دانشگاه شهید باهنر کرمان (دانشکده کشاورزی و پژوهشکده فناوری تولیدات گیاهی) و انجمن بیوتکنولوژی جمهوری اسلامی ایران مجله بیوتکنولوژی کشاورزی 2228-6705 16 1 2024 03 20 Specific expression of exendin-4 gene in carrot root (Daucus carota L.) under regulation of MLL promoter بیان اختصاصی ژن اکسندین-4 متصل به زیرواحد B سم وبا (CTB) در ریشه هویج ( Daucus carota L.) تحت تنظیم راه انداز MLL 87 104 4156 10.22103/jab.2023.21290.1473 FA بهمن بهرام نژاد دانشیار بیوتکنولوژی گیاهی، گروه مهندسی تولید و ژنتیک گیاهی، دانشکده کشاورزی، دانشگاه کردستان، سنندج، ایران 0000-0002-8586-2464 ندا زندی نوا کارشناسی ارشد بیوتکنولوژی گیاهی، گروه مهندسی تولید و ژنتیک گیاهی، دانشکده کشاورزی، دانشگاه کردستان، سنندج، ایران هیمن صالحی دانشجوی دکتری بیوتکنولوژی گیاهی، گروه مهندسی تولید و ژنتیک گیاهی، دانشکده کشاورزی، دانشگاه کردستان، سنندج، ایران 0000-0003-4819-699X Journal Article 2023 10 05 Abstract<br />Objective <br />Exendin-4 (Ex4) is a 39-amino acid peptide isolated from the salivary secretions of the lizard Heloderma susceptum and it has similar biological function as glucan-like peptide (GLP-1) receptor. The most important physiological role of GLP-1 is to regulate the amount of glucose metabolism by reducing the entry of glucose into the cells. Transgenic plants can be used as factories for the production of recombinant proteins. In order to maximize the efficiency of transgenic plants, the expression of foreign genes can be regulated in terms of time and place under the regulation of different promoters. Considering the nutritional value of carrot tuber and its fresh consumption, in this study, CTBEx4 gene was expressed in carrot plant using a root-specific promoter. In this study, in order to specifically express the CTBEx4 gene in carrot root, the Major Latex-Like promoter (MLL) related to the specific expression in sugar beet storage root tissue was replaced by the CaMV35S promoter in the pBI121 construct and were used for the transformation of carrot explants.<br />Materials and methods<br />Using the CTAB method, DNA was extracted from the leaves of the sugar beet plant, then the PCR reaction was performed using specific MLL primers. The obtained fragment was replaced by the CaMV35S promoter in the pBI121 construct using restriction enzymes. Both pBI121-Mll-CTBEx4 and pBI121-CamV35S-CTBEx4 constructs were used to transform carrot leaf explants using Agrobacterium tumefaciens bacteria. Transgenic explants were indirectly regenerated into plants in MS culture media in vitro and then transferred to pot. Finally, the CTBEx4 gene expression of the transgenic plants was analyzed at mRNA and protein levels using RT-PCR and ELISA.<br />Results<br />The results of the expression analysis using RT-PCR and ELISA methods indicated that the expression of CTBEx4 gene in carrot root tissue was regulated by MLL promoter, while no expression was observed in leaf tissue. Also, the results showed that the CTBEx4 gene was expressed under CaMV35S promoter regulation in both root and leaf tissues, but its expression in roots was lower (30%) than that under MLL promoter regulation. The obtained results indicated the ability of the MLL promoter to specific expression the CTBEx4 gene in the roots of carrot plants.<br />Conclusions <br />The MLL promoter was able to express the CTBEx4 gene in the root tissue of carrot plants at the mRNA and protein level, Also, CTBEx4 protein under MLL promoter had higher expression level compared to CaMV35S promoter. هدف: اکسندین-4 (Ex4) یک پپتید 39 اسید آمینه‌ایی است که از ترشحات بزاق مارمولک هلودرما سوسپتوم جدا شده و دارای عملکرد زیستی مشابه با گیرنده شبه‌گلوکان (GLP-1) می‌باشد. مهمترین نقش فیزیولوژیکیGLP-1 تنظیم متابولیسم گلوکز از طریق کاهش ورود گلوکز به سلول‌ها است. اتصال Ex4 به زیر واحد B سم وبا (CTB) باعث افزایش کارایی آن از طریق اتصال به پذیرنده سلول‌های اپیتلیال روده می‌شود. گیاهان تراریخت می‌توانند به‌عنوان کارخانه‌های تولید پروتئین‌های نوترکیب به‌کار روند، برای به حداکثر رساندن کارآیی گیاهان تراریخت می‌توان بیان ژن‌های خارجی را از نظر زمانی و مکانی تحت تنظیم راه‌اندازهای مختلف تنظیم نمود. به‌منظور بیان اختصاصی ژن CTBEx4 در بافت ریشه هویج، راه‌انداز (MLL) Major Latex-Likeمربوط به بیان اختصاصی در ریشه غده‌ایی چغندر قند جایگزین راه‌انداز CaMV35S در سازه pBI121 شد و برای تراریختی ریز‌نمونه‌های گیاه هویج به‌کار گرفته شد.<br />مواد و روش‌ها: با استفاده از روش CTAB از برگ‌های گیاه چغندر قند DNA استخراج شد سپس با استفاده از آغازگرهای اختصاصی راه‌انداز MLL واکنش PCR انجام گرفت. قطعه به‌دست آمده با استفاده از آنزیم‌های برشی جایگزین راه‌انداز CaMV35S در سازه pBI121 شد. از دو سازه pBI121-Mll-CTBEx4 و pBI121-CamV35S-CTBEx4، با استفاده از باکتری Agrobacterium tumefaciens برای تراریخت کردن ریزنمونه‌های هویج استفاده شد. ریز‌نمونه‌های تراریخت شده در محیط کشت MS درون شیشه از طریق باززایی غیرمستقیم به گیاه کامل باززا شدند و سپس به محیط گلدان انتقال یافتند. در نهایت بیان ژن CTBEx4 در گیاهان تراریخت شده در سطح mRNA و پروتئین با استفاده از آزمون‌های RT-PCR و ELISA اندازه‌گیری شد.<br />نتایج: نتایج بررسی بیان ژن با روش‌های RT-PCR و ELISA حاکی از بیان ژن CTBEx4 در بافت ریشه هویج تحت تنظیم راه-انداز MLL بود در حالیکه هیچ بیانی در بافت برگ مشاهده نشد. همچنین نتایج نشان داد که ژن CTBEx4 تحت تنظیم راه‌انداز CaMV35S در هر دو بافت ریشه و برگ بیان شد اما بیان آن در ریشه نسبت به بیان تحت تنظیم راه‌انداز MLL کمتر بود (30%). نتایج به‌دست آمده حاکی از توانایی راه‌انداز MLL برای بیان اختصاصی ژن CTBEx4 در ریشه گیاه هویج بود.<br />نتیجه گیری: راه‌انداز MLL قادر به بیان ژن CTBEx4 در ریشه گیاه هویج در سطح mRNA و پروتئین بود، همچنین پروتئین CTBEx4 تحت تنظیم راه‌انداز MLL در مقایسه با راه‌انداز CaMV35S دارای مقدار بیان بیشتری بود. https://jab.uk.ac.ir/article_4156_bba6bca05fecde04c682328e44b974b7.pdf