تعیین توالی ژنوم کامل و فیلوژنی جدایه های نژاد شدید ویروس پیچیدگی زرد برگ گوجه فرنگی جدا شده از تاتوره Datura stramomum L. در منطقه بجنورد، ایران

تعیین توالی ژنوم کامل و فیلوژنی جدایه­های نژاد شدید ویروس پیچیدگی زرد برگ گوجه فرنگی جدا شده از تاتوره Datura stramomum L. در منطقه بجنورد، ایران

محمدرضا حسین زاده ¹، مسعود  شمس بخش*²، شاهرخ کاظم پوراوصالو³

¹دانشجوی دکتری بیماری شناسی گیاهی دانشکده کشاورزی دانشگاه تربیت مدرس

²دانشیار گروه بیماری شناسی گیاهی دانشکده کشاورزی دانشگاه تربیت مدرس

³دانشیار گروه علوم گیاهی دانشکده علوم زیستی دانشگاه تربیت مدرس

تاریخ دریافت: 25/10/1391، تاریخ پذیرش: 01/02/1392

چکیده

ویروس پیچیدگی زرد برگ گوجه فرنگی , TYLCV) Tomato yellow leaf curl virus) به همراه ده گونه ویروسی و نژادهایشان که به ویروس­های شبه TYLCV معروفند عامل خسارت به گوجه فرنگی (Solanum lycopersicum L.) در مناطق گرمسیر، نیمه گرمسیر و معتدل دنیا می باشند. در این بررسی تعداد سه جدایه TYLCV-IL از گیاهان تاتوره در منطقه بجنورد همسانه سازی و ژنوم کامل آنها تعیین توالی گردید.  توالی اسید نوکلئیک ژنوم کامل آنها به همراه تعداد نه جدایه TYLCV-IL  گزارش شده ازایران و هشت  توالی سایر ویروس­های Begomovirus گوجه فرنگی از ایران  و سایر مناطق دنیا  مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفتند. نتایج فیلوژنی جدایه­ها نشان داد که تکامل جمعیت نژاد TYLCV-IL در ایران وابسته به جغرافیا بوده و صرفنظر از گونه میزبان واریانت­های شمال شرق و جنوب ایران به طور مجزا در دو زیرگروه جداگانه قرار گرفتند. جدایه TYLCV-IL[IR:Sh40:07], GUO76444 از منطقه شیراز با هیچکدام از جمعیت­های شمال شرق و جنوب ایران گروه بندی نشد. این جدایه با نژاد تیپ TYLCV-IL گزارش شده از فلسطین اشغالی قرابت نزدیکی داشته و با یکدیگر در یک زیر گروه مجزا قرار گرفتند. نتایج تجزیه فیلوژنی نشان داد که این جدایه از نظر تکاملی به عنوان پل ژنتیکی بین جدایه­های TYLCV-IL حوزه مدیترانه­ای و ایران محسوب می­شود. این اولین گزارش از گیاه تاتوره به عنوان میزبان  نژاد TYLCV-IL  در ایران و همچنین حضور این نژاد ویروسی در منطقه بجنورد و استان خراسان شمالی  می­باشد.

واژه های کلیدی: TYLCV-IL، خراسان شمالی، بگوموویروس.

مقدمه

بیماری پیچیدگی زرد برگ گوجه فرنگی یکی از مخربترین بیماری­های ویروسی گوجه فرنگی (Solanum lycopersicum L.) در مناطق گرمسیر، نیمه گرمسیر و معتدل دنیاست  (Czosnek & Laterrot, 1997; Moriones & Navas-Castillo, 2000). این بیماری توسط گونه تیپ ویروس پیچیدگی زرد برگ گوجه فرنگی (Tomato yellow leaf curl virus, TYLCV) به علاوه مجموعه­ای از ده گونه ویروسی و نژادهای­شان که به ویروس­های شبه TYLCV (TYLCVs) معروفند، ایجاد می­شود (Diaz-Pendon et al., 2010). از نظر تاکسونومیکی این ویروس­ها به جنس Begomovirus از خانواده Geminiviridae تعلق داشته و نامگذاری آنها براساس معیارهای تعیین گونه و استرین کمیته بین المللی تاکسونومی ویروس­ها (ICTV)[1] صورت گرفته است (Brown et al., 2012). میزبان اولیه این ویروس­ها گیاه گوجه فرنگی بوده ولی میزبان­های دیگری نیز دارند. این ویروس­ها قادر به آلودگی لوبیای معمولی (Phaseolus vulgaris )، فلفل شیرین (Capsicum annum)، فلفل تند (C. chinense)، گیاهان تیره کدوئیان، توتون (Nicotiana tabacum) و تعدادی از گیاهان زینتی شامل اطلسی (Petunia×hybridia) و لیزیانتوس (Eustoma grandiflora) می­باشند. همچنین علف­های هرزی نظیر تاجریزی (Solanum nigrum) و تاتوره (Datura stramonium) توسط این ویروس­ها آلوده می­شوند و گیاه محک  N. benthamiana را هم باید به این فهرست اضافه نمود (Diaz-Pendon et al., 2010).

گونه تیپ TYLCV و گونه­های شبه TYLCV (TYLCVs) توسط بیوتیپ­های مختلف سفیدبالک Bemisia tabaci (Gennadius) (Hemiptera: Aleyrodidae) شامل بیوتیپ­های  A , B , Qبه روش گردشی پایا منتقل می­شوند (Moriones & Navas-Castillo, 2000). این ویروس­ها دارای ژنوم تک لای DNA یک قسمتی (Monopartite) به استثنای گونه­های TYLCTHV[2]و TYLCKaV[3]  که دارای ژنوم دو قسمتی (Bipartite) هستند.  ژنوم در این ویروس­ها در حدود  Kb 8/2  (Diaz-Pendon et al., 2010) و دارای شش قالب خواندنی با همپوشانی ناقص است که در دو جهت ژنومی (جهت رشته ویروسی و جهت رشته مکمل) سازماندهی شده­اند. در جهت ویروسی قالب­های خواندنی V₁ و V₂ و در جهت مکمل قالب­های خواندنی C₁ ، C₄ ، C₂ و C₃ قرار گرفته­اند  (Jupin et al., 1994; Wartig et al., 1997) که توسط ناحیه بین ژنی (IR⁴) به طول تقریبا 300 نوکلئوتید از هم جدا می­شوند  .(Kheyr-Pour et al., 1991; Navot et al., 1991) ناحیه IR حاوی عناصر اصلی تنظیم همانندسازی و نسخه برداری ژنوم بوده و بخش ساقه – حلقه آن در بین تمام اعضای خانواده Geminiviridae محافظت شده می­باشد (Behjatnia et al., 2001) .

در ایران TYLCV اولین بار از استان­های سیستان و بلوچستان، کرمان، هرمزگان، بوشهر و خوزستان گزارش گردید (Hajimorad et al., 1996).  اولین جدایه­ای از TYLCV که بطور کامل تعیین توالی شد جدایه TYLCV-IR از ایرانشهر بود.  نتایج نشان داد که این جدایه در اثر نوترکیبی بین ویروس ایرانی پیچیدگی برگ گوجه فرنگی TLCIRV)) به عنوان دهنده و TYLCV-Mld به عنوان گیرنده قطعه ژنومی ایجاد شده است  (Bananej et al., 2004). دیگر جدایه­هایی که بطور کامل تعیین توالی شده­اند عبارتند از TYLCV-Ir₂ (Azizi et al., 2012) و TYLCV-Ab (Pakniat et al., 2010) به ترتیب از مزارع گوجه فرنگی بندرعباس و آباده، شش جدایه این نژاد ویروسی از گیاه گوجه فرنگی در مناطق جنوبی ایران (Lefeuvre et al., 2010) و ژنوم کامل سه جدایه از خراسان رضوی (نیشابور و درگز) تعیین توالی و در بانک ژن جهانی پایگاه NCBI ثبت شده است. نژاد  TYLCV-ILکه مخربترین نژاد TYLCV در دنیا محسوب می­شود از مناطق مختلف کشور از گیاه گوجه فرنگی گزارش گردیده است (Bananej et al., 2009).

به طور کلی نژادهای توصیف شده TYLCV تاکنون شامل هفت نژاد بوده که عبارتند از TYLCV-IL (فلسطین اشغالی-ایران)،TYLCV-Mld  (فلسطین اشغالی)، TYLCV-Gez (سودان)، TYLCV-OM (عمان-ایران)، TYLCV-IR (ایران)، TYLCV-Bou (ایران) و TYLCV-Ker (ایران) (Lefeuvre et al., 2010) و از این میان پنج نژاد از هفت نژاد توصیف شده TYLCV از ایران گزارش شده است که بیشترین تعداد نسبت به هر کشور دیگری است . جدایه  TYLCV-Ab از منطقه آباده استان فارس که به عنوان نژاد جدید TYLCV از ایران گزارش شده بود (Pakniat et al., 2010)، امروزه یک واریانت جدید از نژاد  TYLCV-IL محسوب می­شود (Brown et al., 2012). از بین تمام نژادهای شناسایی شده، نژاد TYLCV-IL بیشترین انتشار جغرافیایی در دنیا داشته و دامنه پراکنش آن دنیای قدیم و جدید را دربر می­گیرد (Duffy & Holmes, 2007, 2008; Lefeuvre et al., 2010; Polston et al., 1999).

علف­های هرز و میزبان­های گیاهی خودرو با منشاء بومی یا وارداتی می­توانند توسط تعداد زیادی از ویروس­های گیاهی از جمله بگوموویروس­ها آلوده شده و به عنوان مخازن ویروسی، کانون اولیه­ای برای آلودگی گیاهان زراعی به شمار روند و نیز نقش محوری در ظهور نژادهای ویروسی جدید ایفا نمایند (Mubin et al., 2010; Silva et al., 2012). به دلیل تنوع ژنتیکی بالای گونه­های گیاهی وحشی و در مقایسه با گونه­های زراعی، جمعیت­های ویروسی در این میزبان­های خودرو ممکن است در معرض محدودیت­های انتخابی ویژه­ای قرار داشته باشند (Webster et al., 2007). هم چنین نشان داده شده است که بگوموویروس­های علف هرز تغییرات ژنتیکی بیشتری نسبت به بگوموویروس­های آلوده کننده گیاهان زراعی نشان می­دهند (Silva et al., 2012). پویایی جمعیت ویروسی غالبا منجر به تکامل و ظهور واریانت­های جدید سازگار با محیط می­شود که این امر باعث غلبه ذخیره ژنومی شبه گونه ویروسی بر مقاومت گیاه میزبان شده و در نتیجه منجر به شیوع بیماری ویروسی می­شود (Mansoor et al., 2003). از این رو درک بهتر تنوع جمعیت­های ویروسی در میزبان­های گیاهی خودرو و مقایسه آن با ارقام زراعی پیش شرط در تولید و کاربرد ارقام مقاوم به ویروس است.

در ایران دو گونه علف هرز (Euphorbiaceae) hierosolymitana Chrozophora و (Caryophyllaceae) Hermania sp. به عنوان میزبان­های فاقد علائم ویروس­های مرتبط با بیماری­های پیچیدگی برگ گوجه فرنگی معرفی شده اند (Fazeli et al., 2009). در پژوهش حاضر برای اولین بار سه جدایه­ی نژاد TYLCV-IL از گیاه تاتوره Datura stramonium (Solanaceae) در منطقه بجنورد تعیین توالی گردید و روابط فیلوژنتیکی آنها با سایر جدایه­های این نژاد درایران که همگی از گیاه زراعی گوجه فرنگی جداسازی شده­اند به همراه سایر بگوموویروس­های گوجه فرنگی از ایران و سایر مناطق دنیا  مورد بررسی قرار گرفته است.

مواد و روش­ها

منبع ویروس

نمونه­های برگی از سه گیاه تاتوره دارای علائم موزائیک زردی و پیچیدگی برگ­های جوان به سمت بالا (شکل 1) به همراه یک گیاه تاتوره فاقد علائم به عنوان کنترل منفی از اطراف یک مزرعه رها شده کدوئیان در منطقه بجنورد، خراسان شمالی (GPS: 37°28'23.12"N 57°21'44.65"E) در اواخر تابستان سال 1390 جمع آوری و جهت نگهداری به فریزر 70- منتقل گردید. استخراج DNA کلی از نمونه­های برگی براساس روش تغییر یافته CTAB انجام شد  (Cullings, 1992; Doyle & Doyle, 1987). ردیابی اولیه بگوموویروس در DNA های استخراج شده با PCR و به کمک آغازگرهای عمومی ACcore و AVcore (J.K. Brown ، منتشر نشده) که قادر به تکثیر قطعه 576 نوکلوتیدی بخش مرکزی ژن رمز کننده پروتئین پوششی تقریبا تمام بگوموویروس­ها می­باشد، انجام گرفت. سپس با آغازگرهای  اختصاصی TYC1F (5’-GGG CCT AGA GAC CTG GCC CAC-3’، موقعیت­های نوکلئوتیدی 2076 تا 2071) و  TYC1R (5’-CCGG TAA TAT TAT ACG GAT GGC-3’، موقعیت­های نوکلئوتیدی 150-171) که قادر به تکثیر قطعه 856 نوکلئوتیدی از ناحیه IR و نیمه '5 پروتئین Rep ویروس TYLCV-IL (Lapidot, 2002) است، حضور TYLCV در نمونه­های برگی آلوده تأیید گردید. DNA های استخراجی از گیاه تاتوره فاقد علائم و گوجه فرنگی آلوده به TYLCV-Ir₂ (Azizi et al., 2012) به ترتیب به عنوان کنترل­های منفی و مثبت در PCR مورد استفاده قرار گرفتند.

حضور احتمالی DNA-B و مولکول ماهواره ای βDNA- در نمونه­های برگی به ترتیب با استفاده از آغازگرهای عمومی PBL1v2040/PCRc1 (Rojas et al., 1993) و Beta 01/Beta02 (Briddon et al., 2002) بررسی گردید. نمونه برگی گوجه فرنگی آلوده به Tomato leaf curl Palampour virus (ToLCPav) اهدایی توسط دکتر جهانگیر حیدرنژاد (دانشگاه شهید باهنر کرمان) و نمونه برگی گوجه فرنگی آلوده بهOman Tomato yellow leaf curl- (TYLCV-OM) اهدایی توسط دکتر بهجت نیا (دانشگاه شیراز، شیراز) به ترتیب به عنوان کنترل­های مثبت در ردیابی جزء DNA-B و DNA-β در نمونه­های مورد بررسی به کار رفتند. جهت تکثیر قطعه نوکلئوتیدی هدف با استفاده از یک میکروگرم DNA ژنومی، PCR با حجم نهایی 25 میکرولیتر با غلظت­های نهایی اجزاء واکنش شامل 5/2 میلی مولار MgCl₂، 200 میکرومولار از هر یک از dNTP ها، 4/0 میکرومولار از هر یک از آغازگرها و 625/0 واحد آنزیم Taq پلیمراز (TAKARA BIO Inc., Japan) در دستگاه ترموسایکلر (Biometra 050-801, Tgradient96, Germany) با برنامه اختصاصی هر واکنش انجام گرفت   (Brown et al., 2001; Lapidot, 2002).

تکثیر دایره غلتان[4] (RCA)، همسانه سازی و تعیین توالی ژنوم کامل بگوموویروس

واحدهای چندتایی خطی (Linear concatemers) از ژنوم حلقوی بگوموویروس موجود در DNA کل استخراج شده از بافت­های برگی گیاهان تاتوره با استفاده از DNA پلیمراز Ø29 (Inoue-Nagata et al., 2004) و با کمک کیت تجاری RCA (Templiphi Amplification Kit, GE Healthcare, USA) به روش تکثیر دایره غلتان براساس دستورالعمل سازنده کیت تجاری تکثیر گردیدند. سپس جهت انجام همسانه سازی ژنوم کامل ویروس واحدهای چندتایی خطی ژنوم ویروسی با کمک آنزیم محدود کننده SphI (Promega, USA) برش داده شد تا مونومر ژنوم کامل (kb 8/2) ویروسی به دست آید. مونومرهای خطی برش خورده دارای انتهای چسبنده، طی واکنش اتصال (Ligation) به حامل پلاسمیدی pGEM-3Z f(+) (3197bp)  تیمار شده با آنزیم [5]CIAP (TAKARA BIO Inc., Japan) و خطی شده با هضم آنزیمی SphI متصل گردیدند (Lefeuvre et al., 2010). حامل پلاسمیدی حاوی مونومر ژنوم کامل ویروسی به روش شوک حرارتی به داخل نژاد DH5α باکتری Escherichia coli منتقل گردید (Sambrook & Russel, 2001). کلنی­های مثبت باکتریایی دارای حامل پلاسمیدی نوترکیب به روش غربالگری آبی و سفید انتخاب شده و سپس استخراج پلاسمید از هر یک از باکترها با کمک کیت تجاری استخراج پلاسمید (QIAGEN, USA) انجام گرفت. تعداد سه کلون حاوی ژنوم کامل ویروس (11-1 , 8-1 , 5-2) از گیاهان تاتوره 5 ، 8 و 11 جهت تعیین توالی ژنوم کامل ویروس به شرکت BIONEER، کره جنوبی ارسال و تعیین توالی شدند.

تجزیه و تحلیل توالی­های ویروسی و بازسازی روابط فیلوژنتیکی

قطعات تعیین توالی شده ژنوم جدایه­های ویروسی با کمک نرم افزارهای تجزیه و تحلیل توالی نوکلئوتیدی موجود در بسته نرم افزاری Lasergene (DNA Star Inc., Madison, WI, USA) به شکل یک توالی واحد در هر مورد تنظیم و سپس مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفتند. مقایسه درصد برابری دو به دو ژنوم­های ویروسی در هر مورد جداگانه با  کمک الگوریتم BLASTn موجود در پایگاه NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) با نزدیکترین خویشاوندان میان سایر بگوموویروس­های موجود در GenBank تعیین گردید. هم چنین برای شناسایی قاب باز خواندنی [6]ORFهای هر یک از ژنوم­های ویروسی از نرم افزار اینترنتی ORF Finder موجود در پایگاه NCBI استفاده گردید.

توالی­های ژنوم کامل خویشاوندان نزدیک ایرانی جدایه­های ویروس گیاهان تاتوره شامل نه توالی ژنوم کامل ویروسی جداسازی شده از گیاه زراعی گوجه فرنگی (جدول 1) به همراه هشت توالی ژنوم کامل تعدادی از بگوموویروس­ها (جدول 2) از GenBank پایگاه NCBI بازیابی گردید تا در تجزیه و تحلیل­های بعدی مورد استفاده قرار گیرند. سپس همردیف سازی توالی­های ویروسی در سطح ژنوم کامل، با کمک الگوریتم CLASTAL W موجود در نرم افزار MEGA5 (Tamura et al., 2011) با رعایت پارامترهای پیش فرض همردیفی، صورت گرفت. درخت فیلوژنتیکی به روش اتصال همسایه [7](NJ) به کمک نرم افزار MEGA5 بعد از تعیین مدل تکاملی بهینه برای مجموعه توالی­های همردیف شده و با 1000 تکرار روش آماری Bootstrap ترسیم گردید.

نتایج و بحث

ردیابی TYLCV-IL با کمک PCR در گیاهان  تاتوره، منطقه بجنورد

نتایج PCR با استفاده از جفت آغازگر عمومی ACcore/AVcore و جفت آغازگر اختصاصی TYC1F/TYC1R (شکل 2) نشان داد که هر سه گیاه تاتوره 5 ، 8 و 11 دارای علائم ویروسی (شکل 1) آلودگی به TYLCV  را داشتند. انجام PCR با جفت آغازگرهای عمومی PBL1v2040/PCRc1 و Beta 01/Beta 02 که به ترتیب جهت ردیابی جزء DNA-B و جزء DNA-β به کار رفتند، هیچ گونه نشانه ای از آلودگی بوته­های تاتوره به این اجزاء نشان نداد. بنابراین TYLCV ردیابی شده در گیاهان تاتوره ماهیت یک قسمتی داشت.

جدول 1- جدایه­های ایرانی نژاد TYLCV-IL دارای توالی­های ژنوم کامل منتشر شده در GenBank؛ نام اختصاری هر جدایه، میزبان، منشاء جغرافیایی (استان-ناحیه)، سال انتشار توالی ژنوم، شماره دسترسی ژنوم و اندازه ژنوم کامل.

Table 1- Publicly available Iranian TYLCV-IL sequences in GenBank; their acronym, host species, geographical origin (province-region), published year, GenBank accession number and full-length genome size.

شکل 1- علائم ویروسی موزائیک زردی به همراه پیچ خوردگی برگ­های جوان به سمت بالا در گیاهان تاتوره (A-C) و گیاه تاتوره فاقد علائم (D) نمونه برداری شده در منطقه بجنورد (GPS: 37°28'23.12"N  57°21'44.65"E) در سال 1390.

Figure 1- Viral symptoms of yellow mosaic with upward leaf curl of young leaves in Datura plants (A-C) and asymptomatic Datura plant (D), sampled in Bojnurd region (GPS: 37°28'23.12"N      57°21'44.65"E ) during 2011.

تجزیه و تحلیل توالی­های ویروسی و بازسازی روابط فیلوژنتیکی

نتایج BLASTn نشان داد که ژنوم جدایه­های TYLCV گیاهان تاتوره در منطقه بجنورد بیش از 93٪ ) 94- 98٪) برابری با ژنوم نزدیکترین خویشاوندان خود شامل نه جدایه از گیاه گوجه فرنگی از مناطق شمال شرق (سه جدایه) و جنوب (شش جدایه) ایران و هم چنین بانژاد تیپ IL[IL:Reo:86], X15656  TYLCV- (جداول 1 و 2)   که برای اولین بار از فلسطین اشغالی گزارش شده (Navot et al., 1991) داشتند. میزان برابری حداقل 93٪ به عنوان سطح پایین برابری توالی­ها در تعیین واریانت­های بگوموویروس­ها توسط گروه مطالعات Geminivirus در ICTV در نظر گرفته شده است  (Brown et al., 2012). بنابراین جدایه­های TYLCV گیاهان تاتوره در منطقه بجنورد به عنوان واریانت­های جدید نژاد TYLCV-IL در ایران تعیین گردیدند. در ادامه توالی سه واریانت متفاوت از گیاهان تاتوره شامل 8-1 , 11-1 , 5-2 به GenBank معرفی و شماره دسترسی به آنها تعلق گرفت. شماره دسترسی هر واریانت به همراه نام کامل جدایه ویروسی، نام اختصاصی و اندازه ژنوم آن در جدول شماره 1 درج شده است.

شکل 2- نتایج الکتروفورز ژل آگارز محصول تکثیر شده PCR از DNA کل استخراج شده از بافت برگی گیاهان تاتوره با استفاده از آغازگرهای عمومی AVcore و ACcore (A) و آغازگرهای اختصاصی TYC1F و TYC1R (B).M : نشانگر وزنی مولکولی (GeneRuler DNA Ladder Mix, ready-to-use, Fermentas) (A) و GeneRuler 100 bp DNA Ladder, Fermentas (B)، 5، 8 و 11: گیاهان تاتوره دارای علائم ویروسی نمونه برداری شده در منطقه بجنورد. H و Ir₂: به ترتیب گیاه تاتوره فاقد علائم و گیاه گوجه فرنگی آلوده به TYLCV- Ir2  به عنوان کنترل منفی و مثبت در PCR.

Figure 2- Agarose gel electrophoresis of PCR-amplified products of the total DNA extracted from the leaf tissue of the datura plants, using primers AVcore, ACcore (A) and primers TYC1F, TYC1R (B). M, molecular size marker (GeneRuler DNA Ladder Mix, ready-to-use, Fermentas)  (A) and GeneRuler DNA Ladder, 1 Kb, Fermentas (B) ; 5,8 and 11: symptomatic tomato plants sampled in Bojnurd region; H and Ir2: healthy datura and infected tomato plant with TYLCV-Ir2 as negative and positive controls in PCR, respectively.

درخت فیلوژنتیکی به روش اتصال همسایه (NJ) براساس ژنوم کامل بعد از تعیین بهترین مدل تکاملی (TN93+G) با نرم افزار MEGA5 (شکل 3) نشان داد که گروه مونوفیلتیک جمعیت واریانت­های نژاد TYLCV-IL در ایران صرف نظر از نوع میزبان در دو زیرگروه شامل زیر گروه واریانت­های شمال شرق (زیر گروه I) و زیر گروه واریانت­های جنوب ایران (زیر گروه II) براساس منشاء جغرافیایی گروه بندی شدند. در این گروه بندی فیلوژنتیکی واریانتTYLCV-IL [IR:Sh40:07]  (ناحیه قرمز رنگ در شکل 3) جداسازی شده از شیراز با هیچکدام از زیرگروه­های واریانت­های شمال شرق و جنوب ایران هم گروه نشد بلکه با نژاد تیپ TYLCV-IL  در گروه جداگانه­ای قرار گرفتند.

جدول 2- جدایه­های بگوموویروس­های انتخاب شده که از بانک ژن GenBank توالی ژنوم کامل آنها بازیابی گردیده؛ نام اختصاری هر جدایه، شماره دسترسی و اندازه ژنوم کامل.

Table 2- Selected begomoviral full genomes retrieved from GenBank; their acronym, accession number, and full-length genome size.

قبلاً بررسی روابط فیلوژنتیکی بگوموویروس­های مرتبط با بیماری پیچیدگی زرد برگ گوجه فرنگی (TYLCD) در ایران براساس توالی ناحیه IR آنها را به دو گروه A و B تقسیم کرده (Bananej et al., 2009) و در گروه A ، هفت جدایه که قرابت زیادی به TYLCV-IL فلسطین اشغالی داشته قرار گرفته­اند. تعیین روابط فیلوژنتیکی بگوموویروس­ها براساس توالی­های نواحی ژنومی به جای استفاده از توالی ژنوم کامل منجر به مبهم شدن بررسی روابط فیلوژنتیکی این گروه از ویروس­ها شده است (Silva et al., 2012). در پژوهش حاضر براساس توالی ژنوم کامل واریانت­های نژاد TYLCV-IL در ایران سعی در ارائه تصویری روشن از روابط فیلوژنتیکی این واریانت­ها بوده است که آنها را در یک گروه مونوفیتیک با نوع تکاملی وابسته به جغرافیا در دو  زیر گروهI  و II قرار داده است. بر این اساس مسیر حرکتی از جنوب به شمال شرق برای این واریانت­های ویروسی می­توان متصور شد. به نظر می­رسد ظهور واریانت­های نژاد TYLCV-IL در شمال شرق ایران ناشی از انتشار طبیعی جمعیت­های آلوده به ویروس توسط حشره ناقل، سفیدبالک، یا از طریق انتقال مواد گیاهی آلوده به ویروس از مناطق جنوبی به مناطق شمال شرقی ایران باشد.

شکل 3- درخت روابط فیلوژنتیکی براساس ژنوم کامل واریانت­های نژاد TYLCV-IL جداسازی شده از گیاهان تاتوره در منطقه بجنورد، سایر واریانت­های این نژاد ویروسی جداسازی شده از گوجه فرنگی در مناطق شمال شرق (زیر گروه I) و جنوب (زیر گروه II) ایران به همراه جدایه­هایی از بگوموویروس­های جداسازی شده از گوجه فرنگی در ایران و سایر مناطق دنیا (جدول 1و2) که براساس روش Neighbor-Joining با مدل تکاملی TN93+G ترسیم گردید(Tamura et al., 2011) . درخت فیلوژنتیکی جهت تسهیل در تفسیر در نقطه میانی ریشه داد شده و مقادیر درصدی حمایت Bootstrap با 1000 تکرار در هر گره اصلی نشان داده شده است. خط مقیاس تعداد جایگزینی نوکلئوتید در هر جایگاه را نشان می­دهد.

Figure 3- Phylogenetic tree of the full genome of the TYLCV-IL variants isolated from datura plants in Bojnurd, Iran and from tomato plants in northeastern (Subgroup I) and southern Iran (SubgroupII) plus the selected begomoviruses of tomato from Iran and other parts of the world (Table 1 and 2) was inferred by using the Neighbor-Joining method based on the TN93+G best-fit model (Tamura et al., 2011). The tree is midpoint rooted to enable easier interpretation, and the percentage values of the bootstrap support (1000 iterations) are indicated at each major node. The bar shows the number of substitutions per site.

الگوی انتشار جهانی TYLCV-IL در سال­های اخیر که انتشار این نژاد ویروسی را از شرق دور تا آمریکای شمالی نشان می­دهد (Duffy & Holmes, 2007; Idris et al., 2007; Polston et al., 1999) می­تواند دلیلی بر تأیید انتشار این نژاد در ایران به شمار رود.

از آنجایی که مناطق مجاور ایران به عنوان کانون احتمالی تنوع حال حاضر TYLCV و تکامل پیش رونده آن بشمار می­روند، حضور پنج نژاد TYLCV در ایران از جمله نژاد خطرناک و مخرب TYLCV-IL نشان می­دهد که ایران ممکن است بخشی از مرکز تنوع جهانی TYLCV-IL یا نزدیک به آن باشد (Lefeuvre et al., 2010).  براساس تجزیه و تحلیل صورت گرفته در این مطالعه براساس ژنوم کامل واریانت­های نژاد مخرب در ایران، واریانت TYLCV-IL [IR:Sh40:07] جداسازی شده از شیراز، جنوب ایران را می­توان به عنوان یک پل ژنتیکی بین جدایه­های TYLCV-IL ایران و مناطق مدیترانه­ای پیشنهاد کرد. بررسی فیلوژنتیکی نشان داد که دو جدایه شناخته شده TYLCV-Mld و TYLCV-IR به احتمال زیاد می­توانند به عنوان اجداد جدایه شیراز که به نوبه خود نقش جدی برای جدایه شناخته شده فلسطین اشغالی TYLCV-IL [IL:Reo:86], X15656 ایفا می­کند، به شمار روند. هر چند این یافته جدیدی در جغرافیای ایران محسوب می­شود ولی نیاز به بررسی جدایه­های بیشتری از منطقه شیراز دارد.

در این پژوهش گیاه تاتوره برای اولین بار به عنوان میزبان غیرزراعی نژاد TYLCV-IL در ایران معرفی می­شود. هم چنین واریانت­های جدید نژاد TYLCV-IL از گیاهان تاتوره برای اولین بار از منطقه بجنورد، خراسان شمالی گزارش می­شوند. حضور واریانت­های جدید در مناطقی که قبلا حضور این واریانت­ها در آنجا گزارش نشده است می­تواند تهدیدی برای شیوع بیماری­های گیاهی ویروس باشد که این موضوع در مورد برخی از ویروس­های Geminivirus مشاهده شده است (Varma & Malathi, 2003).

با توجه به اهمیت بالقوه جغرافیای ایران در تکامل واریانت­های TYLCV-IL، نظارت بر جمعیت­های این نژاد ویروسی در علف­های هرز و گیاهان خود رو طبیعی به همراه بررسی­های فیلوژنتیکی ضروری به نظر می­رسد. نتایج این پژوهش نشان داد که گیاهان خودرو طبیعی خانواده Solanaceae نظیر تاتوره منبع ظهور واریانت­های جدید TYLCV-IL می­باشند. هم چنین نقش این میزبان خودرو طبیعی به عنوان ظرف مخلوط کننده جمعیت­های ویروسی فرضیه دیگری است که نیاز به بررسی دارد. بنابراین از نظر اپیدمیولوژی، این میزبان طبیعی به عنوان منبع آلودگی اولیه و هم چنین به عنوان مخزن ویروسی در پیدایش واریانت­های جدید TYLCV-IL می­تواند نقش عمده ای ایفا نموده و در روش­های مدیریت بیماری براساس ارقام مقاوم اختلال ایجاد نماید.

سپاسگزاری

نویسندگان بدینوسیله از آقای دکتر جهانگیر حیدر نژاد گروه گیاه پزشکی دانشگاه شهید با هنر کرمان و دکتر سید علی اکبربهجت نیا گروه گیاه پزشکی دانشگاه شیراز به دلیل ارسال کنترل­های مثبت ویروس­های ToLCPaV  و TYLCV-OM صمیمانه سپاسگزاری می­نمایند. هم چنین از همکاری­های مدیریت و معاونت محترم حفظ نباتات خراسان شمالی در طی مراحل اولیه این پژوهش نهایت سپاس و قدر دانی را دارند.