دانشگاه شهید باهنر کرمان (دانشکده کشاورزی و پژوهشکده فناوری تولیدات گیاهی) و انجمن بیوتکنولوژی جمهوری اسلامی ایران مجله بیوتکنولوژی کشاورزی 2228-6705 10 3 2018 12 22 Designing of polyoleosin-proinsulin fusion gene and its transformation to rapeseed (Brassica napus L.) طراحی تلفیق ژنی پلی‌اولئوزین-پروانسولین و انتقال آن به گیاه کلزا (Brassica napus L.) 1 16 2204 10.22103/jab.2018.2204 FA نجمه آیت فرد کارشناسی ارشد بیوتکنولوژی کشاورزی، گروه مهندسی تولید و ژنتیک گیاهی، دانشکده کشاورزی، دانشگاه علوم کشاورزی و منابع طبیعی خوزستان، خوزستان، ایران. اسماعیل قاسمی گوجانی استادیار گروه مهندسی تولید و ژنتیک گیاهی، دانشکده کشاورزی، دانشگاه علوم کشاورزی و منابع طبیعی خوزستان، خوزستان، ایران. علیرضا شافعی‌نیا استادیار گروه مهندسی تولید و ژنتیک گیاهی، دانشکده کشاورزی، دانشگاه علوم کشاورزی و منابع طبیعی خوزستان، خوزستان، ایران. پیام پورمحمدی استادیار گروه مهندسی تولید و ژنتیک گیاهی، دانشکده کشاورزی، دانشگاه علوم کشاورزی و منابع طبیعی خوزستان، خوزستان، ایران. 0000-0003-2292-6069 Journal Article 2018 06 19 Objective The use of plant Oleosin gene is a recommended method for large-scale, easier and cheaper production of recombinant protein. Attachment of oleosin gene to target gene cause to accumulate recombinant protein on seed oil bodies surface. Recent researches indicate that application of tandem Oleosin Genes (polyoleosin) fused to the target gene to facilitate recombinant protein purification is more efficient than single Oleosin.   Materials and methods In present research, we designed a synthetic fusion fragment containing 5´- Kozak sequence - His-tags, three Oleosin Genes, a proteolytic site for a peptidase enzyme, Proinsulin protein, and a tetranucleotide stop codon. This synthetic sequence was cloned in binary vector pBI121by enzymatic digestion and ligation method. Then for transformation of cotyledon and hypocotyl explants of Canola, confirmed recombinant construct is transformed to Agrobacterium LBA4404 strain. Probable transgenic shoots were regenerated on selective medium containing kanamycin after 4-6 weeks.   Results The analysis of transgenic shoots at DNA level was performed by PCR and amplification of a 120-bp fragment indicate integration of fusion gene in transgenic plant genome. Finally, the Proinsulin gene transcription was also confirmed by RT- PCR. هدف: استفاده از ژن اولئوزین گیاهی یک روش مناسب برای تولید و تجمع پروتئین نوترکیب در مقیاس زیاد و همچنین استخراج راحت­تر و ارزان­تر می­باشد. اتصال اولئوزین به ژن موردنظر، موجب هدف­گیری پروتئین نوترکیب به اجسام روغنی بذر می­شود. در سال­های اخیر، به منظور افزایش کارایی اولئوزین در تولید پروتئین نوترکیب، چند ژن اولئوزین (پلی­اولئوزین)، به ژن هدف متصل می­شود. این امر سبب تولید و تجمع پروتئین نوترکیب در سطوح اقتصادی در بذر می­گردد.   مواد و روش­ها: از این­رو برای افزایش میزان تجمع پروتئین پروانسولین در بذر گیاه کلزا، یک سازه­ی تلفیقی پلی­اولئوزین-پروانسولین طراحی و ساخته شد. در طراحی این توالی به ترتیب از سمت /5 توالی، یک توالی کزاک، یک برچسب هیستیدین، سه ژن اولئوزین، یک جایگاه پروتئولیتیکی برای پروتئاز، ژن پروانسولین و یک کدون پایان تترانوکلئوتید قرار گرفت. این تلفیق ژنی پس از سنتز در ناقل pUC57 قرار داده شد. تلفیق ژنی، پس از هضم آنزیمی به وسیله­ی آنزیم­های BamHI و SacI از pUC57 جداسازی و در ناقل دوتایی pBI121 همسانه­سازی گردید. پس از تائید درج تلفیق ژنی در ناقل pBI121 با استفاده از روش­های PCR، هضم آنزیمی و توالی­یابی، ناقل نوترکیب به سویه­ی LBA4404 اگروباکتریوم انتقال داده شد. این باکتری برای تراریختی ریزنمونه­های کوتیلدون و هیپوکوتیل کلزا مورد استفاد قرار گرفت. نوساقه­های باززایی شده در محیط انتخابی حاوی کانامایسین گزینش شدند. نتایج: آنالیز گیاهان تراریخته در سطح DNA با استفاده از روش PCR انجام و یک قطعه­ی 120 جفت بازی (مطابق با بخشی از ژن پروانسولین) تکثیر شد. همچنین تکثیر این قطعه­ی 120جفت­بازی با روش RT-PCR، بیانگر بیان ژن هدف در گیاهان تراریخته بود. https://jab.uk.ac.ir/article_2204_4b4edc2630fe75800ddc29a7b4070add.pdf