دانشگاه شهید باهنر کرمان (دانشکده کشاورزی و پژوهشکده فناوری تولیدات گیاهی) و انجمن بیوتکنولوژی جمهوری اسلامی ایران مجله بیوتکنولوژی کشاورزی 2228-6705 14 2 2022 06 22 Assembling of gene sequences encoding epitopic regions of foot and mouth disease virus non-structural proteins using one-step OE-PCR اتصال توالی‌های ژنی کدکننده‌ی نواحی اپی‌توپی پروتئین‌های غیرساختاری ویروس تب برفکی به روش OE-PCR یک مرحله‌ای 85 100 3289 10.22103/jab.2022.16686.1275 FA پروین مقدم گروه علوم سلولی و مولکولی، دانشگاه خوارزمی کرج آزاده زحمت کش بخش تحقیق و تولید واکسن های بی هوازی، موسسه تحقیقات واکسن و سرم سازی رازی، کرج 0000-0001-6960-8557 معصومه باقری موسسه تحقیقات واکسن و سرم سازی رازی، کرج پروانه اسمعیل نژاد اهرنجانی بخش تحقیق و تولید واکسن های باکتریایی بی هوازی، موسسهی تحقیقات واکسن و سرمسازی رازی، سازمان تحقیقات، ترویج و آموزش کشاورزی، کرج، ایران 0000-0001-7397-252X Journal Article 2022 02 14 Objective Foot-and-mouth disease (FMD) is an acute highly contagious viral disease in susceptible cloven-hoofed animals, which causes extensive economic loss in livestock industry. Recently, diagnostic methods have been developed to detect antibodies against non-structural proteins of this virus. Non-structural proteins 3ABC and 3D that provide linear B cells epitopes allow effective detection of virus-infected animals. In this study, immuno-dominant epitopes of 3ABD proteins were considered for the synthesis of a new gene sequence and assembling of 3AB and 3D fragments. Materials and Methods Overlap extension-polymerase chain reaction (OE-PCR) was used to synthesize 3ABD antigenic sequences. Viral RNA was isolate from BHK-infected cells and reverse transcribed. In order to remove 654 nucleotides of the middle 3C genomic sequence, a pair of internal primers with 29 overlapping nucleotides and two external primers were designed. The 3AB and 3D fragments were each amplified in separate PCR reactions and purified from the gel after electrophoresis. These fragments were used as templates in a one-step OE-PCR for the synthesis of 3ABD sequence by external primers and Pfu DNA polymerase. Results The results showed amplification of 3AB (418 bp) and 3D (557 bp) fragments with overlapping sequences at the end of 3' and 5', respectively. The OE-PCR experiment resulted in amplification of multiple fragments, and the 3ABD fragment with the desired length (946 bp) was confirmed after sequencing. Only by considering 29 homologous nucleotides in the design of overlapping primers and a high-fidelity, highly accurate DNA polymerase, two epitopic regions of non-structural proteins of FMD virus (3'-3AB and 5'-3D) were linked together. Conclusions The new gene sequence synthesized by a one-step OE-PCR technique has the antigenic sites of 3ABD non-structural proteins of FMD virus, obviates the need for expensive peptide synthesis, and can be a proper alternative for production of 3ABD recombinant protein for application in detection of FMD by Enzyme Linked Immunosorbent Assay. هدف: تب برفکی یک بیماری بسیار ویرانگر در حیوانات زوج‌سم می‌باشد که خسارات اقتصادی گسترده‌ای در صنعت دامپروری ایجاد می‌کند. اخیراً روش‌های تشخیصی این بیماری برای ردیابی آنتی‌بادی‌های علیه پروتئین‌های غیرساختاری ویروس تب برفکی بسیار توسعه‌یافته‌اند. پروتئین‌های غیرساختاری 3ABC و 3D که ارائه‌دهنده‌ی اپی‌توپ‌های خطی سلول‌های B هستند، تشخیص مؤثر دام‌های آلوده به ویروس را امکان‌پذیر می‌کنند. در این تحقیق، اپی‌توپ‌های خطی ایمنی‌زای غالب از پروتئین‌های 3ABD برای طراحی ساخت توالی ژنی جدید و اتصال قطعات 3AB و 3D در نظر گرفته شد.  مواد و روش‌ها: از تکنیک گسترش نواحی همپوشان به کمک واکنش زنجیره‌ای پلیمراز (OE-PCR) برای سنتز توالی 3ABD آنتی‌ژنی استفاده شد. RNA ویروسی از سلول‌های BHK آلوده به ویروس جداسازی و رونویسی معکوس شد. برای حذف توالی میانی 654 نوکلئوتیدی ژن3C ، یک جفت آغازگر داخلی با 29 نوکلئوتید همپوشان و یک جفت آغازگر خارجی طراحی شدند. قطعات 3AB و 3D هرکدام در واکنش‌های جداگانه‌ی PCR تکثیر شدند و پس از الکتروفورز از ژل تخلیص شدند. این قطعات به عنوان الگو در OE-PCR برای سنتز توالی 3ABD به کمک آغازگرهای خارجی و آنزیم Pfu‌‌پلیمراز در یک واکنش یک مرحله‌ای مورداستفاده قرار گرفتند. نتایج: نتایج این مطالعه نشان داد که هرکدام از قطعات 3AB  (418 جفت باز) و 3D  (557 جفت باز) با توالی‌های همپوشان به‌ترتیب در انتهای '3 و '5 تکثیر شدند. OE-PCR منجر به تکثیر چندین قطعه شد و قطعه‌ی 3ABD با طول موردنظر (946 جفت باز) پس از توالی‌یابی تایید شد. تنها با در نظر گرفتن 29 جفت باز همولوژی در طراحی آغازگرهای همپوشان و یک آنزیم پلیمراز با دقت بالا، دو ناحیه‌ی اپی‌توپی از پروتئین‌های غیرساختاری ویروس تب برفکی (3’-3AB و 5’-3D) به هم متصل شدند. نتیجه‌گیری: توالی ژنی ساخته شده به روش OE-PCR یک مرحله‌ای، علاوه براین که نواحی آنتی‌ژنی پروتئین‌های غیرساختاری 3ABD ویروس تب برفکی را دارا می‌باشد، مشکلات مربوط به هزینه‌ی بالای سنتز پپتید را ندارد و می‌تواند گزینه‌ی مناسبی برای تولید پروتئین نوترکیب و بررسی امکان استفاده در تشخیص بیماری تب برفکی به روش الایزا باشد. https://jab.uk.ac.ir/article_3289_645e6bfdd05d1a69c5e47b20f0a91d46.pdf