دانشگاه شهید باهنر کرمان (دانشکده کشاورزی و پژوهشکده فناوری تولیدات گیاهی) و انجمن بیوتکنولوژی جمهوری اسلامی ایران مجله بیوتکنولوژی کشاورزی 2228-6705 17 1 2025 03 21 Molecular cloning of human basic fibroblast growth factor gene (hbFgf) and in silico analysis of physico-chemical characteristics of bFGF protein همسانه‌سازی مولکولی ژن رمزگردان فاکتور رشد فیبروبلاستی بازی انسانی (hbFgf) و بررسی ویژگی‌های فیزیکو- شیمیایی پروتئین hbFGF در شرایط in silico 1 26 4731 10.22103/jab.2024.21823.1491 FA حجت طاهری عزیزآبادی گروه مهندسی بیوتکنولوژی، دانشکده کشاورزی و منابع طبیعی، دانشگاه بین‌المللی امام خمینی (ره)، قزوین، ایران رامین حسینی گروه مهندسی بیوتکنولوژی، دانشکده کشاورزی و منابع طبیعی، دانشگاه بین‌المللی امام خمینی (ره)، قزوین، ایران Journal Article 2023 07 04 Objective This study aimed to clone the human basic fibroblast growth factor (hbFGF) gene into the pCAMBIA1304 binary vector for recombinant bFGF protein production in plant expression systems. Materials and Methods The full-length open reading frame (ORF) encoding the hbFGF gene was inserted into the pCAMBIA1304 binary vector and subsequently cloned into Escherichia coli strain DH5α. The recombinant expression vector, designated pCAMBIA-hbFGF, was then introduced into competent Agrobacterium tumefaciens strains EHA105, GV3101, and LBA4404. Results The hbFGF gene, comprising 561 nucleotides, encoded a protein of 155 amino acid residues. The calculated molecular mass and predicted isoelectric point (pI) of the deduced polypeptide sequence were 17.25 kDa and 9.58, respectively. The instability index, aliphatic index, and hydrophobicity index of the bFGF protein were calculated as 36.60, 68.00, and -0.511, respectively, indicating high stability and a hydrophilic nature. Analysis using ProtScale and TMHMM programs confirmed the hydrophilic properties of bFGF and the absence of transmembrane domains. Additionally, the MotifScan program identified a conserved fibroblast growth factor (FGF) family domain in the hbFGF sequence, while no potential N-glycosylation sites were detected. The predicted secondary structure of the mRNA sequence, calculated using the RNAfold program, exhibited a minimum free energy of approximately -136.90 kcal/mol, indicating relatively high stability with low entropy. The simulated three-dimensional structure of the hbFGF protein revealed a pyramidal arrangement of 10 non-parallel β-sheets. Ramachandran plot analysis confirmed that 86.3% of the amino acid residues were organized in regular structures, primarily non-parallel β-sheets, with only two residues (Thr8 and Gly24) exhibiting unusual ϕ and ψ angles. Phylogenetic analysis demonstrated a high degree of similarity with Pan troglodytes, Pongo abelii, and Camelus dromedarius, showing 100%, 100%, and 98.71% sequence similarity, respectively. Conclusions The bFGF protein was identified as a stable, hydrophilic protein without potential N-glycosylation sites. These characteristics suggest that the bFGF protein may be successfully produced heterologously in plant expression systems for potential commercialization. هدف: هدف از این پژوهش، همسانه‌سازی ژن bFgf انسانی (hbFgf) درون ناقل بیانی pCAMBIA1304 جهت بیان پروتئین نوترکیب bFGF در میزبان‌های گیاهی بود. مواد و روش‌ها: توالی ORF رمزگردان ژن hbFgf درون ناقل بیانی pCAMBIA1304 درج و درون باکتری Escherichia coli سویه DH5α همسانه‌سازی شد. ناقل بیانی نوترکیب pCAMBIA-hbFGF سپس به درون سلول‌های مستعد Agrobacterium tumefaciens (EHA105، GV3101 و LBA4404) منتقل شد. نتایج: ژن hbFgf به طول bp 468، پروتئینی با 155 اسیدآمینه را رمز می‌کند که دارای وزن مولکولی و نقطه ایزوالکتریک به ترتیب برابر با kDa 25/17 و 58/9 است. شاخص‌های ناپایداری، آلیفاتیک و آب‌گریزی پروتئین hbFGF به ترتیب حدوداً 60/36، 00/68 و 511/0- محاسبه شد که نشان‌دهنده پایداری بالا و وضعیت آب‌دوستی آن است. به علاوه، بررسی‌ها با استفاده از برنامه‌های ProtScale و TMHMM تأیید کرد که پروتئین hbFGF آب‌دوست بوده و فاقد هر گونه دامنه‌های ترنس‌ممبران است. همچنین، برنامه MotifScan یک دامنه ویژه خانواده فاکتور رشد فیبروبلاستی (FGF) را در توالی اسیدآمینه‌ای hbFGF شناسایی کرد و در حالی که جایگاه بالقوه جهت N-گلیکوزیلاسیون در توالی اسیدآمینه‌ای hbFGF شناسایی نشد. حداقل انرژی آزاد محاسبه شده ساختار دوم توالی mRNA با استفاده از نرم‌افزار RNAfold برابر kcal/mol 90/136- محاسبه شد که نشان‌دهنده پایداری نسبتاً بالای ساختار دوم توالی mRNA با سطح آنتروپی پایین است. علاوه بر این، شبیه‌سازی ساختار سه‌بعدی پروتئین hbFGF نشان داد که پروتئین hbFGF شامل 10 صفحه β غیرموازی است که در یک ساختار هرمی سازماندهی شده است. رسم نمودار راماچاندران نیز نشان داد که پروتئین hbFGF عمدتاً از صفحات β غیرموازی تشکیل شده است. حدود %3/86 از اسیدهای آمینه در ساختارهای منظم شامل صفحات β غیرموازی سازمان‌دهی شده و تنها دو اسیدآمینه Thr8 و Gly24 با زوایای φ و ψ غیرمعمول در پیکربندی پروتئین hbFGF شناسایی شدند. بررسی میزان شباهت hbFGF با سایر توالی‌های bFGF، درجه بالایی از شباهت را با Pan troglodytes، Pongo abelii و Camelus dromedaries به ترتیب با %100، %100 و %71/98 شباهت نشان داد. نتیجه‌گیری: پروتئین bFGF یک پروتئین پایدار و فاقد جایگاه بالقوه N-گلیکوزیلاسیون است که ممکن است به شکل نوترکیب درون سیستم‌های بیانی گیاهی در سطح تجاری تولید شود.

https://jab.uk.ac.ir/article_4731_7f48e8523781984baa4faeabb1887c99.pdf