دانشگاه شهید باهنر کرمان (دانشکده کشاورزی و پژوهشکده فناوری تولیدات گیاهی) و انجمن بیوتکنولوژی جمهوری اسلامی ایران مجله بیوتکنولوژی کشاورزی 2228-6705 16 4 2024 12 21 Engineering and production of recombinant ricin protein with the aim of producing effective immunotoxin مهندسی و تولید پروتئین ریسین نوترکیب با هدف تولید ایمونوتوکسین موثر 121 138 4666 10.22103/jab.2024.23650.1578 FA عبداله رحمانی گروه بیوتکنولوژی و به نژادی گیاهی ، دانشکده کشاورزی، دانشگاه فردوسی مشهد، مشهد، ایران. سید حسن مرعشی استاد ژنتیک و اصلاح نباتات گروه بیوتکنولوژی کشاورزی دانشگاه فردوسی مشهد 0000-0002-2499-6725 نسرین مشتاقی دانشیار، گروه بیوتکنولوژی و به نژادی گیاهی، دانشکده کشاورزی، دانشگاه فردوسی مشهد، مشهد، ایران. 0000-0003-1095-8450 محمدرضا نصیری استاد، گروه علوم دامی، دانشکده کشاورزی، دانشگاه فردوسی مشهد، مشهد، ایران. 0000-0001-7119-8155 امین میرشمسی کاخکی گروه بیوتکنولوژی و به نژادی گیاهی ، دانشکده کشاورزی، دانشگاه فردوسی مشهد، مشهد، ایران. حمید آریان نژاد گروه علوم دامی، دانشکده کشاورزی، دانشگاه فردوسی مشهد Journal Article 2024 06 29 Aim<br />Ricin is a globular glycoprotein poison found in the endosperm of the castor plant. This protein consists of two A chains with 267 amino acids (32 kilo Daltons) and a B chain with 262 amino acids (34 kilodaltons), connected by a disulfide bond. The sensitivity of cancer cells to ricin is due to the higher expression of glycoproteins on the surface of cancer cells. The toxicity of the ricin enzyme in destroying cells caused this enzyme to be used as the most important candidate in the production of immunotoxins. However, the low ability of ricin to enter the target cell using the Golgi apparatus has caused increased cytotoxicity, which affected its use as an immunotoxin. This research was carried out with the aim of engineering ricin protein to increase the surface charge of the protein and facilitate the entry of ricin into the cell through the endosomal route and reduce the effect of cytotoxicity.<br />Methods <br />Therefore, the structural status of ricin protein with R134A, L214A, R31A, and P250A mutations was investigated using thermodynamic studies. Then, the gene sequence related to the mutant version was synthesized and expressed using the expression vector pET22b(+) in the cell wall of Escherichia coli BL21(DE3). Purification was done using a Ni-NTA column, and then the function of the protein on class A431 cancer epithelial cells was evaluated using a cytotoxicity test. <br />Results <br />The obtained results showed that the considered mutations significantly increased the surface charge of the protein. Also, comparing the analysis of Root Mean Square Deviation (RMSD), root-mean-square fluctuations (RMSF) and Radius of gyration (Rg) graphs between the natural sample and the mutant showed that the mutations have no significant effect on the main structure of the protein. Confirmation of the production and purification of recombinant ricin protein in the cell wall with a molecular weight of about 33 kilodaltons was done using SDS-PAGE gel. Cytotoxicity results showed that mutant ricin protein can cause cell death of A431 cancer cells at a concentration of 300 ng/ml. <br />Conclusion <br />In silico and In vitro results on ricin protein showed that creating targeted mutations to increase protein surface charge can improve protein performance. Therefore, mutant ricin protein (R134A, L214A, P250A, and R31A) with greater cell penetration and less toxicity for target cells has a high ability to be used as a toxin in the production of immunotoxins. متابولیت ریسین یک گلیکوپروتئین سمی است که در آندوسپرم گیاه کرچک یافت می‌شود. این پروتیین شامل دو زنجیره A با 267آمینواسید (32کیلودالتون) و زنجیرهB با 262آمینو اسید (34کیلودالتون) می‌باشد که بوسیله پیوند دی سولفیدی به هم متصل هستند. حساسیت سلول‌های سرطانی به ریسین به دلیل بیان بیشتر گلیکوپروتئین‌های موجود در سطح سلول‌های سرطانی است. سمیت آنزیم ریسین در از بین بردن سلول‌ها سبب شد که این آنزیم به عنوان مهمترین انتخاب در تولید ایمونوتوکسین‌ها بکار گرفته شود. با این‌حال، توانایی پایین ریسین در ورود به سلول هدف با استفاده از مسیر دستگاه گلژی، سبب بالا رفتن سمیت سلولی شده، که این نقص، استفاده از آن را در ایمونوتوکسین‌ها تحت تأثیر قرار داده است. این پژوهش با هدف مهندسی پروتئین ریسین به منظور افزایش بارالکتریکی سطحی پروتئین و تسهیل ورود ریسین به داخل سلول از طریق مسیر اندوزومیک و کاهش اثر سمیت سلولی صورت پذیرفت. <br />مواد و روش‌ها: وضعیت ساختاری پروتئین ریسین با ایجاد جهش‌های R134A، L214A، R31A ، P250A و در مقایسه با نمونه طبیعی این آنزیم با استفاده از مطالعات ترمودینامیکی مورد بررسی قرار گرفت. سپس توالی ژنی مربوط به نسخه جهش‌یافته، سنتز و با استفاده از وکتور بیانی pET22b(+) در فضای پیروپلاسمی سلولی باکتری اشریشیاکلی BL21(DE3) بیان شد. خالص‌سازی با استفاده از ستون Ni-NTA انجام و سپس عملکرد پروتئین بر رده سلول‌‌های سرطانی پوست A431 با استفاده از آزمون سمیت سلولی مورد بررسی قرار گرفت. <br />نتایج: جهش‌های ایجاد شده به شکل چشمگیری سبب افزایش بارالکتریکی سطحی پروتئین شده است. مقایسه آنالیز نمودارهای RMSD (انحراف جذر میانگین مربعات)، RMSF (نوسانات جذر میانگین مربعات) و Rg (شعاع ژیراسیون) بین نمونه طبیعی و موتانت مشخص کرد که جهش‌ها هیچ تأثیر معنی‌داری بر ساختار اصلی پروتئین ندارد. تأیید تولید و خالص سازی پروتئین نوترکیب ریسین در دیواره سلولی با وزن مولکولی حدود 33 کیلودالتون با استفاده از ژل SDS-PAGE انجام شد. این فرم نوترکیب نسبت به فرم طبیعی از وزن مولکولی کمتری برخوردار است. نتایج سمیت سلولی نشان داد که پروتئین ریسین موتانت قادر است در غلظت ng/mL 300 سبب مرگ سلولی سلول‌های سرطانی A431 گردد.<br />نتیجه‌گیری: نتایج In silico و In vitro بدست آمده در این مطالعه بر روی پروتئین ریسین نشان داد که ایجاد جهش‌های هدفمند به منظور افزایش بارالکتریکی سطحی پروتئین‌ می‌تواند به شکل مؤثری سبب بهبود عملکرد پروتئین گردد. از این‌رو، پروتئین ریسین موتانت (R134A، L214A، P250A وR31A) با قابلیت ورود سلولی بیشتر و سمیت کمتر برای سلول‌ها‌ی هدف، قابلیت خوبی به عنوان توکسین در تولید ایمونوتوکسین‌ها دارد. https://jab.uk.ac.ir/article_4666_9f9e8cba3700df6a947a8cf91035ab84.pdf