دانشگاه شهید باهنر کرمان (دانشکده کشاورزی و پژوهشکده فناوری تولیدات گیاهی) و انجمن بیوتکنولوژی جمهوری اسلامی ایران مجله بیوتکنولوژی کشاورزی 2228-6705 18 2 2026 05 22 Design, Construction, and Delivery of an sgRNA Expression Cassette for Targeted Mutagenesis of α-1,3-fucosyltransferase Gene in Lemna minor Using the CRISPR/Cas9 System طراحی، ساخت و انتقال سازه بیانی واجد sgRNA به منظور ایجاد جهش هدفمند در ژن (1،3)-α فوکوزیل ترانسفراز در گیاه عدسک آبی با استفاده سیستم کریسپر 135 156 5374 10.22103/jab.2026.25565.1733 FA صادق شجاعی باغینی دانشجو دکتری بیوتکنولوژی کشاورزی، پژوهشکده بیوتکنولوژی کشاورزی، گروه زیست فرآورده‌های گیاهی، پژوهشگاه ملی مهندسی ژنتیک و زیست علی هاتف سلمانیان استاد، پژوهشکده بیوتکنولوژی کشاورزی، گروه زیست فرآورده‌های گیاهی، پژوهشگاه ملی مهندسی ژنتیک و زیست فناوری، تهران، ایران الهام تقی پور دانشجو دکتری بیوتکنولوژی کشاورزی، پژوهشکده بیوتکنولوژی کشاورزی، گروه زیست فرآورده‌های گیاهی، پژوهشگاه ملی مهندسی ژنتیک و زیست نیما راد دانشجو دکتری بیوتکنولوژی کشاورزی، پژوهشکده بیوتکنولوژی کشاورزی، گروه زیست فرآورده‌های گیاهی، پژوهشگاه ملی مهندسی ژنتیک و زیست 0009-0000-6098-3799 کسری اصفهانی استادیار، پژوهشکده بیوتکنولوژی کشاورزی، گروه زیست فرآورده‌های گیاهی، پژوهشگاه ملی مهندسی ژنتیک و زیست فناوری، تهران، ایران 0000-0003-3079-7009 Journal Article 2025 07 15 Objective<br />Lemna minor has attracted attention as a promising plant platform for the production of recombinant human proteins due to its rapid growth, simple morphology and easy cultivation. However, the inherent differences in N-glycosylation pathways between plants and humans, particularly the presence of plant-specific sugar residues such as α-(1,3)-fucose, pose a major limitation to the commercial use of this system for the production of human recombinant proteins. In this study, to eliminate this plant-specific sugar, the gene encoding the α-(1,3)-fucosyltransferase (FucT) in L. minor was targeted for knock out using the CRISPR/Cas9 genome editing system. <br />Materials and methods<br />To induce targeted mutations in the FucT gene in L. minor, the sequence of the target gene was retrieved from databases and validated in Iranian native L. minor using PCR and sequencing. The sgRNA was designed using bioinformatics tools and synthesized as complementary forward and reverse oligonucleotides. After annealing and formation of the double-stranded structure, the sgRNA was cloned into the pRGEB32 plasmid. The recombinant construct was transferred into Agrobacterium tumefaciens. Transgenic L. minor lines were generated by Agrobacterium-mediated transformation. The successful transfer of the construct and the induction of mutations at the target site in the FucT gene were confirmed by PCR amplification and validated by DNA sequencing analysis.<br />Results<br />Putative transgenic lines of L. minor were successfully regenerated 6 to 8 weeks after transformation mediated by A. tumefaciens. Sequence analysis of the edited target regions in the genetically modified plants was analyzed by PCR amplification, Sanger sequencing and bioinformatic tools to detect and characterize nucleotide insertions and deletions (INDELs). Analysis of the sequence chromatograms showed that biallelic and chimeric mutations were induced in some of the plants.<br />Conclusions<br />The CRISPR/Cas9 system induced mutations in the FucT gene of L. minor. The edited lines showed no obvious phenotype. Although genomic mutations at the target site were confirmed by sequencing, conclusive proof of complete knockout of the FucT gene and changes in the glycosylation pattern requires further analyses at the protein and glycan levels in future studies. هدف: گیاه عدسک آبی (Lemna minor) به‌دلیل رشد سریع، ساختار ساده و قابلیت کشت آسان، به‌عنوان یک میزبان گیاهی نوظهور برای تولید پروتئین‌های نوترکیب انسانی مورد توجه قرار گرفته است. با این حال، تفاوت‌های موجود در مسیر-N گلیکوزیلاسیون بین گیاهان و انسان، به‌ویژه حضور قندهای گیاهی مانند (1،3)- αفوکوز، محدودیتی اساسی در کاربرد این سیستم برای تولید تجاری پروتئین‌های نوترکیب انسانی در کشاورزی مولکولی ایجاد می‌کند. در این پژوهش، به‌منظور حذف این قند گیاهی، ژن رمز کننده آنزیم (1،3)-α فوکوزیل ترانسفراز (FucT) در گیاه L. minor با استفاده از سامانه ویرایش ژنومی CRISPR/Cas9 هدف قرار گرفت. <br />مواد و روش: به‌منظور ایجاد جهش هدفمند در ژن FucTدر گیاه L. minor ابتدا توالی ژن هدف از پایگاه‌های داده استخراج و با استفاده از PCR و توالی‌یابی، ناحیه مورد نظر در L. minor بومی ایران شناسایی و تأیید شد. سپس sgRNA با کمک ابزارهای بیوانفورماتیکی طراحی و به صورت الیگونوکلئوتیدهای پیشرو و معکوس مکمل سنتز شد. الیگونوکلئوتیدهای پیش ساز پس از واکنش اتصال و تشکیل سختار دو رشته ای در پلاسمید pRGEB32 همسانه‌سازی و سازه نوترکیب ابتدا به باکتری E. Coli و سپس به Agrobacterium tumefaciens منتقل شد. تراریختی گیاه عدسک آبی با استفاده از آگروباکتریوم انجام گرفت. در نهایت، تأیید انتقال سازه و آنالیز جهش‌های ایجاد شده در ناحیه هدف ژن FucT از طریق PCR و تعیین توالی انجام شد.<br />نتایج: فرآیند باززایی لاین‌های احتمالی تراریخت عدسک آبی، ۶ تا ۸ هفته پس از انتقال ژن به‌واسطه‌ی A. tumefaciens با موفقیت انجام شد. تجزیه‌ و تحلیل توالی ناحیه هدف ویرایش در گیاهان دست‌ورزی شده ژنتیکی، با استفاده ازPCR ، توالی‌یابی و انجام آنالیزهای بیوانفورماتیکی، وقوع انواع جهش‌های حذف و درج نوکلئوتیدی (INDELs) را در ژنFucT تأیید کرد. آنالیزهای دقیق کروماتوگرام‌ها نشان داد که سامانه CRISPR/Cas9 موجب القای جهش‌های دوآللی (biallelic) و کایمریک در برخی از گیاهان شده است. <br />نتیجه گیری: نتایج این پژوهش نشان داد که سیستم CRISPR/Cas9 توانسته است در محل مورد نظر از ژن FucT گیاه عدسک آبی، جهش‌ ایجاد کند. لاین‌های ویرایش شده فنوتیپ بارزی را از خود نشان ندادند .اگرچه وقوع جهش‌های ژنومی در ناحیه هدف با توالی‌یابی تأیید گردید، اما اثبات قطعی خاموشی کامل ژنFucT و تغییر در الگوی گلیکوزیلاسیون، مستلزم آنالیزهای تکمیلی در سطح پروتئین و گلیکان در مطالعات آینده است. https://jab.uk.ac.ir/article_5374_ba1ebacb6702657a242897dcca60f9a7.pdf