همسانه سازی پیشبر E8 گیاه گوجه فرنگی و بررسی بیان موقت با استفاده از سیستم اگرواینفیلتریشن

همسانه­سازی پیشبر E8 گیاه گوجه­فرنگی و بررسی بیان موقت با استفاده از سیستم اگرواینفیلتریشن

ناهید احمدی¹ ، حسن رهنما²*، سید کمال کاظمی تبار³ 

¹ دانشجوی کارشناسی ارشد بیوتکنولوژی  کشاورزی، دانشگاه کشاورزی و منابع طبیعی ساری

² استادیار بخش کشت بافت و انتقال ژن، پژوهشکده بیوتکنولوژی کشاورزی ایران، کرج

³ استادیار بخش زراعت و اصلاح نباتات، دانشگاه علوم کشاورزی و منابع طبیعی ساری

تاریخ دریافت: 25/04/1390، تاریخ پذیرش: 28/12/1390

چکیده

جداسازی و بررسی خصوصیات پیشبرهای اختصاصی بافت میوه،  برای دستورزی و بیان هدفمند پروتئین­های نوترکیب در گیاهان از اهمیت زیادی برخوردار است. پیشبر E8 یک پیشبر اختصاصی بافت میوه گیاه گوجه­فرنگی بوده که طول کامل آن kb 2/2 می­باشد. در این پژوهش بخش هسته­ای این پیشبر به طول kb 1/1 مورد استفاده قرار گرفت. با استفاده از پرایمرهای اختصاصی و آنزیم pfu پلیمراز، قطعه مورد نظر از روی DNA استخراج شده گوجه فرنگی تکثیر و همسانه­سازی شد. پس از تعیین توالی و تایید نهایی، پیشبر E8 جایگزین پیشبر دایمی CaMV35S در ناقل دوگانه pBI121 گردید. پلاسمید نوترکیب با کمک شوک حرارتی به Agrobacterium tumefaciens سویه LBA4404 منتقل شد. با استفاده از روش اگرواینفیلتریشن بیان اختصاصی ژن gus در بافت­های گیاه گوجه­فرنگی مورد بررسی قرار گرفت. اگروباکتریوم حاوی ناقل دوگانه pBI121 به عنوان کنترل مورد استفاده قرار گرفت. نتایج حاصل نشان داد که ژن gus در میوه­های گوجه فرنگی به طور اختصاصی بیان می­شود. از این پیشبر فعال می­توان برای بیان اختصاصی پروتئین­های نوترکیب در میوه­های گیاه گوجه فرنگی استفاده نمود.

کلمات کلیدی: اگرواینفیلتریشن ، بیان موقت، پیشبر E8، گوجه فرنگی، gus.

مقدمه

تولید پروتئین­های نوترکیب در گیاهان تراریخته (کشاورزی مولکولی) یکی از جنبه­های کاربردی جدید مهندسی ژنتیک محسوب می­شود. پروتئین­های تولید شده توسط گیاهان برخلاف سیستم­های تولید مبتنی بر سلول­های جانوری، به علت عدم وجود عوامل بیماریزای مشترک انسان و دام، بسیار ایمن هستند (Larrick & Thomas, 2001) عوامل مختلفی در افزایش تولید پروتئین­های نوترکیب در گیاهان تراریخته نقش دارند که از آن جمله می­توان به بهینه­سازی کدونی، بیان کافی و پایدار ژن خارجی و ... اشاره نمود. با این وجود، روش، زمان و محل بیان ژن در گیاهان بوسیله مجموعه­ای از عوامل کنترلی تنظیم می­گردد. پیشبرها[1] به عنوان یکی از عوامل اصلی رونویسی نقش مهمی در بیان ژن دارند.

پیشبر CaMV35S (ویروس موزائیک گل کلم) به طور موثری سبب بیان ژن­هایی که تحت کنترل آن قرار دارند می­شود و به همین دلیل در مهندسی ژنتیک گیاهی کاربرد زیادی دارد (Jani et al., 2002). با این وجود، این پیشبر یک پیشبر دایمی بوده و هیچ گونه بیان اختصاصی در یک مرحله نموی یا در یک بافت خاص را سبب نمی­شود. به همین دلیل بیان هدفمند پروتئین­های نوترکیب در گیاهان تراریخته اهمیت زیادی دارد. یکی از مزایای بیان هدفمند پروتئین­های خارجی در میوه­ها این است که این بخش­های خوراکی را می­توان بدون پختن و یا با حداقل فراوری مصرف نمود. به همین علت، میوه­ها به عنوان یکی از محل­های هدف تولید واکسن­های نوترکیب محسوب می­شوند. چندین پیشبر اختصاصی میوه در گوجه­فرنگی شناسایی شده است که از آن جمله می­توان به E4، E8، PG و 2A11 اشاره نمود (Coupe & Deikman, 1997; Deikman et al, 1998). این پیشبرها اغلب برای بررسی نفش اتیلن در رسیدگی میوه مورد استفاده قرار گرفته­اند. پیشبر E8 یکی از شناخته شده­ترین پیشبرهای وابسته به رسیدگی میوه گوجه فرنگی محسوب می­شود. ژن E8 یکی از ژن­های وابسته به بیوسنتز اتیلن است که اولین بار توسطLincoln et al.  (1987, 1988) از گوجه فرنگی همسانه­سازی شد. رونویسی ژن E8 بوسیله اتیلن القا شده و در مراحل آغازی رسیدگی میوه فعال می­گردد (Zhao et al., 2009). بیان ژن E8 از نظر زمانی و مکانی در میوه­های رسیده گوجه فرنگی تنظیم می­شود (Deikman & Fischer, 1988). پروتئین E8 عضوی از خانواده دی­اکسیژنازها است که در گیاهان وجود داشته و وابسته به 1-آمینوسیکلوپروپان 1- کربوکسیلیک اکسیداز (ACO) است که مرحله پایانی مسیر بیوسنتزی اتیلن را کاتالیز می­کند (Penarrubia et al., 1992; Prescott et al., 1993). E8 و ACO همولوژی بالایی دارند، به طوری که توالی آمینو اسیدی آنها 34% (معادل 295 باقیمانده آمینواسیدی) با هم شباهت دارد (Deikman et al., 1992).

رسیدگی میوه گوجه فرنگی با افزایش میزان تولید اتیلن کنترل می­شود (Penarrubia et al., 1992). با توجه به نقش E8 به عنوان پروتئین وابسته به رسیدگی میوه گوجه فرنگی، این پروتئین می­تواند به طور مستقیم یا غیرمستقیم فرایند نمو میوه گوجه فرنگی را از طریق دخالت در مسیر بیوسنتز اتیلن تحت تاثیر قرار دهد (Deikman et al., 1992).

در سال­های اخیر، پیشبر E8 به طور گسترده­ای برای اصلاح و بهبود کیفی میوه های گوجه فرنگی و همچنین بیان پروتئین­های نوترکیب دارویی در گوجه فرنگی­های تراریخته مورد استفاده قرار گرفته است (Giovannoni et al., 1989; Good et al, 1994; Lewinsohn et al., 2001; Mehta et al., 2002; Garza et al., 2004; Jiang et al., 2007; He et al., 2007; Ramirez et al., 2007).

در مطالعه حاضر، پس از همسانه­سازی پیشبر E8 از گیاه گوجه فرنگی، بیان اختصاصی آن در بافت­های میوه گوجه فرنگی در مقایسه با پیشبر CaMV35s با استفاده از روش بیان موقت اگرواینفیلتریشن مورد بررسی قرار گرفته است.

مواد و روشها

در این پژوهش از گیاه گوجه­فرنگی Lycopersicon esculentum Mill متعلق به خانواده Solanaceae استفاده گردید. بذور این گیاه پس از شستشو در گلدان­های پلاستیکی در گلخانه کشت گردید. برگ­های جوان این گیاه در مرحله 8-10 برگی برای استخراج DNA ژنومی به روش Dellaporta et al. (1983) مورد استفاده قرار گرفت. از DNA استخراج شده بعنوان الگو جهت جداسازی پیشبر E8 بوسیله واکنش زنجیری پلیمراز (PCR) و با استفاده از آغازگرهای اختصاصی استفاده شد. برای انجام PCR از دمای C^°94 برای واسرشت­سازی اولیه به مدت 4 دقیقه استفاده گردید. در ادامه 35 چرخه با شرایط زیر انتخاب شد: واسرشت­سازی یک دقیقه در دمای C^°94 ؛ اتصال یک دقیقه در دمای C^°59 و بسط یک دقیقه در دمای C^°72  ؛ در پایان 4 دقیقه اضافه برای بسط نهایی در C^°72 در نظر گرفته شد. توالی آغازگر پیشرو5′- aagcttctagaaatttcacgaaat-3′ و توالی آغازگر برگشتی 5′- ggatccttcttttgcactgtgaatgat-3′ بود. این آغازگرها بر اساس توالی ژنی موجود در سایت NCBI با شماره دسترسی AF515784 و با استفاده از نرم افزار Oligo طراحی گردید.

همسانه­سازی پیشبر E8

به منظور تکثیر و همسانه­سازی پیشبر E8 در ناقل دوگانه نهایی pBI121 ، ابتدا محصول PCR مستقیماً در ناقل T/A (ناقل pTZ57R/T) (InsTAclone^TM PCR Cloning Kit# K1214, Fermentas) کلون گردید. انتقال پلاسمید به سلول­های مستعد باکتری E. coli با استفاده از شوک حرارتی انجام گرفت. سلول­های تراریخت حاوی پلاسمیدهای نوترکیب در محیط LB مایع و محیط انتخابی حاوی آنتی­بیوتیک آمپی­سیلین انتخاب و جهت استخراج پلاسمید به روش Miniprep  مورد استفاده قرار گرفتند (Sambrook & Russell, 2001). پس از تائید حضور ژن در سازه همسانه­سازی، با استفاده از هضم آنزیمی با آنزیم­های BamHI و HindIII، پیشبر مورد نظر از روی ژل آگارز جدا شده و با استفاده از کیت خالص­سازی DNA (شرکتRoche ) تخلیص گردید. به منظور تایید صحت توالی قطعه مربوط به پیشبر، پلاسمیدهای نوترکیب پس از استخراج برای توالی­یابی قطعه ورودی، به شرکت Millegene فرستاده شدند. از پرایمرهای عمومی M13 برای توالی­یابی استفاده گردید. نتیجه توالی­یابی در برنامه Blast نوکلئوتیدی ، مورد جستجو قرار گرفت.

به منظور کلون کردن پیشبر E8 در پلاسمید pBI121، ابتدا با استفاده از آنزیم­های برشی BamHI و HindIII پیشبر CaMV35S از پلاسمید pBI121 خارج شده و پلاسمید خطی فاقد پیشبر CaMV35S با استفاده از کیت خالص­سازی DNA جهت انجام واکنش اتصال آماده گردید. در مرحله بعد، پیشبر E8 جدا شده با روش فوق توسط آنزیم DNA -T₄لیگاز به پلاسمید pBI121 خطی شده الحاق شد. تراریختی سلول­های E.coli با استفاده از پلاسمید نوترکیب به روش فیزیکی- شیمیایی انجام گردید (Sambrook & Russell, 2001). کلون­های تراریخت باکتریایی در محیط انتخابی حاوی آنتی­بیوتیک کانامایسین انتخاب گردیدند. جهت تایید الحاق پیشبر در پلاسمید pBI121آزمونهای PCR با آغازگرهای اختصاصی E8 و هضم آنزیمی توسط آنزیم­های برشی BamHI وHindIII  انجام گردید. پس از تایید نهایی سازه نوترکیب حاصل که pBI-E8-GUS نامگذاری شد (شکل 1)، انتقال این پلاسمید به باکتری Agrobacterium tumefaciens انجام گرفت. سلول­های مستعد سویه LBA4404 باکتری A. tumefaciens به روش ذوب و انجماد[2]  تراریخت گردیدند (Sambrook & Russell, 2001) و در محیط کشت جامد حاوی کانامایسین (50 mg/l) و ریفامپسین (75 mg/l) در دمای C^°28  به مدت 2 تا 3 روز کلنی­ها ظاهر شدند. تایید تراریختی اگروباکتریوم با استفاده از آزمونهای PCR با آغازگرهای اختصاصی E8 انجام گردید. از اگروباکتریوم حاوی پلاسمید pBI121 به عنوان کنترل در تراریختی استفاده شد.

بررسی بیان موقت ژن gus در گیاهان گوجه­فرنگی

به­منظور بررسی و ارزیابی عملکرد سازه pBI-E8-GUS در گیاهان و بررسی بیان ژن باکتریایی gus (که آنزیم بتاگلوکورونیداز را کد می­کند) تحت پیشبرهای E8 و CaMV35S در میوه گوجه­فرنگی، آزمایش بیان موقت طراحی و اجرا گردید. بدین منظور ابتدا اگروباکتریوم­های حاوی پلاسمیدهای نوترکیب pBI-E8-GUS یا pBI121 در 5 میلی­لیتر محیط LB مایع حاوی 50 میلی­گرم در لیتر کانامایسین و 75 میلی­گرم در لیتر ریفامپسین به صورت شبانه در دمای 28^°C و بر روی شیکر، کشت گردید. از اگروباکتریوم فاقد پلاسمیدهای فوق به عنوان کنترل در مورد استفاده قرار گرفت. صبح روز بعد 2 میلی­لیتر از این کشت به 50 میلی­لیتر در محیط LB مایع حاوی آنتی بیوتیک­های فوق افزوده شد و مجددا در همان شرایط رشد ذکر شده قرار گرفت. پس از رسیدن OD₆₀₀ به 5/0، نمونه­های برش یافته میوه گوجه­فرنگی به سوسپانسیون باکتری اضافه شد و در دسیکاتور تحت خلاء به مدت 15 دقیقه قرار گرفتند. با حذف سریع سیستم خلا، ورود باکتری به داخل غده­ها تسهیل گردید. نمونه­ها به پتری­های حاوی کاغذ صافی منتقل شدند و به مدت 3 روز در تاریکی قرار گرفتند. بعد از پایان این مدت آزمایش هیستوشیمایی ژن gus با استفاده از X-Gluc امکان سنجش بیان ژن را به طور اختصاصی در سلول و بافت میوه فراهم آورد. نمونه­ها در لوله­های حاوی محلول رنگ­آمیزی X-Gluc برای 8-36 ساعت در دمایC^°37 قرار داده گرفته و سپس در الکل 70%  شستشو گردیدند ( Jefferson et al., 1987).

شکل 1- سازه نوترکیب pBI-E8-GUS مورد استفاده در تراریختی موقت گیاه گوجه فرنگی.

Figure1- T-DNA region of pBI-E8-GUS vector used for transient transformation of tomato plant.

نتایج و بحث

در سال­های اخیر، گیاهان به عنوان یک مکانیسم جایگزین مناسب، ایمن و اقتصادی برای تولید انواع پروتئین­های نوترکیب مانند آنتی بادی­ها، واکسن­ها، آنزیم­های صنعتی، پلیمرهای زیستی و غیره معرفی شده­اند (Schillberg et al., 2005). گوجه فرنگی هم به دلیل خوش خوراک بودن و ارزش غذایی بالا و همچنین تازه خوری به عنوان یک گیاه میزبان برای تولید واکسن­های گیاهی شناخته شده است.

تولید کافی و بیان مناسب این پروتئین­ها در گیاهان نیازمند شرایط و عوامل کنترلی مختلفی در روش­های مهندسی ژنتیک است. پیشبرها یکی از مهمترین عناصر تنظیمی برای بیان ژن­های داخلی و خارجی در یوکاریوت­ها محسوب می­شوند (Zhao et al., 2009). به همین دلیل فعالیت و اختصاصی بودن یک پیشبر می­تواند میزان بیان ژن را در گیاهان تحت تاثیر قرار دهد. پیشبر E8 گیاه گوجه فرنگی باعث بیان اختصاصی پروتئین­های نوترکیب در بافت میوه می­شود. از زمانی که این پیشبر برای اولین بار در گوجه فرنگی چری همسانه­سازی شد (Deikman et al., 1988)، مطالعات زیادی در زمینه نحوه عملکرد آن با استفاده از بیان ژن­های خارجی در گوجه فرنگی انجام شده است (Jiang et al., 2007; Ramirez et al., 2007; Zhao et al., 2009). در این پژوهش بجای استفاده از کل قطعه 2/2 کیلو بازی پیشبر E8 از قطعه هسته­ای (Core) 1/1 کیلو بازی آن استفاده شد. این پیشبر با استفاده از آغازگرهای اختصاصی و با روش PCR از ژنوم گوجه­فرنگی کلون گردید (شکل 2). الحاق پیشبر بداخل پلاسمید T/A با استفاده از روش PCR ثابت شد. همچنین با استفاده از واکنش هضم آنزیمی پلاسمید نوترکیب توسط آنزیم­های برشی BamHI وHindIII و خروج قطعات DNA با اندازه 1100 جفت­بازی، همسانه­سازی پیشبر مورد تائید قرار گرفت (شکل 2- ب). تعیین توالی و مقایسه پیشبر همسانه­سازی شده با توالی موجود در NCBI نشان داد که پیشبر جدا شده 98% با توالی­های مورد جستجو شباهت دارد (شکل 3). جایگزینی پیشبر E8 با پیشبر دایمی CaMV35S در ناقل دوگانه pBI121 و ساخت سازه نوترکیب pBI-E8-GUS (شکل1) با استفاده از آزمون­های مختلف (PCR و هضم آنزیمی) مورد تائید قرار گرفت. نتایج PCR سازه نوترکیب جدید نشان­دهنده تکثیر قطعه 1100 جفت بازی با استفاده از آغازگرهای اختصاصی E8 و همچنین هضم آنزیمی آن توسط آنزیم­های برشی BamHI وHindIII حضور پیشبر E8 را در بالادست ژن gus در سازه نوترکیب pBI-E8-GUS به اثبات رساند (شکل 4). تراریختی سلول­های مستعد سویه LBA4404 باکتری اگروباکتریوم تومفسینس با سازه نوترکیب pBI-E8-GUS با استفاده از روش فیزیکی- شیمیایی انجام شد. کلنی­های باکتریایی حاوی سازه نوترکیب با استفاده از روش PCR و آغازگرهای اخنصاصی پیشبر E8 تائید شدند. الکتروفورز محصول PCR نشان داد که مطابق انتظار قطعه 1100 جفت بازی تکثیر یافته است (شکل 5). برای ارزیابی بیان اختصاصی پیشبر E8 در میوه­های گیاه گوجه فرنگی، از روش تراریختی موقت با استفاده از اگروباکتریوم استفاده شد. بیان موقت ژن یک روش سریع، قابل انعطاف و تکرار پذیر برای بررسی سطح بیان آن است. در روش­های مرسوم، ارزیابی توالی­های تنظیمی نیازمند یک پروتوکل کارآمد برای تراریختی گیاه است. بنابراین، در گونه­هایی که تراریختی آنها مشکل و زمان بر می­باشد، یک عامل محدود کننده برای ارزیابی سریع پیشبرها خواهد بود.

شکل 2- تایید مولکولی همسانه­سازی پیشبر E8 در ناقل همسانه­سازی pTZ57R/T. الف- آزمون PCR کلنی­های حاصل از واکنش اتصال ناقل pTZ57R/T و پیشبر E8 به منظور بررسی ورود پیشبر E8 و مشاهده باند  bp1100. ب- هضم آنزیمی پلاسمیدهای حاصل از همسانه­سازی با استفاده از دو آنزیم HindIII و BamHI. W) کنترل منفی (آب)؛ M) نشانگر اندازه وزن مولکولی1 kb ladder. 1 و2) پلاسمیدهای استخراج شده از 2 کلنی حاصل از واکنش اتصال pTZ57R/T و پیشبر E8 .

Figure 2- Molecular analysis of E8 promoter in pTZ57R/T cloning vector. A: PCR analysis of bacterial colony containing the product of pTZ57R/T+ E8 ligation for the presence of 1100 bp E8 promoter. B: Enzymatic digestion of the recombinant plasmid using HindIII and BamHI. W- Negative control (water); M- DNA molecular weight marker 1 kb ladder; 1, 2- Two sample plasmids from two bacterial colony.

به همین دلیل، سیستم­های بیان موقت ژن نسبت به بیان دایمی دارای مزایای فراوانی هستند که از آن جمله می­توان به عدم نیاز به باززایی گیاه از سلول­های تراریخته و کاهش زمان رسیدن به نتیجه بیان ژن اشاره نمود. بنابراین، سیستم های بیان موقت ژن ابزاری سریع و کارا برای بررسی و مقایسه فعالیت پیشبرهای مختلف در گیاهان بوده و کاربرد گسترده­ای در زیست شناسی مولکولی و بیوتکنولوژی گیاهی دارند (Agius et al., 2005; Orzaez et al., 2006; Zhao & Zhao, 2009). نتایج حاصل از آزمایش بیان موقت پیشبر در میوه گوجه­فرنگی در محلول رنگ آمیزی X-Gluc نشان داد که پیشبر E8 همانند پیشبر CaMV35S باعث بیان ژن gus در میوه گوجه­فرنگی شده است. این امر ضمن اینکه کارایی و فعالیت پیشبر E8 را نشان می­دهد حاکی از موفقیت روش اگرواینفیلتریشن برای میوه گوجه­فرنگی می­باشد. رنگ آبی بافت­ها نشان داد که پیشبرها باعث بیان ژن gus شده­اند. عدم رنگ آمیزی نمونه­های کنترل تاکیدی بر صحت بیان ژن و عدم تاثیرپذیری نتایج از عوامل محیطی و جانبی می­باشد (شکل 6).

>emb|X13437.1|  Tomato ethylene-responsive fruit ripening gene E8

Length=3042;Score = 1766 bits (956),  Expect = 0.0;Identities = 977/998 (98%), Gaps = 0/998 (0%;Strand=Plus/Plus

Query  38    AATTTCACGAAATCGGCCCTTATTCaaaaataacttttaaataatgaattttaaatttta  97

             ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct  9     AATTTCACGAAATCGGCCCTTATTCAAAAATAACTTTTAAATAATGAATTTTAAATTTTA  68

Query  98    agaaataatatccaatgaataaatGACANGTAGCATTTTACCTAAATATTTCAACTATTT  157

             |||||||||||||||||||||||||||| |||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct  69    AGAAATAATATCCAATGAATAAATGACATGTAGCATTTTACCTAAATATTTCAACTATTT  128

Query  158   TAATCCAATATTAATTTGTTTTATTCCCAACAATAGAAAGTCTTGTGCAGACATTTAATC  217

             ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct  129   TAATCCAATATTAATTTGTTTTATTCCCAACAATAGAAAGTCTTGTGCAGACATTTAATC  188

Query  218   TGACTTTTCCAGTACTAAATATTAATTTTCTGAAGATTTTCGGGTTTAGTCCACAAGTTT  277

             ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct  189   TGACTTTTCCAGTACTAAATATTAATTTTCTGAAGATTTTCGGGTTTAGTCCACAAGTTT  248

Query  278   TAGTGAGAAGTTTTGCTCAAAATTTTAGGTGAGAAGGTTTGATATTTATCTTTTGTTAAA  337

             ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct  249   TAGTGAGAAGTTTTGCTCAAAATTTTAGGTGAGAAGGTTTGATATTTATCTTTTGTTAAA  308

Query  338   TTAATTTATCTAGGTGACTATTATTTATTTAAGTAGAAATTCATATCATTACTTTTGCCA  397

             ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct  309   TTAATTTATCTAGGTGACTATTATTTATTTAAGTAGAAATTCATATCATTACTTTTGCCA  368

Query  398   ACTTGTAGTCATAATAGGAGTAGGTGTATATGATGAAGGAATAAACAAGTTCAGTGAAGT  457

             ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct  369   ACTTGTAGTCATAATAGGAGTAGGTGTATATGATGAAGGAATAAACAAGTTCAGTGAAGT  428

Query  458   GATTAAAATAAAATATAATTTAGGTGTACATCAAATAAAAACCTTAAAGTTTAGAAAGGC  517

             ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct  429   GATTAAAATAAAATATAATTTAGGTGTACATCAAATAAAAACCTTAAAGTTTAGAAAGGC  488

Query  518   ACCGAATAATTTTGCATAGAAGATATTAGTAAATTTATAAAAATAAAAGAAATGTAGTTG  577

             ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct  489   ACCGAATAATTTTGCATAGAAGATATTAGTAAATTTATAAAAATAAAAGAAATGTAGTTG  548

Query  578   TCAAGTTGTCTTCttttttttGGATAAAAATAGCAGTTGGCTTATGTCATTCTTTTACAA  637

             ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct  549   TCAAGTTGTCTTCTTTTTTTTGGATAAAAATAGCAGTTGGCTTATGTCATTCTTTTACAA  608

Query  638   CCTCCATGCCACTTGTCCAATTGTTGACACTTAACTAATTAGTTTGATTCATGTATGAAT  697

             ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct  609   CCTCCATGCCACTTGTCCAATTGTTGACACTTAACTAATTAGTTTGATTCATGTATGAAT  668

Query  698   ACTAAATAATTTTTTAGGACTGACTCAAATATTTTTATATTATCATAGTAATATTTATCT  757

             ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct  669   ACTAAATAATTTTTTAGGACTGACTCAAATATTTTTATATTATCATAGTAATATTTATCT  728

Query  758   AATTTTTAGGACCACTTATTACTAAATAATAAATTAACTACTACTATATTATTGTTGTGA  817

             ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct  729   AATTTTTAGGACCACTTATTACTAAATAATAAATTAACTACTACTATATTATTGTTGTGA  788

Query  818   AACAACAACGTTTTGGTTGTTATGATGAAACGTACACTATATCAGTATGAAAAATTCAAA  877

             ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct  789   AACAACAACGTTTTGGTTGTTATGATGAAACGTACACTATATCAGTATGAAAAATTCAAA  848

Query  878   ACGATTAGTATAAATTATATTGAAAATTTGATATTTTTCTATTCTTAATCAGACGTATTG  937

             ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct  849   ACGATTAGTATAAATTATATTGAAAATTTGATATTTTTCTATTCTTAATCAGACGTATTG  908

Query  938   GGTTTCATATTTTAAAANNGGACTAAACTTanaannnnaGTTNGTTTNNAACTANTTTTG  997

             |||||||||||||||||  |||||||||||| ||    |||| ||||  ||||| |||||

Sbjct  909   GGTTTCATATTTTAAAAAGGGACTAAACTTAGAAGAGAAGTTTGTTTGAAACTACTTTTG  968

Query  998   NCTCTTTNNNGTTCCCATTTCNNNNNTAGATTTCaaaa  1035

              ||||||   |||||||||||     ||||||||||||

Sbjct  969   TCTCTTTCTTGTTCCCATTTCTCTCTTAGATTTCAAAA  1006

شکل3- قسمتی از نتیجه Blast نوکلئوتیدی قطعه توالی‌یابی شده E8 ، توالی ردیف اول (Query) مربوط به نتیجه حاصل از تعیین توالی قطعه E8است و توالی دوم مربوط به توالی شماره دسترسی AF515784 است.

Figure 3- Blast on the sequenced E8 promoter. Query is the E8 promoter isolated from tomato plant; subject is the sequence of accession number AF515784.

بیان موقت ژن تجزیه­کننده آفت­کش ارگانوفسفری (opd) تحت کنترل پیشبر E8 در گیاه گوجه فرنگی با روش اگرواینفیلتریشن منجر به بیان اختصاصی آن در میوه­های این گیاه شد (Zhao & Zhao, 2009). در این پژوهش محققان هچنین موفق شدند با همان روش ژن gus را تحت کنترل پیشبر CaMV35S در میوه­های گوجه فرنگی بیان کنند. در پژوهشیOrzaez et al.  (2006) بیان موقت را برای آنالیز عملکرد ژن در میوه گوجه­فرنگی توسعه داده و مشخص کردند که تزریق سوسپانسیون اگروباکتریوم با استفاده از سوزن سرنگ (اگرواینجکشن) منجر به نفوذ بهتر باکتری در میوه می­شود. بیان دایمی ژن gus تحت کنترل پیشبر bp 2/2 E8 در گیاه گوجه فرنگی نشان داد که بیان ژن gus در میوه­های نارس تنها در سلول­های پارانشیم آوندی میوه­ها صورت می­گیرد در حالی که در میوه­های رسیده گوجه فرنگی، کل میوه ژن gus را بیان می­کند (Kniessl & Deikman, 1996). در پژوهش حاضر بجای قطعه kb 2/2 پیشبر E8 از قطعه bp 1/1 آن استفاده شد. نتایج نشان داد که قطعه پیشبری مورد استفاده هم می­تواند بیان ژن gus را در میوه­های رسیده القا نماید.

شکل 4- هضم آنزیمی پلاسمید های نوترکیب pBI-E8-GUS به منظور تایید ورود پیشبر E8 . M- نشانگر اندازه مولکولی 1 kb ladder؛ 1 و 2- هضم آنزیمی دو نمونه پلاسمید pBI-E8-GUS با دو آنزیم HindIII و BamHI.

Figure 4- Enzymatic digestion of pBI-E8-GUS. M-DNA molecular weight marker 1kb ladder; 1,2- Plasmid digested with HidIII and BamHI

در پژوهش هاییZhou et al. (2003) و نیز Wang et al.  (2003) پیشبر E8 را همسانه سازی و توالی­یابی کردند. آنها نشان دادند که امکان استفاده از این پیشبر در تولید واکسن خوراکی در گوجه­فرنگی تراریخته و همچنین هلوی تراریخته وجود دارد.He et al. (2007) پیشبر E8 ویژه میوه گوجه­فرنگی را در بیان آنتی­ژن واکسن ارزیابی کردند. آنها پیشبر kb 1/1 و kb 2/2 را از Lycopersicon esculentum cv. Jinfeng جدا و توالی­یابی کردند. پیشبر E8 و پیشبر CaMV35S را به ژن HBsAg متصل و به Nicotiana tabacum منتقل نمودند. بیان ژن HBsAg تحت کنترل پیشبر kb 1/1، E8 در بافتهای برگ، گل، دانه توتون مشاهده نشد ولی تحت کنترل پیشبر CaMV35S در توتون تراریخته بیان شدند. با سنجش الایزاثابت شد که پیشبر kb 1/1، E8 قادر به بیان ژن خارجی در میوه­های رسیده گوجه­فرنگی تراریخته می­باشد و در برگ، گل و میوه نارس بیان نمی­شود. نتایج نشان داد که این پیشبر نه تنها در اندام ویژه، بلکه در گونه­های خاصی هم عمل می­کند. همانند گزارش ارائه شده توسط Jiang et al. (2007)، نتایج این پژوهش هم نشان داد که قطعه kb 1/1 پیشبر E8 هم می­تواند بیان هدفمند ژن در میوه گوجه فرنگی را سبب شود. بنظر می­رسد که بقیه بخش­های پیشبر 2/2 کیلو بازی شاید برای افزایش بیان ژن ضروری باشند (Deikman et al., 1998). بنابراین، از این پیشبرمی­توان برای تولید هدفمند پروتئین­ها و واکسن­های نوترکیب در گوجه فرنگی استفاده کرد.