دانشگاه شهید باهنر کرمان (دانشکده کشاورزی و پژوهشکده فناوری تولیدات گیاهی) و انجمن بیوتکنولوژی جمهوری اسلامی ایران مجله بیوتکنولوژی کشاورزی 2228-6705 17 2 2025 04 21 Identification and validation of simple sequence repeats (SSRs) Markers for Androctonus crassicauda scorpion using RNA-Seq data شناسایی و اعتبارسنجی نشانگرهای توالی ساده تکراری (SSRs) عقرب آندراکتونوس کراسیکودا (Androctonus crassicauda) با استفاده از داده‏های RNA seq 31 54 4817 10.22103/jab.2025.24286.1625 FA روشن کاکی دانشجوی دکتری ژنتیک و اصلاح نژاد دام، گروه علوم دامی –دانشکده علوم دامی و صنایع غذایی -دانشگاه علوم کشاورزی و منابع طبیعی خوزستان-ملاثانی-ایران محمود نظری دانشیار گروه علوم دامی ، ;دانشکده علوم دامی و صنایع غذایی -دانشگاه علوم کشاورزی و منابع طبیعی خوزستان-ملاثانی-ایران هدایت الله روشنفکر گروه علوم دامی –دانشکده علوم دامی و صنایع غذایی -دانشگاه علوم کشاورزی و منابع طبیعی خوزستان 0009-0008-6988-7240 فاطمه ثعلبی استادیار سازمان تحقیقات آموزش و ترویج کشاورزی، مؤسسه تحقیقات واکسن و سرم‌سازی رازی شعبه اهواز، گروه جانوران سمی و تولید پادزهر، Journal Article 2024 11 03 Objective<br />Simple sequence repeats (SSRs) markers or microsatellites are one of the best and most complete molecular tools in the study of genetic diversity due to the appropriate genomic coverage and high repeatability. Simple sequence repeats markers for the scorpion Andractonus crassicouda have not been reported so far. Therefore, this study was conducted with the aim of identifying and validating simple repeat sequence markers of the scorpion Andractonus crassicouda using RNA-Seq data.<br />Materials and methods<br />The samples were evaluated qualitatively and quantitatively after RNA extraction from the scorpion venom gland. Then the samples were sequenced with the Illumina HiSeq 2000 platform. Reconstruction of transcripts was done by De novo assembly method using Trinity software. Next, in order to identify new SSR markers, the transcriptome of the scorpion Andrachtonus crassicouda was analyzed using FullSSR software (version 1.5). To validate the identified SSR markers, 8 pairs of primers were designed by PRIMER 3 software and evaluated by polymerase chain reaction method on 60 DNA samples extracted from scorpion tissue.<br />Results<br />Assembling transcripts by the Trinity program generated a total of 744,804 transcripts and 563,526 unigenes. In this study, the examination of 952,725 sequences by FullSSR software led to the identification of 315,395 SSR markers. Among SSRs, two and three nucleotide repeats accounted for the highest number of repetitions with 71.85% and 22.36%, respectively. Among the 8 studied loci, only 2 loci showed polymorphism. The expected and observed heterozygosity for the RK1354 locus was calculated as 0.765 and 0.683 respectively, and for the NK1362 locus as 0.768 and 0.633 respectively. The fixation index statistic (Fis) for both loci was almost 0.1, which indicates low inbreeding in the population. In addition, the chi-square test showed that the population was not in Hardy-Weinberg equilibrium for both loci.<br />Conclusions<br />The different criteria of genetic diversity all indicate that the population is highly diverse, but some factors reduce the diversity among the studied population. This means that the population is out of balance and the number of observed heterozygotes is less than the expected heterozygotes. It is necessary to investigate the factors that have led to the reduction of diversity to prevent its further reduction. In general, the results of this research showed that new SSRs can be useful for understanding the population structure and investigating the genetic diversity of the scorpion Andractonus crassicouda. هدف: نشانگرهای توالی ساده تکراری (SSR) یا ریزماهواره ها به دلیل پوشش مناسب ژنومی و تکرارپذیری بالا یکی از بهترین و کاملترین ابزارهای مولکولی در بررسی تنوع ژنتیکی به شمار می‏آیند. نشانگرهای توالی ساده تکراری برای عقرب آندراکتونوس کراسیکودا تاکنون گزارش نشده اند. لذا این مطالعه با هدف شناسایی و اعتبار سنجی نشانگرهای توالی ساده تکراری مربوط به عقرب اندراکتونوس کراسیکودا با استفاده از داده‌های RNA-Seq انجام شد.<br />مواد و روش ها: پس از استخراج RNA از غده زهر عقرب، ارزیابی کیفی و کمی انجام گرفت. سپس نمونه ها با پلتفورم Illumina HiSeq 2000 توالی‏یابی شدند. برای ویرایش داده‏های خام و رسیدن به دقت و صحت بالاتر از نرم‏افزارTrimmomatic )نسخه 0.36 ( استفاده شد. بازسازی رونوشت‏ها به روش De novo با استفاده از نرم افزار Trinity انجام شد. در ادامه به منظور شناسایی نشانگرهای SSR جدید، ترانسکریپتوم عقرب آندراکتونوس کراسیکودا با استفاده از نرم افزار FullSSR (نسخه 1.5) مورد انالیز قرار گرفت. به منظور اعتبارسنجی نشانگرهای SSR شناسایی شده، 8 جفت پرایمر توسط نرم افزار PRIMER 3 طراحی و با روش واکنش زنجیره‏ای پلیمراز بر روی 60 نمونه DNA استخراج شده از بافت عقرب مورد ارزیابی قرار گرفت. <br />نتایج: سرهم‌بندی رونوشت‌ها توسط برنامه Trinity، در مجموع 744804 ترانسکریپت و 563526 یونی ژن ایجاد کرد. در این مطالعه، بررسی 952725توالی به وسیله نرم‌افزار FullSSR ، منجر به شناسایی تعداد 315395 نشانگر SSR شد. در میان SSRها، تکرارهای دو و سه نوکلئوتیدی به ترتیب با 85/71 درصد و 36/22 درصد بیشترین تعداد تکرار را به خود اختصاص دادند. از 8 جایگاه مورد بررسی 2 جایگاه چندشکلی را نشان داد. هتروزیگوسیتی مورد انتظار و مشاهده شده برای جایگاه RK1354 به ترتیب 765/0 و 683/0 و همچنین برای جایگاه NK1362 به ترتیب 768/0 و 633/0 محاسبه شد. آماره شاخص تثثبیت (Fis) برای هر دو جایگاه تقریبا 1/0 بود که نشاندهنده همخونی کم در جمعیت است. بعلاوه، آزمون کای مربع نشان داد که جمعیت برای هر دو جایگاه در تعادل هاردی-‏وینبرگ قرار ندارد. <br />نتیجه گیری: نتایج ارزیابی معیار‌های مختلف تنوع ژنتیکی همگی گویای این است که جمعیت از تنوع بالایی برخوردار است اما عواملی در حال کاهش تنوع در بین جمعیت مورد مطالعه هستند. به طوری که جمعیت از تعادل خارج شده است و تعداد هتروزیگوت های مشاهده شده کمتر از هتروزیگوت های مورد انتظار شده است. https://jab.uk.ac.ir/article_4817_25c5b3f16cd2202608ea68013a385566.pdf