دانشگاه شهید باهنر کرمان (دانشکده کشاورزی و پژوهشکده فناوری تولیدات گیاهی) و انجمن بیوتکنولوژی جمهوری اسلامی ایران مجله بیوتکنولوژی کشاورزی 2228-6705 17 1 2025 03 21 Cloning and Expression of Serratiopeptidase protein and assessment of its activity for clot lysis شبیه سازی و بیان پروتئین سراتیوپپتیداز و ارزیابی فعالیت آن برای لیز لخته 271 284 4744 10.22103/jab.2025.24708.1649 FA ندا الفهداوی گروه زیست شناسی، دانشکده آموزش علوم محض، دانشگاه انبار، رمادی، انبار، عراق حارث بونیه گروه زیست شناسی، دانشکده آموزش علوم محض، دانشگاه انبار، رمادی، انبار، عراق 0000-0002-5232-618X Journal Article 2025 01 21 Objective<br />Cardiovascular diseases (CVDs) remain a leading cause of morbidity and mortality worldwide, with blood thrombosis playing a critical role in conditions such as myocardial infarction and stroke. Thrombolytic agents, including tissue plasminogen activators and streptokinase, are commonly used to dissolve blood clots and restore normal blood flow. However, these agents have several limitations, including high cost, short half-life, immune responses, and potential hemorrhagic complications, which restrict their widespread clinical use. Serratiopeptidase, a zinc-dependent metalloprotease produced by Serratia marcescens, has gained attention for its fibrinolytic, anti-inflammatory, and analgesic properties. This enzyme has demonstrated effective fibrin clot degradation with minimal side effects, making it a promising candidate for thrombolytic therapy. Additionally, its ability to bind to alpha-2-macroglobulin may help mask its antigenicity, potentially reducing immune-related adverse reactions. Despite these advantages, large-scale recombinant production of Serratiopeptidase is necessary to enhance its availability and therapeutic applications. In this study, we aimed to clone and express the Serratiopeptidase (STP) gene in Escherichia coli BL21(DE3) and evaluate the thrombolytic activity of the recombinant protein. Using molecular cloning techniques, followed by protein expression, purification, and fibrinolytic assays, we assessed the efficacy of recombinant Serratiopeptidase in clot degradation.<br />Materials and Methods<br />The STP gene was isolated from a pathogenic Serratia marcescens strain. The gene was digested with EcoR1, ligated into the expression vector pGEM®-3Zf, and transformed into E. coli BL21(DE3). Expression was induced using isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG). The recombinant STP protein was analyzed via sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). The fibrinolytic activity of the expressed Serratiopeptidase protein was assessed using blood clot lysis assays.<br />Results<br />The PCR product of the STP gene, approximately 1500 bp in size, was confirmed via agarose gel electrophoresis and sequencing. Successful cloning in E. coli was verified using 12% SDS-PAGE, which showed a protein band corresponding to the expected molecular weight of 52 kDa. Functional analysis demonstrated that the recombinant Serratiopeptidase effectively lysed human blood clots, showing complete clot degradation compared to the control.<br />Conclusion<br />Our findings indicate that recombinant Serratiopeptidase exhibits significant thrombolytic activity, effectively dissolving human blood clots. These results suggest that Serratiopeptidase could serve as a promising alternative to existing thrombolytic agents. Further studies are needed to optimize its production, assess its stability and safety, and explore its clinical applications for cardiovascular disease management. هدف: بیماری‌های قلبی عروقی (CVDs) همچنان یکی از علل اصلی مرگ و میر در سراسر جهان هستند و ترومبوز خون نقش مهمی در شرایطی مانند انفارکتوس میوکارد و سکته دارد. عوامل ترومبولیتیک، از جمله فعال کننده‌های پلاسمینوژن بافتی و استرپتوکیناز، معمولاً برای حل کردن لخته‌های خون و بازگرداندن جریان خون طبیعی استفاده می‌شوند. با این حال، این عوامل دارای چندین محدودیت هستند، از جمله هزینه بالا، نیمه عمر کوتاه، پاسخ‌های ایمنی، و عوارض خونریزی دهنده بالقوه، که استفاده گسترده بالینی آنها را محدود می‌کند. این آنزیم تخریب موثر لخته فیبرین را با حداقل عوارض جانبی نشان داده است و آن را به یک کاندید امیدوارکننده برای درمان ترومبولیتیک تبدیل کرده است. با وجود این مزایا، تولید نوترکیب در مقیاس بزرگ Serratiopeptidase برای افزایش در دسترس بودن و کاربردهای درمانی آن ضروری است. در این مطالعه، هدف شبیه سازی و بیان ژن Serratiopeptidase (STP) در Escherichia coli BL21 (DE3) و ارزیابی فعالیت ترومبولیتیک پروتئین نوترکیب بود. همچنین با استفاده از تکنیک‌های شبیه‌سازی مولکولی، و به دنبال آن بیان پروتئین، خالص‌سازی و سنجش‌های فیبرینولیتیک، کارآیی Serratiopeptidase نوترکیب در تخریب لخته ارزیابی شد. <br />مواد و روش‌ها: ژن STP از سویه بیماری‌زای Serratia marcescens جدا شد. ژن با EcoR1 هضم شد، به ناقل بیان pGEM®-3Zf متصل و به E. coli BL21 (DE3) تبدیل شد. بیان با استفاده از ایزوپروپیل β-D-1-تیوگالاکتوپیرانوسید (IPTG) القا شد. پروتئین نوترکیب STP از طریق الکتروفورز ژل سدیم دودسیل سولفات-پلی آکریل آمید (SDS-PAGE) آنالیز شد. فعالیت فیبرینولیتیک پروتئین Serratiopeptidase بیان شده با استفاده از روش لیز لخته خون ارزیابی شد.<br />نتایج: محصول PCR ژن STP با اندازه تقریبی 1500 جفت باز از طریق الکتروفورز ژل آگارز و تعیین توالی تایید شد. شبیه‌سازی موفقیت‌آمیز در E. coli با استفاده از SDS-PAGEدوازده درصد تأیید شد که یک نوار پروتئینی مربوط به وزن مولکولی مورد انتظار 52 کیلو دالتون را نشان داد. تجزیه و تحلیل عملکردی نشان داد که Serratiopeptidase نوترکیب به طور موثر لخته های خون انسان را لیز می‌کند و تخریب کامل لخته را در مقایسه با شاهد نشان می‌دهد.<br />نتیجه‌گیری: یافته‌های این پژوهش نشان می‌دهد که Serratiopeptidase نوترکیب فعالیت ترومبولیتیک قابل‌توجهی را نشان می‌دهد و به طور موثر لخته‌های خون انسان را حل می‌کند. این نتایج نشان می دهد که Serratiopeptidase می‌تواند به عنوان یک جایگزین امیدوار کننده برای عوامل ترومبولیتیک موجود باشد. مطالعات بیشتری برای بهینه سازی تولید آن، ارزیابی پایداری و ایمنی آن، و کشف کاربردهای بالینی آن برای مدیریت بیماری‌های قلبی عروقی مورد نیاز است. https://jab.uk.ac.ir/article_4744_42778ef0b5805a96f9511e20b5611fce.pdf