همسانه‌سازی مولکولی ژن رمزگردان فاکتور رشد فیبروبلاستی بازی انسانی (hbFgf) و بررسی ویژگی‌های فیزیکو- شیمیایی پروتئین hbFGF در شرایط in silico

نوع مقاله : مقاله پژوهشی

نویسندگان

گروه مهندسی بیوتکنولوژی، دانشکده کشاورزی و منابع طبیعی، دانشگاه بین‌المللی امام خمینی (ره)، قزوین، ایران

چکیده

هدف: هدف از این پژوهش، همسانه‌سازی ژن bFgf انسانی (hbFgf) درون ناقل بیانی pCAMBIA1304 جهت بیان پروتئین نوترکیب bFGF در میزبان‌های گیاهی بود.
مواد و روش‌ها: توالی ORF رمزگردان ژن hbFgf درون ناقل بیانی pCAMBIA1304 درج و درون باکتری Escherichia coli سویه DH5α همسانه‌سازی شد. ناقل بیانی نوترکیب pCAMBIA-hbFGF سپس به درون سلول‌های مستعد Agrobacterium tumefaciens (EHA105، GV3101 و LBA4404) منتقل شد.
نتایج: ژن hbFgf به طول bp 468، پروتئینی با 155 اسیدآمینه را رمز می‌کند که دارای وزن مولکولی و نقطه ایزوالکتریک به ترتیب برابر با kDa 25/17 و 58/9 است. شاخص‌های ناپایداری، آلیفاتیک و آب‌گریزی پروتئین hbFGF به ترتیب حدوداً 60/36، 00/68 و 511/0- محاسبه شد که نشان‌دهنده پایداری بالا و وضعیت آب‌دوستی آن است. به علاوه، بررسی‌ها با استفاده از برنامه‌های ProtScale و TMHMM تأیید کرد که پروتئین hbFGF آب‌دوست بوده و فاقد هر گونه دامنه‌های ترنس‌ممبران است. همچنین، برنامه MotifScan یک دامنه ویژه خانواده فاکتور رشد فیبروبلاستی (FGF) را در توالی اسیدآمینه‌ای hbFGF شناسایی کرد و در حالی که جایگاه بالقوه جهت N-گلیکوزیلاسیون در توالی اسیدآمینه‌ای hbFGF شناسایی نشد. حداقل انرژی آزاد محاسبه شده ساختار دوم توالی mRNA با استفاده از نرم‌افزار RNAfold برابر kcal/mol 90/136- محاسبه شد که نشان‌دهنده پایداری نسبتاً بالای ساختار دوم توالی mRNA با سطح آنتروپی پایین است. علاوه بر این، شبیه‌سازی ساختار سه‌بعدی پروتئین hbFGF نشان داد که پروتئین hbFGF شامل 10 صفحه β غیرموازی است که در یک ساختار هرمی سازماندهی شده است. رسم نمودار راماچاندران نیز نشان داد که پروتئین hbFGF عمدتاً از صفحات β غیرموازی تشکیل شده است. حدود %3/86 از اسیدهای آمینه در ساختارهای منظم شامل صفحات β غیرموازی سازمان‌دهی شده و تنها دو اسیدآمینه Thr8 و Gly24 با زوایای φ و ψ غیرمعمول در پیکربندی پروتئین hbFGF شناسایی شدند. بررسی میزان شباهت hbFGF با سایر توالی‌های bFGF، درجه بالایی از شباهت را با Pan troglodytes، Pongo abelii و Camelus dromedaries به ترتیب با %100، %100 و %71/98 شباهت نشان داد.
نتیجه‌گیری: پروتئین bFGF یک پروتئین پایدار و فاقد جایگاه بالقوه N-گلیکوزیلاسیون است که ممکن است به شکل نوترکیب درون سیستم‌های بیانی گیاهی در سطح تجاری تولید شود.

کلیدواژه‌ها

عنوان مقاله [English]

Molecular cloning of human basic fibroblast growth factor gene (hbFgf) and in silico analysis of physico-chemical characteristics of bFGF protein

نویسندگان [English]

  • Hojat Taheri Azizabadi
  • Ramin Hosseini
Department of Biotechnology Engineering, Faculty of Agriculture and Natural Resources, Imam Khomeini International University, Qazvin, Iran
چکیده [English]

Objective
This study aimed to clone the human basic fibroblast growth factor (hbFGF) gene into the pCAMBIA1304 binary vector for recombinant bFGF protein production in plant expression systems.
 
Materials and Methods
The full-length open reading frame (ORF) encoding the hbFGF gene was inserted into the pCAMBIA1304 binary vector and subsequently cloned into Escherichia coli strain DH5α. The recombinant expression vector, designated pCAMBIA-hbFGF, was then introduced into competent Agrobacterium tumefaciens strains EHA105, GV3101, and LBA4404.
 
Results
The hbFGF gene, comprising 561 nucleotides, encoded a protein of 155 amino acid residues. The calculated molecular mass and predicted isoelectric point (pI) of the deduced polypeptide sequence were 17.25 kDa and 9.58, respectively. The instability index, aliphatic index, and hydrophobicity index of the bFGF protein were calculated as 36.60, 68.00, and -0.511, respectively, indicating high stability and a hydrophilic nature. Analysis using ProtScale and TMHMM programs confirmed the hydrophilic properties of bFGF and the absence of transmembrane domains. Additionally, the MotifScan program identified a conserved fibroblast growth factor (FGF) family domain in the hbFGF sequence, while no potential N-glycosylation sites were detected. The predicted secondary structure of the mRNA sequence, calculated using the RNAfold program, exhibited a minimum free energy of approximately -136.90 kcal/mol, indicating relatively high stability with low entropy. The simulated three-dimensional structure of the hbFGF protein revealed a pyramidal arrangement of 10 non-parallel β-sheets. Ramachandran plot analysis confirmed that 86.3% of the amino acid residues were organized in regular structures, primarily non-parallel β-sheets, with only two residues (Thr8 and Gly24) exhibiting unusual ϕ and ψ angles. Phylogenetic analysis demonstrated a high degree of similarity with Pan troglodytes, Pongo abelii, and Camelus dromedarius, showing 100%, 100%, and 98.71% sequence similarity, respectively.
 
Conclusions
The bFGF protein was identified as a stable, hydrophilic protein without potential N-glycosylation sites. These characteristics suggest that the bFGF protein may be successfully produced heterologously in plant expression systems for potential commercialization.

کلیدواژه‌ها [English]

  • binary vector
  • cloning
  • fibroblast growth factor
  • hydrophobicity index
  • ramachandran plot

مراجع

بسطامی میثم، حسینی رامین (1397) بهینه­سازی توالی کدکننده فاکتور رشد فیبروبلاستی بازی انسانی بمنظور بیان در گیاه برنج و همسانه­سازی آن تحت کنترل توالی­های تنظیم کننده ژن ramy3D در ناقل دوتایی pCAMBIA1304. مجله بیوتکنولوژی کشاورزی. 10، 20-1.
جعفری احمدآبادی سید علی اصغر، عسکری­همت حشمت­اله، محمدآبادی محمدرضا (1402) تاثیر شاهدانه بر بیان ژن DLK1 در بافت‌ قلب بره‌های کرمانی. مجله بیوتکنولوژی کشاورزی، 15(1)، 217-234.
شکری سمیرا، خضری امین، محمدآبادی محمدرضا، خیرالدین حمید (1402) بررسی بیان ژن MYH7  در بافت‌های ران، دست و راسته بره‌های پرواری نژاد کرمانی. مجله بیوتکنولوژی کشاورزی، 15(2)، 217-236.
محمدآبادی محمدرضا، گلکار افروز، عسکری حصنی مجید (1402) اثر رازیانه (Foeniculum vulgare) بر بیان ژن فاکتور 1 رشد شبه انسولین در بافت شکمبه گوسفند کرمانی. مجله بیوتکنولوژی کشاورزی، 15(4)، 239-256.
An N, Ou J, Jiang D, Zhang L, Liu J, Fu K, et al. (2013) Expression of a functional recombinant human basic fibroblast growth factor from transgenic rice seeds. Int J Mol Sci 14, 3556-3567.
Armelin HA (1973) Pituitary extracts and steroid hormones in the control of 3T3 cell growth. Proc Natl Acad Sci USA 70, 2702-2706.
Barazandeh A, Mohammadabadi MR, Ghaderi-Zefrehei M, Nezamabadipour H (2016a) Predicting CpG islands and their relationship with genomic feature in cattle by hidden markov model algorithm. Iran J Appl Anim Sci 6 (3), 571-579.
Barazandeh A, Mohammadabadi MR, Ghaderi-Zefrehei M, Nezamabadipour H (2016b) Genome-wide analysis of CpG islands in some livestock genomes and their relationship with genomic features. Czech J Anim Sci 61, 487.
Birnboim HC, Doly J (1979) A rapid alkaline procedure for screening recombinant plasmid DNA. Nucleic Acids Res 7, 1513-1525.
Bordbar F, Mohammadabadi M, Jensen J, et al. (2022) Identification of candidate genes regulating carcass depth and hind leg circumference in simmental beef cattle using Illumina Bovine Beadchip and next-generation sequencing. Anim 12 (9), e1103.
Claverie JM, Notredame C (2007) Bioinformatics for dummies (2nd edn), New York, John Wiley and Sons.
De Smit MH, Van Duin J (1990) Secondary structure of the ribosome binding site determines translational efficiency: A quantitative analysis. Proc Natl Acad Sci USA, 87: 7668-7672.
Ding S-H, Huang L-Y, Wang Y-D, Sun H-C, Xiang Z-H (2006) High-level expression of basic fibroblast growth factor in transgenic soybean seeds and characterization of its biological activity. Biotechnol Lett 28, 869-875.
Dolivo DM (2022) Anti-fibrotic effects of pharmacologic FGF-2: a review of recent literature. J Mol Med 100(6), 847-860.
Erdős G, Dosztányi Z (2020) Analyzing protein disorder with IUPred2A. Curr Protoc Bioinformatics 70(1), e99.
Farooq M, Khan AW, Kim MS, Choi S (2021) The role of fibroblast growth factor (FGF) signaling in tissue repair and regeneration. Cell 10(11), 3242.
Gasteiger E, Hoogland C, Gattiker A, Duvaud S, Wilkins MR, Appel RD, et al. (2005) Protein identification and analysis tools on the ExPASy server. In: Walker JM (ed), The proteomics protocols handbook, Totowa, Humana Press, pp. 571-607.
Hayward S, Milner-White EJ (2021) Determination of amino acids that favor the αL region using Ramachandran propensity plots. Implications for α-sheet as the possible amyloid intermediate. J Struct Biol 213(2), 107738.
Helke A, Geisen RM, Vollmer M, Sprengart ML, Fuchs E (1993) An unstructured mRNA region and a 5ʹ hairpin represent important elements of the E. coli translation initiation signal determined by using the bacteriophage T7 gene 1 translation start site. Nucleic Acid Res 21, 5705-5711.
Hofgen R, Willmitzer L (1988) Storage of competent cells for Agrobacterium transformation. Nucleic Acid Res 16(20), 9877.
Jafari Ahmadabadi SAA, Askari-Hemmat H, Mohammadabadi M, et al. (2023) The effect of Cannabis seed on DLK1 gene expression in heart tissue of Kermani lambs. Agric Biotechnol J 15 (1), 217-234 (In Persian).
Jyothishwaran G, Kotresha D, Selvaraj T, Srideshikan SM, Rajvanshi PK, Jayabaskaran C (2007) A modified freeze-thaw method for efficient transformation of Agrobacterium tumefaciens. Curr Sci 93, 770-772.
Kim YJ, Shim JS, Krishna PR, Kim SY, In JG, Kim MK, et al. (2008) Isolation and characterization of a glutaredoxin gene from Panax ginseng CA Meyer. Plant Mol Biol Reporter 26(4), 335-349.
Kwong KWY, Ng KL, Lam CC, Wang YY, Wong WKR (2013) Authentic human basic fibroblast growth factor produced by secretion in Bacillus subtilis. Appl Microbi Biotechnol 97, 6803-6811.
Kyte J, Doolittle RF (1982) A simple method for displaying the hydropathic character of a protein. J Mol Biol 157, 105-132.
Lingg N, Cserjan‐Puschmann M, Fischer A, Engele P, Kröb C, Schneider R, et al. (2021) Advanced purification platform using circularly permuted caspase‐2 for affinity fusion‐tag removal to produce native fibroblast growth factor 2. J Chem Technol Biotechnol 96(6), 1515-1522.
Lundell DL, Narula SK (1994) Structural elements required for receptor recognition of human interferon-gamma. Pharmacol Ther 64, 1-21.
Mathews DH, Disney MD, Childs JL, Schroeder SJ, Zuker M, Turner DH (2004) Incorporating chemical modification constraints into a dynamic programming algorithm for prediction of RNA secondary structure. Proc Natl Acad Sci USA 101(19), 7287-7292.
Mészáros B, Erdős G, Dosztányi Z (2018) IUPred2A: context-dependent prediction of protein disorder as a function of redox state and protein binding. Nucleic Acid Res 46(W1), W329-W337.
Mohammadabadi M, Golkar A, Askari Hesni M (2023) The effect of fennel (Foeniculum vulgare) on insulin-like growth factor 1 gene expression in the rumen tissue of Kermani sheep. Agric Biotechnol J 15 (4), 239-256 (In Persian).
Mohammadabadi M, Masoudzadeh SH, Khezri A, et al. (2021) Fennel (Foeniculum vulgare) seed powder increases Delta-Like Non-Canonical Notch Ligand 1 gene expression in testis, liver, and humeral muscle tissues of growing lambs. Heliyon 7 (12), e08542
Mohammadinejad F, Mohammadabadi M, Roudbari Z, Sadkowski T (2022) Identification of key genes and biological pathways associated with skeletal muscle maturation and hypertrophy in Bos taurus, Ovis aries, and Sus scrofa. Anim 12 (24), 3471.
Ornitz DM, Itoh N (2015) The fibroblast growth factor signaling pathway. Wiley Interdiscip Rev: Dev Biol 4, 215-266.
Poudel SB, Min CK, Lee JH, Shin YJ, Kwon TH, Jeon YM, et al. (2019) Local supplementation with plant‑derived recombinant human FGF2 protein enhances bone formation in critical‑sized calvarial defects. J Bone Miner Metab 37, 900-912.
Proctor JR, Meyer IM (2013) CoFold: an RNA secondary structure prediction method that takes co-transcriptional folding into account. Nucleic Acid Res 41, e102.
Ramachandran GN, Sasisekharan V (1968) Conformation of polypeptides and proteins. Adv Protein Chem 23, 283-437.
Razaghi A, Tan E, Lua L, Owens L, Karthikeyan OP, Heimann K (2016) Is Pichia pastoris a realistic platform for industrial production of recombinant human interferon gamma? Biologic 45, 52-60.
Russell RB, Breed J, Barton GJ (1992) Conservation analysis and structure prediction of the SH2 family of phosphotyrosine binding domains. FEBS Lett 304(1), 15-20.
Saadatabadi LM, Mohammadabadi M, Ghanatsaman ZA, et al. (2023) Data of whole-genome sequencing of Karakul, Zel, and Kermani sheep breeds. BMC Res Not 16 (1), e353.
Safaei SMH, Dadpasand M, Mohammadabadi M, et al. (2022) An Origanum majorana leaf diet influences myogenin gene expression, performance, and carcass characteristics in lambs. Anim 13 (1), e14.
Shahsavari M, Mohammadabadi M, Khezri A, et al. (2022) Effect of fennel (Foeniculum Vulgare) seed powder consumption on insulin-like growth factor 1 gene expression in the liver tissue of growing lambs. Gene Express 21 (2), 21-26.
Shokri S, Khezri A, Mohammadabadi M, Kheyrodin H (2023). The expression of MYH7 gene in femur, humeral muscle and back muscle tissues of fattening lambs of the Kermani breed. Agric Biotechnol J 15 (2), 217-236 (In Persian).
Thompson SA (1992) The disulfide structure of bovine pituitary basic fibroblast growth factor. J Biol Chem 267, 2269-2273.
Wang Y-P, Wei Z-Y, Zhong X-F, Lin C-J, Cai Y-H, Ma J (2016) Stable expression of basic fibroblast growth factor in chloroplasts of tobacco. Int J Mol Sci 17, 19.
Wu X, Kamei K, Sato H, Sato S, Takano R, Ichida M, et al. (2001) High-level expression of human acidic fibroblast growth factor and basic fibroblast growth factor in silkworm (Bombyx mori L.) using recombinant baculovirus. Protein Expr Purif 21, 192-200.
Zhang W, Xiao W, Wei H, Zhang J, Tian Z (2006) mRNA secondary structure at start AUG codon is a key limiting factor for human protein expression in Escherichia coli. Biochem Biophys Res Commun 349, 69-78.
مجله بیوتکنولوژی کشاورزی
دوره 17، شماره 1
فروردین 1404
صفحه 1-26

فایل ها

هم رسانی

ارجاع به این مقاله

آمار