دانشگاه شهید باهنر کرمان (دانشکده کشاورزی و پژوهشکده فناوری تولیدات گیاهی) و انجمن بیوتکنولوژی جمهوری اسلامی ایران مجله بیوتکنولوژی کشاورزی 2228-6705 10 1 2018 06 22 Gene cloning and expression of Xanthomonas citri subsp. citri pilin همسانه سازی و بیان ژﻥ پیلین باکتری Xanthomonas citri subsp. citri 35 48 2066 10.22103/jab.2018.2066 FA حمیده رئیسی دانشجوی دکتری بیماری‏شناسی گیاهی، دانشکده علوم کشاورزی ﺩﺍﻧﺸﮕﺎﻩ گیلان، رشت، ایران. محمدرضا صفرنژاد دانشیار بخش ﻭﻳﺮﻭﺱ ﺷﻨﺎﺳﻲ ﮔﻴﺎﻫﻲ، ﻣﻮﺳﺴﻪ ﺗﺤﻘﻴﻘﺎﺕ ﮔﻴﺎﻩ ﭘﺰﺷﻜﻲ ﻛﺸﻮﺭ، سازمان تحقیقات آموزش و ترویج کشاورزی ایران، ﺗﻬﺮﺍﻥ، ایران. سید مهدی علوی استادیار بخش ﺑﻴﻮﺗﻜﻨﻮﻟﻮژﻱ ﮔﻴﺎﻫﻲ، ﭘﮋﻭﻫﺸﮕﺎﻩ ﻣﻠﻲ ﻣﻬﻨﺪﺳﻲ ژﻧﺘﻴﻚ ﻭ ﺯﻳﺴﺖ ﻓﻦ ﺁﻭﺭﻱ، ﺗﻬﺮﺍن، ایران. 0000-0002-5875-3537 سید علی الهی نیا استاد گروه بیماری‏شناسی گیاهی، دانشکده علوم کشاورزی ﺩﺍﻧﺸﮕﺎﻩ گیلان، رشت، ایران. ناصر فرخی استادیار گروه علوم و زیست فناوری گیاهی، دانشکده علوم و فناوری زیستی، ﺩﺍﻧﺸﮕﺎﻩ شهید بهشتی،تهران، ایران. Journal Article 2017 11 07 Citrus bacterial canker is a disease caused by <em>Xanthomonas</em> <em>citri</em> subsp. <em>citri</em> (<em>Xcc</em>). The bacterial type III secretion system (TTSS) consist of an extracellular filamentous structure mediating transfer of bacterial proteins into the plant cytosols. The main part of the pilus is pilin protein (HrpE) that is encoded by the <em>HrpE</em> gene. Production of specific antibodies against the pilin protein can be implemented for detection of infected plants as well as to develop a source of genetic resistance against disease. Inhibition of HrpE protein through antibody therapy leads to suppression of disease in the plant. The objective of the present study was to isolate, clone and express the <em>HrpE</em> gene. To do this, the <em>HrpE</em> gene was amplified by PCR using gene-specific primers and cloned to the pTZ57R/T vector. Then, it was cloned to the pET28a(+) bacterial expression vector and expressed in the E. coli strain Rosetta as host. The protein production procedure was optimized for incubation time and temperature as well as the concentration of inducer. The greatest amount of the recombinant protein was yielded at 1 mM IPTG at 30° C for 16 h. Purification of HrpE recombinant protein was done via metal affinity chromatography. The results of both SDS-PAGE and Western blotting assays confirmed the expression accuracy and purity of recombinant pilin protein. The recombinant protein can be used as an antigen to develop monoclonal and polyclonal antibodies. <br /><em><br /></em>  بیماری شانکر باکتریایی مرکبات توسط باکتری <em>Xanthomonas</em> <em>citri</em> subsp. <em>citri</em> (<em>Xcc</em>) ایجاد می­شود. سیستم ترشحی نوع سه این باکتری دارای یک ساختار خارج سلولی رشته‏ای است که پروتئین­های باکتریایی را به داخل سلول گیاه وارد می­کند. پروتئین پیلین (HrpE) جزء اصلی تشکیل دهنده پیلوس می باشد که توسط ژن <em>HrpE</em> کد می‏شود. تولید پادتن اختصاصی علیه پروتئین پیلین می‏تواند به منظور شناسایی گیاهان آلوده و همچنین به عنوان منبع ژنتیکی مقاومت علیه بیماری مورد استفاده قرار گیرد. غیر‏فعال‏سازی پروتئین HrpE با استفاده از پادتن می‏‏تواند منجر به سرکوب بیماری در گیاه شود. هدف از این تحقیق جداسازی و بیان ژن <em>HrpE</em> و خالص‏سازی پروتئین حاصل از آن بود. برای این منظور، قطعه ژنی <em>HrpE</em> با استفاده از آغازگرهای اختصاصی جدا و در ناقل pTZ57R/T همسانه‏سازی شد. بیان این ژن به‏صورت نوترکیب در ناقل pET28a(+) و در سویه Rosetta باکتری <em>Escherchia</em> <em>coli</em> انجام شد. بهینه‏سازی تولید پروتئین نوترکیب تحت تاثیر زمان‏های مختلف، دمای نگهداری و همچنین غلظت‏های مختلف القا‏کننده مورد بررسی قرار گرفت. بیشترین مقادیر بیان در دمای 30 درجه سلسیوس و طی زمان 16 ساعت و با IPTG یک میلی‏مولار به‏دست آمد. خالص‏سازی پروتئین نوترکیب HrpE با استفاده از روش کروماتوگرافی تمایلی بر روی ستون نیکل صورت پذیرفت. نتایج آزمون‏های الکتروفورز پروتئین و وسترن بلاتینگ با استفاده از پادتن‏های اختصاصی، صحت بیان و خالص‏سازی پروتئین نوترکیب پیلین را مورد تایید قرار دادند. پروتئین نوترکیب تولید شده می‏تواند به عنوان آنتی‏ژن برای تولید پادتن‏های تخصصی تک همسانه‏ای و چند همسانه‏ای مورد استفاده قرار گیرد. https://jab.uk.ac.ir/article_2066_6f4920ea25403ec77bee9efce43ea25e.pdf