمید ممکن است به سختی میسر باشد. به همین جهت تهیه این وکتور با کارایی خوب در آزمایشگاه حائز اهمیت است. در این پژوهش، بعد از تهیه سلول های مستعد (رقیب) از باکتری Escherchia coli، پلاسمید حلقوی و فاقد قطعه خارجی pTZ57R به این سلولها ترانسفورم گردید. پس از استخراج پلاسمید به روش لیزآلکالینی، با آنزیم EcoRV پلاسمید برش داده شده و خطی گردید. سپس آنزیم برشی غیرفعال گردید و نوکلئوتید تیمین به انتهای آزاد این پلاسمید خطی اضافه شد. سپس کارایی حامل تهیه شده طی واکنش اتصال دیانای به پلاسمید و متعاقب آن، ترانسفورماسیون باکتری تأیید گردید. بعلاوه، بخشی از ژنوم پوتیویروس که با جفت آغازگر یونیورسال مورد تکثیر قرار گرفته بود در پلاسمید ساخته شده مورد همسانه سازی وترادف یابی قرار گرفت که در مقایسه با توالیهای همقطار موجود در پایگاه ژن بانک بعنوان ویروس موزائیک سویا تشخیص داده شد.

https://jab.uk.ac.ir/article_1207_4e4e53aa080247bc31d0eb4e7aeb07a0.pdf