تولید فرم نوترکیب ایزوفرم تیپ 1 متالوتیونین برنج (OsMTI-1b) در باکتری اشریشیاکلی و بررسی قابلیت اتصال آن به فلز نیکل

تولید فرم نوترکیب ایزوفرم تیپ 1 متالوتیونین برنج (OsMTI-1b) در باکتری اشریشیاکلی و بررسی قابلیت اتصال آن به فلز نیکل

رضوان محمدی نژاد¹، آذر شاه پیری*²، آقافخر میرلوحی³

¹ کارشناس ارشد بیوتکنولوژی کشاورزی، دانشگاه صنعتی اصفهان

²استادیار گروه بیوتکنولوژی کشاورزی، دانشگاه صنعتی اصفهان

³استاد گروه بیوتکنولوژی کشاورزی، دانشگاه صنعتی اصفهان

تاریخ دریافت: 01/08/1391، تاریخ پذیرش: 13/03/1392

چکیده

گیاهان به مکانیسم­های سلولی مختلفی در مقابله با اثر سمی فلزات سنگین مجهز شده­اند. یکی از مهم­ترین این مکانیسم‌‌ها، تولید پروتئین‌ها و پپتیدهای متصل شونده به فلزات، مانند متالوتیونین‌ها (MT) می‌باشد. متالوتیونین‌ها، گروهی از پروتئین‌ها با وزن مولکولی کم و غنی از آمینواسیدهای سیستئین هستند که دارای ظرفیت بالای اتصال به فلزات می­باشند. در این تحقیق توالی‌ کد کننده‌ی ایزوفرمOsMTI-1b  از گیاه برنج، به عنوان گیاه مدل در بین تک لپه‌ای‌ها، در ناقل بیانی pET41a همسانه‌سازی و به میزبان بیانی E. coli سویه‌ی Rosetta (DE3) منتقل شد. پس از القا محیط کشت توسط IPTG، میزان مناسبی از پروتئین­های نوترکیب در فاز محلول تولید و با استفاده از روش کروماتوگرافی جذبی خالص سازی شد. سلول‌‌‌‌‌های باکتری بیان‌کننده‌ی پروتئین‌های نوترکیب در محیط LB حاوی نمک NiCl₂ رشد داده  شدند و منحنی رشد آن‌ها در مقایسه با شاهد ترسیم شد. مقدار کاهش فلز نیکل در محیط کشت و تجمع آن‌ها در رسوب باکتریایی توسط دستگاه طیف سنجی پلاسمای جفت شده‌ی القائی (ICP-AES) به­دست آمد. بر اساس نتایج مشخص گردید بیان ایزوفرمOsMTI-1b  از طریق افزایش تجمع درون سلولی فلز نیکل موجب افزایش تحمل باکتری E. coli به این فلز می­گردد. همچنین، بررسی الگوی جذب نور و واکنش DTNB با پروتئین­های انکوبه شده با فلز نیکل در شرایط این ویترو، تشکیل دستجات فلز/تیول در پروتئین نوترکیب GST-OsMTI-1b را اثبات نمود. یافته­های پژوهش حاضر می­تواند منعکس کننده نقش احتمالی ایزوفرمOsMTI-1b  در تحمل گیاه برنج به تنش فلزات سنگین باشد.

کلمات کلیدی: متالوتیونین، همسانه سازی، بیان دگرساخت پروتئین، فلزات سنگین.

مقدمه

امروزه آلودگی فلزات سنگین در خاک، یک مشکل عمده زیست محیطی محسوب می­شود و بر سلامت انسان، موجودات زنده، تولیدات کشاورزی و زیست بوم اثر دارد. دوام بلند مدت بیولوژیکی و باقی ماندن این فلزات در خاک، سبب انباشته شدن آن‌ها در زنجیره غذایی و در نتیجه تأثیرات منفی بالقوه برای سلامتی انسان می­گردد (Nies 1999; Ghosh & Singh 2005) اگر چه برخی از فلزات سنگین برای رشد گیاهان ضروری هستند اما غلظت‌های بالای این فلزات برای گیاهان سمی است زیرا باعث ایجاد تنش اکسیداتیو و موجب وارد شدن خسارت به قسمت های مختلف گیاه می­گردد. هم­چنین، فلزات سنگین در غلظت‌های بالا جایگزین فلزات ضروری در مولکول هایی نظیر کلروفیل شده و باعث اختلال در فعالیت های حیاتی گیاه می­شوند (Bremner & Beattie1990; Hall 2002). گیاهان به منظور استفاده از فلزات و جلوگیری از سمیت آن‌ها مکانیزم‌های مختلفی را توسعه داده‌اند. یکی از مهم‌ترین این مکانیزم‌ها، کلاته شدن فلزات توسط لیگاندهایی با میل ترکیبی بالاست. کلاته کننده‌های درون‌سلولی و غنی از آمینواسیدهای سیستئین (Cys)، از جمله متالوتیونین‌ها[1] (MTs) نقش مهمی را در این زمینه ایفا می‌کنند (Cobbett & Goldsbrough 2002; Hall 2002; Murphy et al. 1997). ‌MTها گروهی از پروتئین‌های غنی از Cys و با وزن مولکولی کم (5 تا 10 کیلودالتون) هستند که اولین بار در سال 1957 به عنوان پروتئین‌های متصل شده به کادمیوم از بافت کلیه­ی اسب جدا شدند (Margoshes & Vallee 1957). از آن زمان تعداد زیادی ژن MT از موجودات مختلف از جمله حیوانات، گیاهان عالی، قارچ‌ها و برخی پروکاریوت‌ها مثل سیانوباکتری‌ها جداسازی شد. ‌MTهادر گیاهان بر اساس الگوی توزیع آمینو­اسیدهای Cys در چهار تیپ طبقه بندی می شوند. مشخصه­ی پروتئین­های تیپ 1، 2 و 3، وجود دو دمین غنی از Cys در دو انتهای آمینو و کربوکسی پروتئین است که توسط یک ناحیه فاصله انداز[2] عاری از Cys به طول 40-30 آمینواسید از هم جدا می‌شوند. در تیپ 4، آمینو اسیدهای  Cysدر سه دمین و عمدتاً به صورت موتیف­های C-X-C (X هر آمینو اسیدی به غیر از Cys ) پراکنده اند که هرکدام توسط فاصله­اندازهایی با طول 15-10 آمینواسید از هم جدا می­شوند (Cobbett & Goldsbrough 2002). در گیاهان ایزوفرم­های متعددی از MT ها وجود دارند که در بافت ها و مراحل رشدی مختلف گیاه و در اثر القاء عوامل مختلف بیان می­شوند (Cobbett and Goldsbrough 2002, Gue et al. 2003; Freisinger 2007; Yang et al. 2011). نقش دقیق زیستی این پروتئین­ها هنوز مورد بحث است. یکی از نقش های پیشنهادی برای این پروتئین­ها، هوموستازی و سم­زدایی فلزات سنگین می باشد. MTها به دلیل قابلیت بالای اتصال فلز می­توانند کاتیون های دو ظرفیتی بویژه روی و مس مورد نیاز برای متالوآنزیم­ها و فاکتورهای رونویسی را تامین نمایند (Blindauer 2008; Gue 2008). همچنین این پروتئین­ها قادر هستند با کلاته کردن یون­های فلزی غیر ضروری مانند کادمیوم، سلول­ها را از آسیب غلظت­های سمی این فلزات حفظ نمایند (Domenech et al. 2007; Hassinen et al. 2011). از دیگر نقش­های پیشنهاد شده برای MTها، پاکسازی رادیکال­های اکسیژنی و حفاظت سلول­ها در برابر تنش اکسیداتیو می باشد (Akashi et al. 2004; Mir et al. 2004; Xue et al. 2009; Yang et al. 2011). قابل ذکر است که برخلافMT های جانوران، تاکنون تنها تعداد معدودی از پروتئین های MT به طور مستقیم از بافت­های گیاهی استخراج شده اند. مانع اصلی در این زمینه حساسیت بالای این پروتئین­ها به تخریب پروتئولیتیک ( به ویژه در نواحی فاصله انداز) و اکسیداسیون آمینواسیدهای Cys طی مراحل خالص­سازی می­باشد (Mir et al. 2004; Freisinger 2008; Huang and Wang 2010; Chaturvedi et al. 2012). به همین دلیل عمده تحقیقات صورت گرفته در مورد MT‌های گیاهی، به آنالیز بیان ژن‌های کد کننده MT در پاسخ به فلزات مختلف و یا تنش­های محیطی اختصاص یافته است. طی سال های اخیر استفاده از روش­های غیر مستقیم ازجمله بیان دگرساخت ایزوفرم­ها در سیستم های بیان پروکاریوتی و یوکاریوتی و در الحاق با پپتیدها یا پروتئین­های پایدار، امکان بررسی ویژگی های اتصال به فلزات پروتئین­های MT گیاهی را فراهم نموده است (Freisinger 2008, Schicht and Freisinger 2009; Chaturvedi et al. 2012). در ژنوم گیاه برنج تعداد 11 مکان ژنی کد کننده MT از هر چهار تیپ وجود دارد. با این وجود اطلاعات اندکی در مورد نقش این ایزوفروم­ها در پاسخ به تنش فلزات سنگین موجود است. در تحقیق حاضر با انتقال توالی کد کننده ایزوفرم OsMTI-1b (متعلق به تیپ 1 ژن های MT برنج) به باکتریE. coli ، تاثیر بیان این ژن بر میزان مقاومت سلول­های باکتری به فلز سنگین نیکل مورد بررسی قرار گرفت. همچنین، با تولید و خالص سازی پروتئین نوترکیب، خصوصیات اتصال به فلز این ایزوفرم از طریق بررسی الگوی جذب نوری و واکنش رقابتی با ماده 5و5-دیتیوبیس (2 نیتروبنزوئیک) اسید[3] (DTNB)، در شرایط این ویترو مورد مطالعه قرار گرفت.

مواد و روش­ها

همسانه سازی ایزوفرم OsMTI-1b در ناقل بیانی pET41a

توالی DNA کد کننده و همچنین توالی آمینواسیدی ژنOsMTI-1b  از پایگاه داده­ی ژنوم برنج (http://rice.plantbiology.msu.edu/) به دست آمد. جایگاه دو آنزیم‌ برشی HindIII و EcoRI به ترتیب در دو انتهای '3 و'5 توالی‌ مذکور اضافه گردید و توالی حاصل توسط شرکت GenScript در پلاسمید pUC57 سنتز شد. پلاسمید حامل ژن سنتز شده از طریق روش شوک الکتریکی به سلول­های مستعد شده باکتری E. coli سویه DH5α منتقل و تکثیر شد. جهت بیان ژنOsMTI-1b ، قطعه مذکور از پلاسمیدpUC57-OsMTI-1b  توسط آنزیم­های برشی HindIII و EcoRI جدا شد و در ناقل بیانی pET41a ( تهیه شده از انستیتو پاستور ایران) که با آنزیم­های مشابه خطی شده بود، همسانه سازی گردید. صحت همسانه­سازی از طریق واکنش برش آنزیمی مورد بررسی قرار گرفت. به منظور تائید صحت توالی نوکلئوتیدی، توالی ژن در پلاسمید نوترکیبpET-OsMTI-1b  توسط شرکت Milligene فرانسه توالی یابی شد.

بیان و خالص سازی پروتئین­های نوترکیب

جهت تولید پروتئین، پلاسمید نوترکیبpET-OsMTI-1b  و هم­چنین پلاسمید  pET41a فاقد قطعه به روش شوک الکتریکی به سلول­های مستعد باکتریE. coli  سویه­ی Rossete (DE3) منتقل شدند. به دلیل حضور ژن مقاومت به آنتی بیوتیک کانامایسین بر روی پلاسمید pET41a و همچنین مقاومت باکتری Rossete (DE3) به آنتی بیوتیک کلرامفنیکل، سلول های باکتری ترانسفورم شده در محیط LB حاوی آنتی بیوتیک کانامایسین (50 میلی گرم بر لیتر) و کلرامفنیکل (5 میلی گرم بر لیتر) در دمای 37 درجه سانتیگراد بر روی انکوباتور شیکردار با 180 دور در دقیقه کشت شدند. هنگامی که OD₆₀₀به 6/0 رسید، IPTGبه عنوان ماده­ی القاء کننده به غلظت نهایی 1/0 میلی مولار به کشت‌ها اضافه شد. در فواصل زمانی مختلف نمونهبرداری از سوسپانسیون باکتری در لوله‌های اپندورف 5/1 میلی لیتری صورت گرفت. لوله‌ها به مدت 10 دقیقه در 12000 دور در دقیقه در دمای 4 درجه سانتیگراد سانتریفوژ گردیدند و سپس محلول رویی لوله‎ها دور ریخته ‌و رسوب حاصل در 200 میکرولیتر از بافر TE (10 میلی مولار تریس-اسید کلریدریک ، 1 میلی مولار EDTA، 8 =pH) سوسپانسیون شد. به منظور استخراج پروتئین­های محلول، دیواره سلول‌های باکتری با استفاده از روش سونیکیشن تخریب ‌شد و پس از سانتریفیوژ به مدت 10 دقیقه در 12000 دور در دقیقه در دمای 4 درجه سانتیگراد، فاز رویی برای بررسی میزان بیان پروتئین‌های محلول بر روی ژل SDS-PAGE 12% بارگذاری گردید. به منظور انجام عملیات خالص سازی پروتئین، سلول های باکتری نوترکیب و هم­چنین باکتری شاهد در حجم زیاد کشت گردیدند و پروتئین­های فاز محلول مطابق مرحله قبل استخراج شدند. خالص سازی پروتئین­های هدف از سایر پروتئین­های میزبان باکتریایی با استفاده از روش کروماتوگرافی جذبی و به کمک ستون­های His-Trap HP  (Amersham Biosciences) انجام شد. بدین منظور، ابتدا ستون­ها با استفاده از بافر بارگذاری A (ایمیدازول 10 میلی مولار، کلرید سدیم 500 میلی مولار و 30 میلی مولار تریس-اسید کلریدریک، 8 =pH) به تعادل رسیدند. سپس کل پروتئین­های محلول استخراج شده از ستون عبور داده شد. به منظور حذف پروتئین­هایی که به صورت غیر اختصاصی به ستون اتصال یافتند، ستون با استفاده از محلول حاوی 10% بافر B (ایمیدازول 400 میلی مولار، کلرید سدیم 500 میلی مولار و 30 میلی مولار تریس-اسید کلریدریک، 8 =pH) و 90% بافر A شستشو داده شد. در مرحله بعد جهت جدا نمودن پروتئین هدف، ستون با بافر جدا کننده C (مخلوط 10 تا 70% بافر B و A ) شستشو داده شد و هر میلی لیتر خروجی ستون در لوله­های اپندورف 5/1 میلیی لیتری جمع آوری شد. میزان خلوص پروتئین­های مورد نظر با استفاده از ژل SDS-PAGE 12% مورد بررسی قرار گرفت. برای حذف ایمیدازول و نمک کلرید سدیم، نمونه­های پروتئینی خالص شده توسط کیسه­های دیالیز (Sigma) با ممانعت عبوری 12 کیلو دالتون در برابر محلول 10 میلی مولار تریس-اسید کلریدریک، 8 =pH، به مدت 16 ساعت در دمای 4 درجه سانتیگراد دیالیز شدند. غلظت پروتئین­های نوترکیب خالص GST و GST-OsMTI-1b با اندازه گیری میزان جذب نور در طول موج 280 نانومتر و با استفاده از قانون بیر-لمبرت محاسبه گردید.

بررسی میزان تحمل سلول‌های بیان کننده پروتئین‌های نوترکیب به فلزات سنگین

به منظور بررسی اثر بیان ایزوفرم OsMTI-1b بر تحمل سلول‌های باکتری به فلز نیکل، ابتدا غلظت‌های مختلفی از نمک ‌NiCl₂ بر روی رشد باکتری شاهد (سلول‌های حاوی پلاسمید pET41a) اندازه‌گیری شد. پس از انتخاب غلظت‌ مناسب، سلول‌های باکتری حامل پلاسمید ‌pET-OsMTI-1b و هم­چنین باکتری شاهد در محیط LB به همراه آنتی بیوتیک‌های کانامایسین (50 میلی گرم بر لیتر) و کلرامفنیکل (5 میلی گرم بر لیتر) رشد یافتند و هنگامی که OD₆₀₀به 6/0 رسید، بیان پروتئین­های نوترکیب توسط IPTG به غلظت نهایی 1/0 میلی مولار القاء گردید. پس از گذشت 20 دقیقه غلظت 5/2 میلی مولار NiCl₂ به محیط‌های کشت اضافه شد و میزان رشد باکتری‌ها از طریق اندازه گیری جذب نوری در طول موج 600 نانومتر توسط دستگاه اسپکتروفتومتر (Beckman, DU 530) اندازه­گیری و منحنی رشد رسم شد. همچنین به منظور بررسی توانایی باکتری‌های نوترکیب در حذف فلز از محیط کشت، در دو زمان اضافه شدن فلز به محیط (T0) و شش ساعت پس از آن (T1) نمونه‌هایی به حجم 10 میلی لیتر تهیه و در 6000 دور در دقیقه به مدت 25 دقیقه سانتریفیوژ شدند. فاز رویی به دقت از فاز رسوب جداشده و در ظرف جداگانه ریخته شد. نمونه‌های مربوط به فاز رسوب باکتری و فاز رویی به مدت 24 ساعت در آون 110 درجه سانتیگراد قرار گرفتند. سپس به خاکستر حاصل یک میلی‌لیتر اسید نیتریک غلیظ اضافه شد و به مدت دو ساعت در حمام آب 95 درجه سانتیگراد گرماگذاری شدند. بعد از این مدت مخلوط حاصل در دمای اتاق سرد شده و با آب مقطر دیونیزه به حجم نهایی 10 میلی لیتر رسانده شد. میزان فلز با استفاده از دستگاه طیف سنجی جفت شده‌ی القائی (ICP-AES) اندازه گیری شد.

بررسی قابلیت اتصال پروتئین نوترکیب GST-OsMTI-1b به فلز نیکل در شرایط این ویترو

جهت بررسی ظرفیت اتصال پروتئین­های نوترکیب به فلز نیکل، ابتدا فرم عاری از فلز (آپو پروتئین) نمونه­های پروتئینی شاهد (GST) و پروتئین الحاقی GST-OsMTI-1b به روش ذکر شده در منابع تولید گردید (Dallinger et al. 2001; Toriumi et al. 2005). هر کدام از نمونه­های پروتئینی به مدت 20 دقیقه در دمای محیط با غلظت 50 میلی مولار دی تیوتریتول (DTT) انکوبه شدند. سپس به منظور جدا شدن فلزات احتمالی اتصال یافته به پروتئین­های نوترکیب، pH نمونه­ها به کمک اسید کلریدیک به مقدار 2 کاهش یافت و متعاقباً جهت حذف فلزات رها شده در محیط، نمونه­های پروتئینی در برابر محلول 1/0 نرمال اسید کلریدیک، 2 =pH، به مدت 16 ساعت در دمای 4 درجه سانتیگراد دیالیز شدند. برای تولید کمپلکس­های متصل شده به فلز نیکل، میزان 30 میکرومولار از هر کدام از نمونه­های apo-GST و apo-GST-OsMTI-1b در حضور یون­های فلز نیکل به نسبت مولی 10: 1 (پروتئین به فلز) در دمای 4 درجه سانتیگراد انکوبه شدند. سپس pH نمونه­ها توسط محلول 200 میلی مولار تریس-اسید کلریدریک به تدریج افزایش یافت و در مقدار 8 ثابت گردید. به منظور حذف فلزات اتصال نیافته، نمونه­های پروتئینی در برابر محلول 10 میلی مولار تریس-اسید کلریدریک، 8 =pH به مدت 16 ساعت در دمای 4 درجه سانتیگراد دیالیز شدند. الگوی طیف جذبی نمونه های آپوپروتئین و نمونه­های پروتئینی انکوبه شده با فلز نیکل، در محدوده طول موج 220 تا 350 نانو متر توسط دستگاه اسپکتوفتومتر ثبت گردید.

واکنش با DTNB

واکنش رقابتی نمونه­های  apo-GST-OsMTI-1bو Ni/GST-OsMTI-1b با DTNB مطابق با روش پیشنهادی Emoto et al. (1996) انجام شد. میزان 5/1 نانومول از هر کدام از نمونه­های پروتئینی در 300 میکرولیتر محلول 10 میلی مولار تریس-اسید کلریدریک، 8 =pH، رقیق گردید. با اضافه شدن 75 نانومول DTNB به محلول حاصل، واکنش آغاز گردید و تغییرات جذب نور در طول موج 412 نانومتر توسط دستگاه اسپکتوفتومتر در دمای اتاق ثبت گردید. به عنوان واکنش کنترل، مخلوط فاقد نمونه­ی پروتئینی استفاده گردید.

نتایج

همسانه سازی ایزوفرم OsMTI-1b

ایزوفرم مورد بررسی در این پژوهش، متعلق به تیپ 1 ژن -های متالوتیونین گیاه برنج (شماره ثبت در بانک جهانی ژن AK059587) می باشد که پیش از این با عنوان OsMTI-1b نام گذاری شده است (Zhou et al. 2006). توالی ژن کد کننده این ایزوفرم bp 219 بوده و پروتئینی به طول 72 آمینواسید با وزن مولکولی 13/7 کیلودالتون را سنتز می­نماید. همانند دیگر ایزوفرم های MT تیپ 1 گیاهی، این ایزوفرم نیز در توالی خود دارای 12 آمینواسید سیستئین می­باشد که به طور مساوی در دو انتهای آمینو و کربوکسی پروتئین به ترتیب با آرایشCXCXXXCXCXXXCXC  و CXCXXXCXCXXCXC (X بیانگر هر آمینواسید به غیر از سیستئین می­باشد) توزیع یافته­اند. دو ناحیه غنی از سیستئین در این پروتئین، توسط یک ناحیه فاصله انداز عاری از سیستئین به طول 41 آمینواسید از یکدیگر جدا شده­اند. توالی کد کننده این ایزوفرم به صورت مصنوعی سنتز شد و در ناقل بیانی pET41a در الحاق با توالی کد کننده سه دنباله ی پروتئینی شامل، His-tag، S-tag و GST-tag ادغام گردید. به منظور تائید صحت همسانه­سازی از روش هضم آنزیمی استفاده شد. شکل 1، الگوی الکتروفورز محصول برش آنزیمی پلاسمید pET-OsMTI-1b توسط آنزیم­های EcoRI  و HindIII را نشان می­دهد. جدا شدن قطعه به طول  bp231 از پلاسمید بیانگر صحت همانندسازی ژن OsMTI-1b در پلاسمید pET41a می­باشد. صحت ترادف نوکلئوتیدی قطعه ادغام شده نیز از طریق توالی یابی مورد تائید قرار گرفت.

بیان دگرساخت و خالص سازی پروتئین­های نوترکیب GST و GST-OsMTI-1b

جهت تولید پروتئین نوترکیب، پلاسمید pET-OsMTI-1b و همچنین پلاسمیدpET41a  فاقد ژن به میزبان بیانی E. coli سویه­ی Rosettea (DE3) منتقل شدند. پس از القاء کشت های باکتریایی توسط IPTG، پروتئین­های محلول سیتوپلاسمی استخراج و بر روی ژلSDS-PAGE  بارگذاری شدند. بیان دنباله­های پروتئینی موجود بر روی پلاسمید pET41a (که به منظور تسهیل در نامگذاری، با نام کلی GST در طی این پژوهش مشخص گردیدند) از سویه­ی حاوی پلاسمید فاقد ژن و پروتئین الحاقی GST-OsMTI-1b از سویه های ترانسفورم شده با پلاسمید حاوی ژن OsMTI-1b، مورد انتظار بود (شکل 2). وزن مولکولی پروتئین­های GST و  GST-OsMTI-1b به ترتیب 5/35 و 9/39 کیلودالتون پیش بینی شد (http://web.expasy.org/protparam). وجود باندهای پروتئینی با وزن مولکولی مورد نظر بر روی ژل SDS-PAGE بیانگر تولید موفق پروتئین­های نوترکیب در فاز محلول بود (شکل 3). دنباله­ی GST به دلیل اندازه نسبتاً بزرگ و حلالیت مناسب خود به عنوان شریک الحاقی مناسب جهت تولید پروتئین­های پایدار و محلول ذکر شده است (Esposito & Chatterjee, 2006). پروتئین­های نوترکیب تولید شده در فاز محلول توسط روش کروماتوگرافی جذبی خالص شدند. میزان تولید پروتئین خالص به ترتیب 10 و 20 میلی گرم بر لیتر برای پروتئین­های GST و GST-OsMTI-1b محاسبه شد.

شکل 1- الکتروفورز محصول واکنش هضم آنزیمی پلاسمید نوترکیب pET-OsMTI-1b با آنزیم های HindIII و EcoRI بر روی ژل آگارز 1 درصد. ستون 1 : 100 bp DNA Ladder، ستون 2: قطعه  OsMTI-1b به طول  bp231 جدا شده از پلاسمید pET-OsMTI-1b پس از برش با آنزیم های HindIII و EcoRI..

Figure 1- Restriction enzyme analysis of recombinant pET-OsMTI-1b plasmid with EcoRI and EcoRI enzymes. Lane 1: 100 bp plus DNA Ladder, Lane 2: the 231 bp fragment corresponding to OsMTI-1b, isolated from digested pET-OsMTI-1b plasmid.

شکل 2- نمای شماتیک نواحی بیان شونده بر روی پلاسمید pET41a (پلاسمید شاهد) وpET-OsMTI-1b  که به ترتیب منجر به سنتز پروتئین هایی با وزن مولولکولی 5/35 (با نام قراردای GST) و 9/39 کیلودالتون (با نام قراردادی GST-OsMTI-1b) می گردد.

Figure 2- Schematic illustration of expression regions on pET41-a (control) and pET-OsMTI-1b plasmids, which encode for 35.5 (designated as GST) and 39.9 KDa (designated as GST-OsMTI-1b) proteins, respectively.

شکل 3- آنالیز SDS-PAGE  بیان و خالص سازی پروتئین ها ی نوترکیب GST  و GST-OSMTI-1b تولید شده در باکتری E. coli سویه Rosetta (DE3). PM: نشانگر پروتئینی؛ محتوای پروتئین های محلول استخراج شده در زمان های صفر، 1، 2، 3 و 4 ساعت پس از القاء IPTG از سلول های باکتری حامل پلاسمید pET-OsMTI-1b (ستون های 1-5) و pET41a (ستون های 6-10)؛ پروتئین های GST-OSMTI-1b و GST  خالص شده (ستون های 11و 12).

Figure 3- SDS-PAGE analysis for verification of expression and purification of GST and GST-OsMT fusion proteins overexpressed in E. coli Rosetta (DE3) cells. PM, protein marker; Total soluble proteins extracted at 0, 1, 2, 3 and 4 hours after in induction with IPTG, from E. coli cells harboring pET-OsMTI-1b (lanes 1-5) and pET41a (lanes 6-10); Purified GST-OsMTI-1b and GST (lanes 11 and 12).

تاثیر بیان پروتئین نوترکیب GST-OSMTI-1b بر میزان تحمل باکتری E. coli به فلز نیکل

منحنی رشد سلول­های باکتری شاهد (سلول­های ترانسفورم شده با پلاسمید pET41a فاقد ژن) در حضور غلظت­های مختلف نمک NiCl₂ ترسیم شد. بر اساس نتایج، آستانه­ی تحمل این سلول ها برای فلز نیکل غلظت 5/2 میلی مولار تعیین شد (شکل 4-A). در نتیجه، میزان رشد سلول­های ترانسفورم شده با پلاسمید pET-OsMTI-1b در مقایسه با سلول­های شاهد در غلظت 5/2 میلی مولار نمک NiCl₂ بررسی شد. در این شرایط در حالی که میزان رشد سلول­های شاهد به شدت کاهش یافت، سلول­های حاوی پلاسمید pET-OsMTI-1b رشد عادی داشتند و میزان OD نهایی آن ها به 81/1 رسید که در مقایسه با سلول های شاهد 8/50% بیشتر بود (شکل 4-B).

 به منظور اطمینان از این که افزایش مقاومت مشاهده شده در سلول­های بیان کننده پروتئین GST-OsMTI-1b به فلز نیکل در اثر افزایش ظرفیت این سلول­ها برای جذب فلز می­باشد، میزان فلز تجمع یافته در سلول و همچنین کاهش فلز از محیط کشت در دو زمان اضافه شدن فلز به محیط (T0) و شش ساعت پس از آن (T1) اندازه گیری شد. بر اساس نتایج، در زمان T0 میزان تجمع فلز نیکل در سلول های بیان کننده پروتئین GST-OsMTI-1b و سلول­های شاهد بسیار اندک و تقریباً مشابه بود. اما در زمان T1، سلول­های بیان کننده پروتئین GST-OsMTI-1b، 16/14% از فلز به کار رفته در محیط کشت را در خود تجمع دادند که این میزان شش برابر میزان تجمع فلز در سلول­های باکتری شاهد بود (شکل 5-A). بررسی میزان فلز نیکل در محیط کشت نیز بیانگر کاهش قابل توجه این فلز در زمان T1 از محیط کشت سلول­های بیان کننده پروتئین بود (شکل 5-B).

شکل 4- A) تأثیر غلظت­های مختلف نمک NiCl₂بر منحنی رشد باکتری شاهد (سلول های حامل پلاسمید pET41a)؛ B) تأثیر بیان پروتئین نوترکیب GST-OsMTI-1b بر میزان تحمل سلول های باکتری E. coli در برابر غلظت 5/2 میلی مولار فلز نیکل.

Figure 4- A) Effect of different concentrations of NiCl₂ on growth curve of E. coli cells harboring pET41a plasmid (control cells); B) Effect of GST-OsMTI-1b overexpression on E. coli cells tolerance to 2.5 mM of Ni⁺².

شکل 5-  بررسی میزان فلز نیکل در رسوب باکتریایی و محیط کشت سلول های بیان کننده پروتئین­های GST (شاهد) و GST-OsMTI-1b. A) میزان تجمع نیکل در رسوب سلول های باکتری در زمان­های صفر (T0) و شش ساعت پس از (T1) اضافه کردن فلز و IPTG  به محیط کشت؛ B) میزان فلز در محیط­های کشت در زمان های T0 و T1. هر داده میانگین (± انحراف معیار) دو آزمایش مستقل می­باشد.

Figure 5- Accumulation of Ni⁺² in the strains expressing GST and GST-OsMTI-1b A, Contents of metals in the cells at 0 (T0) and 6 h (T1) after addition of metals and IPTG to the medium. B, Contents of metals in the medium at T0 and T1. Each data represents the mean ± SD obtained from two independent experiments.

بررسی الگوی جذب نور پروتئین­های انکوبه شده با فلز نیکل

قابلیت اتصال پروتئین نوترکیب GST-OsMTI-1b به فلز نیکل، از طریق انکوباسیون مستقیم این پروتئین در حضور فلز نیکل در شرایط این ویترو مورد ارزیابی قرار گرفت. اتصال یون های فلزی به گروه­های تیول (SH) پروتئین­های MT موجب تغییر در الگوی جذب نور این پروتئین ها می­گردد که موقعیت و شدت تغییرات به ماهیت و میزان فلز اتصال یافته بستگی دارد. این ویژگی تحت عنوان " انتقال بار لیگاند به فلز^[4] " (LMCT) شناخته می­شود (Freisinger 2008, 2011). طبق مطالعات پیشین، تشکیل دستجات تیول/نیکل (S → Ni⁺²) در پروتئین­های MT با افزایش جذب نور در محدوده طول موج های 290 و 316 نانومتر همراه است (Cavet et al. 2003; Cun et al. 2008). همانطور که در شکل 6 مشاهده میگردد، طیف نوری نمونه­های پروتئینی Ni/ GST-OsMTI-1b در مقایسه با نمونه apo-GST-OsMTI-1b افزایش جذب مشخصی را در محدوده­ی ذکر شده برای دستجات S → Ni⁺² نشان می­دهد که بیانگر اتصال یون­های فلز نیکل به پروتئین نوترکیب GST-OsMTI-1b می باشد. با مقایسه طیف جذب نور نمونه های apo-GST و Ni/ GST تغییر جذب قابل توجهی مشاهده نگردید. این امر نشان دهنده­ی عدم تأثیر دنباله­ی پروتئینی بر خصوصیات و قابلیت اتصال به فلز ایزوفرم OsMTI-1b می­باشد.

بررسی قابلیت اتصال پروتئین­های نوترکیب به نیکل از طریق واکنش با DTNB

توانایی پروتئین GST-OsMTI-1b برای اتصال به فلز نیکل از طریق واکنش رقابتی به DTNB نیز مورد بررسی قرار گرفت. در طی این واکنش، گروه های تیول آزاد پروتئین موجب احیاء شدن پل دی سولفیدی موجود در ساختار DTNB می­شود. در نتیجه آن، آنیون 2-نیترو-5- تیوبنزوئیک اسید^[5] (TNB^-) تولید می­گردد که در طول موج 412 نانومتر دارای حداکثر جذب می­باشد (Emoto et al. 1996; Toriumi et al. 2005). شکل 7، الگوی واکنش نمونه­های پروتئینی apo-GST-OsMTI-1b و Ni/ GST-OsMTI-1b با DTNB را نشان می­دهد. بر اساس نتایج، واکنش نمونه­ی apo-GST-OsMTI-1b با DTNB با سرعت اولیه 81/2190 نانومول بر دقیقه انجام شد و پس از اتمام واکنش میزان جذب نور در طول موج 412 نانومتر به 372/0 رسید. درحالی که در واکنش نمونه­ی Ni/ GST-OsMTI-1b با DTNB میزان سرعت اولیه واکنش 7/4 برابر کاهش یافت (7/466 نانومول بر دقیقه) و میزان جذب نهایی در طول موج 412 نانومتر به 26/0 رسید. این نتایج بیانگر حضور وجود گروه­های تیول آزاد کمتر در نمونه پروتئین GST-OsMTI-1b انکوبه شده با فلز نیکل و به عبارت دیگر بیانگر ظرفیت بالای این پروتئین برای اتصال به فلز نیکل می­باشد.

بحث

یکی از مهم­ترین مکانیسم­های مقابله با تنش فلزات سنگین در موجودات، تولید کلاته کننده­های درون سلولی غنی از آمینواسیدهای Cys مانند MTها می­باشد. تعداد زیاد و آرایش ویژه آمینواسیدهای Cys در این پروتئین_­ها امکان اتصال آن­ها به فلزات را فراهم نموده است (Cobbett & Goldsbrough 2002; Hall 2002). در گیاهان ایزوفرم­های متعدد MT وجود دارد که در اثر عوامل گوناگون، در بافت­ها و مراحل رشدی مختلف گیاه بیان می­شوند. با این وجود استخراج و بررسی مستقیم ویژگی­های این پروتئین­ها از منابع گیاهی به دلیل حساسیت بالای آن­ها به تخریب پروتئولیتیک و اکسید شدن آمینواسیدهای سیستئین در حضور اکسیژن، بسیار مشکل می­باشد (Freisinger 2008; Huang and Wang 2010; Chaturvedi et al. 2012). بیان دگرساخت ایزوفرم­های MT به عنوان پروتئین­های الحاقی در میزبان­هایی نظیر E. coli، مخمر و آرابیدوپسیس، به عنوان راهکاری به منظور تسهیل تولید، خالص سازی و بررسی ویژگی های بیوشیمیایی این پروتئین­ها در حال گسترش می­باشد.

شکل 6- الگوی جذب نور پروتئین های GST و GST-OsMTI-1b انکوبه شده با یون های فلزی نیکل. افزایش جذب نور در طیف نوری پروتئین Ni/GST-OsMTI-1b ( ناحیه مشخص شده توسط فلش) بیانگر تشکیل دستجات نیکل/تیول در ساختار این پروتئین می باشد.

Figure 6- UV absorption spectra of GST and GST-OsMTI-1b proteins incubated with Ni⁺² ions. The intensified absorptions in spectrum Ni/GST-OsMTI-1b complexes (shown with arrow), indicate the formation of Ni-thiolate clusters in protein.

شکل 7-  مقایسه واکنش پروتئین GST-OsMTI-1b با DTNB، در دو فرم آپو و انکوبه شده با فلز نیکل. واکنش شامل 5/1 نانومول از نمونه پروتئینی و 75 نانو مول DTNB می باشد. پیشرفت واکنش با اندازه گیری میزان جذب در طول موج 412 نانومتر بررسی شد.

Figure 7- Comparing the reactivity of apo and Ni-incubated forms of GST-OsMTI-1b proteins with DTNB. 1.5 nmol of each protein sample was reacted with 75 nmol of DTNB and the absorbance was measured spectrophotometrically at 412 nm.

در پژوهش حاضر، تاثیر بیان دگرساخت ایزوفرم OsMTI-1b از تیپ 1 ژن های MT برنج، بر میزان تحمل باکتری E. coli به فلز نیکل مورد بررسی قرار گرفت. دنباله­ی پروتئینی GST به دلیل حلالیت بالا و پایداری در برابر تخریب پروتئولیتیک (Esposito & Chatterjee 2006)، به عنوان شریک الحاقی در انتهای آمینی پروتئین مورد استفاده قرار گرفت که نتیجه آن تولید میزان قابل توجهی از فرم محلول پروتئین­هایGST  و GST-OsMTI-1b در سیتوپلاسم سلول­های  E. coli بود. ترسیم منحنی رشد سلول­های باکتری در حضور فلز نیکل نشان داد بیان ایزوفرم OsMTI-1b تاثیر قابل توجهی در افزایش تحمل باکتری E. coli به این فلز دارد. تاثیر بیان ژن های MT گیاهی در افزایش تحمل باکتری E. coli به برخی فلزات سنگین در تعدادی از مطالعات پیشین نیز گزارش شده است. Bilecen et al. (2005) نیز بیان داشتند بیان ایزوفرمdMT  گندم دوروم (Triticum durum) در الحاق با دنباله­ی GST، آستانه تحمل باکتری E. coli به فلز کادمیوم را به میزان چهار برابر افزایش بخشید. به طور مشابه بیان فراوان پروتئین GST-SbMT-2 از گیاه هالوفیت Salicornia brachiata موجب افزایش قابل توجه تحمل سلول­های باکتری  E. coli به فلزات روی، مس و کادمیوم شد (Chaturvedi et al. 2012). با اندازه­گیری میزان فلز در سلول­های بیان کننده پروتئین­های نوترکیب و محیط کشت مشخص گردید که بیان فراوان ایزوفرم OsMTI-1b سلول­های باکتری را قادر می­سازد میزان قابل توجهی از فلز نیکل را از محیط کشت جذب نموده و در خود تجمع دهند. بنابراین، به نظر می­رسد تشکیل ساختارهای Ni/GST-OsMTI-1b در محیط داخل سلولی با کلاته نمودن نیکل، موجب حفاظت قسمت­های مختلف سلول از آسیب این فلز و افزایش تحمل سلول های باکتری می­گردد. در بررسی انجام شده توسط ( 2011)  Sekhar et al. نیز بیان ایزوفرم CcMT1 از گیاه Cajanus cajan در باکتری E. coli، میزان تحمل این باکتری به فلزات کادمیوم و مس را از طریق افزایش تجمع درون سلولی این فلزات افزایش بخشید. همچنین بیان ایزوفرمMT3  از گیاه Elaeis guineensis در الحاق با دنباله­ی GST، میزان تجمع فلز روی در سلول­های باکتری E. coli را سه برابر افزایش داد (Abdullah et al. 2002). در پژوهش دیگر نیز، بیان ژن AhMT2a از گیاه Arachis hypogae موجب افزایش تحمل باکتری  E. coli به فلزات کادمیوم، مس و سرب از طریق افزایش تجمع این فلزات در سیتوپلاسم سلول­های باکتری شد (Quan et al. 2007).

به منظور بررسی توانایی پروتئین نوترکیب GST-OsMTI-1b برای اتصال به فلزات در شرایط این ویترو، فرم عاری از فلز آن تولید و در محیط حاوی فلز نیکل انکوبه شد. افزایش شدت جذب نور در محدوده LMCT مورد انتظار برای اتصال یون­های نیکل به گروه های تیول (S → Ni⁺²) در الگوی جذب نور پروتئین GST-OsMTI-1b، مؤید تشکیل دستجات تیول/ نیکل در ساختار این پروتئین بود. از سوی دیگر واکنش با DTNB، حضور گروه­های تیول آزاد کمتر در پروتئین GST-OsMTI-1b انکوبه شده با فلز نیکل در مقایسه با نمونه آپوپروتئین را تائید نمود.

یافته­های پژوهش حاضر قابلیت بالای ایزوفرم OsMTI-1b در کلاته نمودن فلز نیکل و تاثیر بیان آن در افزایش تحمل باکتری  E. coliبه تنش این فلز را اثبات نمود. این نتایج می­تواند منعکس کننده نقش این پروتئین در حفاظت سلول­های گیاه برنج در برابر تنش فلزات باشد. با توجه به آلودگی روزافزون مزارع کشاورزی به فلزات سنگین و همچنین جایگاه ویژه برنج در بین غلات، استفاده از روش ارائه شده در این تحقیق به منظور بررسی نقش ایزوفرم­های دیگر برنج تحت شرایط تنش فلزات مختلف، می­تواند در اصلاح ارقام مقام برنج برای کشت در مناطق آلوده مؤثر باشد. از سوی دیگر با توجه به توانایی بالای سلول­های باکتری ترانسفورم شده با ایزوفرم OsMTI-1b در تجمع فلز، این امکان وجود دارد که با دست ورزی میکروارگانیسم­های مناسب، بتوان از ظرفیت بالای اتصال به فلزات این پروتئین­ها برای پالایش زیستی مناطق آلوده به فلزات استفاده نمود.