دانشگاه شهید باهنر کرمان (دانشکده کشاورزی و پژوهشکده فناوری تولیدات گیاهی) و انجمن بیوتکنولوژی جمهوری اسلامی ایران مجله بیوتکنولوژی کشاورزی 2228-6705 13 4 2021 12 22 Isolation, Molecular Cloning, and Expression of yyxA Serine Protease Gene Extracted from Bacillus licheniformis in Escherichia coli جداسازی، همسانه‌سازی و بیان ژن سرین پروتئاز yyxA استخراج شده از باکتری Bacillus licheniformis در باکتری Escherichia coli 35 54 3136 10.22103/jab.2021.17638.1320 FA زهرا آقایی جشوقانی گروه بیوتکنولوژی کشاورزی، دانشکده کشاورزی و منابع طبیعی، دانشگاه بین المللی امام خمینی (ره) قزوین 0000-0002-9829-3168 رامین حسینی گروه بیوتکنولوژی، دانشکده کشاورزی، دانشگاه بین المللی امام خمینی (ره) قزوین 0000-0002-0779-3387 Journal Article 2021 09 18 Objective Proteases are among the most important industrial enzymes. Microbial proteases, especially from Bacillus sp., are most widely exploited industrially. The aim of this study was isolation, cloning, sequencing, expression, and bioinformatics study of yyxA serine protease gene extracted from Bacillus licheniformis. Materials and methods In this study, after extraction of bacterial DNA, the yyxA serine protease gene was isolated from Bacillus licheniformis using the polymerase chain reaction technique and cloned into the pTG19-T vector. The molecular structure, its biochemical and phylogenetic properties were investigated. The three-dimensional structure of the cloned enzyme was predicted using the I-TASSER, PHYRE2, RAPTORX, and Modeller tools. Confirmation of yyxA gene expression was performed by SDS-PAGE and dot blot analysis. Results Cloning was confirmed by sequencing. Based on the results of phylogenetic studies, the obtained protein sequence showed high similarity to the sequences of other Bacillus species, such as B. subtilis, B. gobiensis, and B. pumilus. After evaluating the drawn models, it was found that the models provided by PHYRE2 and I-TASSER software were desirable ones for predicting the three-dimensional structure of this protease. Recombinant protein production was successfully induced by IPTG induction in the host containing the plasmid pET28a-yyxA. Optimization of recombinant protein production was investigated. The highest expression values were obtained at 37 ° C for 4 hours with one mM IPTG. Conclusions The nucleotide sequence of the yyxA gene is 1212 nucleotides long, encoding a protein with 403 amino acids. Studies have shown that the enzyme encoded by this gene is in the category of stable enzyme and will be expressed in solution in Escherichia coli. These advantages make the enzyme as a suitable candidate for use in industry. هدف: پروتئازها از مهم‌‌‌‌‌‌‌ترین آنزیم‌های صنعتی محسوب می‌شوند. معمولاً برای تولید این آنزیم‌ها برای مصارف صنعتی از باکتری‌های متعلق به جنس باسیلوس استفاده می‌شود. هدف از این پژوهش جداسازی، همسانه‌سازی، تعیین توالی، بیان و بررسی بیوانفورماتیکی ژن سرین پروتئاز yyxA استخراج شده از باکتری باسیلوس لیکنی‌فورمیس بود. مواد و روش‌ها: در این مطالعه، پس از استخراج DNA باکتریایی، ژن سرین پروتئاز با نام yyxA از باکتری Bacillus licheniformis با استفاده از تکنیک واکنش زنجیره‌ای پلی‌مراز جداسازی و در ناقل pTG19-T و سپس ناقل pET28a همسانه‌سازی شدند و ساختار مولکولی، ویژگی‌های بیوشیمیایی و فیلوژنتیکی آن مورد بررسی قرار گرفت. ساختار سه بعدی آنزیم همسانه‌سازی شده با استفاده از ابزارهای PHYRE2، I-TASSER، RAPTORX و Modeller پیش‌بینی شد. تأیید بیان ژن yyxA توسط آنالیز SDS-PAGE و دات بلاتینگ انجام شد. نتایج: درستی همسانه‌سازی به وسیله توالی‌یابی تأیید شد. تولید پروتئین نوترکیب با القاء IPTG به میزبان حاوی پلاسمید pET28a-yyxA با موفقیت انجام شد. بهینه‌سازی تولید پروتئین نوترکیب مورد بررسی قرار گرفت. بیشترین مقادیر بیان در دمای 37 درجه سلسیوس و طی زمان 4 ساعت و با IPTG یک میلی‌مولار به‏دست آمد. نتایج حاصل از بررسی‌های فیلوژنتیکی، توالی پروتئینی به دست آمده شباهت زیادی را با توالی‌های سایر باسیلوس‌ها از قبیل B. subtilis، B. gobiensis و B. pumilus نشان دادند. پس از ارزیابی مدل‌های ترسیم شده مشخص گردید که مدل ارائه شده توسط نرم‌افزار PHYRE2 و I-TASSER مدل‌های مطلوبی برای پیش‌بینی ساختار سه بعدی این پروتئاز هستند. نتیجه‌گیری: توالی نوکلئوتیدی ژن yyxA به طول 1212 نوکلئوتید بوده که پروتئینی با 403 آمینواسید را رمز می‌کند. بررسی‌ها نشان داد که آنزیم کد شونده توسط این ژن در دسته آنزیم‌های پایدار قرار گرفته و در باکتری اشریشیاکلای به صورت محلول بیان خواهد شد که این مزایا موجب می‌شود که آنزیم مذکور به عنوان گزینه مناسب برای استفاده در صنعت در نظر گرفته شوند.

https://jab.uk.ac.ir/article_3136_2ecd2bd94734e5dd392d8678bc64cdab.pdf