جدا‌سازی و همسانه‌سازی ژن منگنزپراکسیداز (mnp) از قارچ صدفی خوراکی

مژگان پروندی*[1]، محمد فارسی²، امین میرشمسی³، محسن اشرفی⁴

¹دانش‌آموخته کارشناسی‌ارشد بیوتکنولوژی کشاورزی، دانشکده کشاورزی، دانشگاه فردوسی مشهد

²استاد گروه بیوتکنولوژی، دانشکده کشاورزی، دانشگاه فردوسی مشهد

³استادیار گروه بیوتکنولوژی، دانشکده کشاورزی، دانشگاه فردوسی مشهد

⁴دانشجوی دکتری بیوتکنولوژی، دانشکده کشاورزی، دانشگاه زنجان

تاریخ دریافت: 27/11/1392، تاریخ پذیرش: 11/08/1393

چکیده

در قارچ‌ صدفی خوراکی (Pleurotus ostreatus) آنزیم‌های مختلفی از ابتدای رشد میسلیومی تا انتهای دوره‌ی میوه‌دهی، تجزیه ترکیبات لیگنینی را در محیط کشت بر عهده دارند. چوب، بقایای گیاهی و بیشتر ضایعات گیاهی دیگر در طبیعت تحت عنوان ترکیبات لیگنوسلولزی نامیده می‌شوند. لیگنوسلولز عمدتاً از سلولز، همی‌سلولز و لیگنین تشکیل می‌شود. آنزیم منگنزپراکسیداز (EC:1:11:1:13)، یکی از عمومی‌ترین پراکسیدازهای تخریب‌کننده لیگنین است که توسط اکثر قارچ‌های تجزیه‌کننده چوب و نیز بسیاری از قارچ‌های تجزیه‌کننده کمپوست تولید می‌شود. در این پژوهش به‌منظور جداسازی cDNA­ی ژن mnp قارچ صدفی خوراکی (P. ostreatus var. florida)، استخراج  RNAو سپس سنتز cDNA انجام و بر اساس توالی ژن mnp و با استفاده از نرم‌افزار Primer Premier (V. 5.0) آغازگرها طراحی گردید و با واکنش زنجیره­ای پلیمراز تکثیر شد. قطعه تکثیر شده در ناقل PTG19-T وارد شد و با استفاده از توالی‌یابی تأیید شد. در ادامه، ژن mnp در ناقل p13H88 همسانه‌سازی گردید. سپس با روش یخ-ذوب به Ecoli (سویه‌یDH5α ) منتقل و تأیید حضور آن در باکتری با روش هضم آنزیمی انجام گرفت. نتایج نشان داد که ژن mnp در ناقل p13H88 همسانه‌سازی شده است. پلاسمید نوترکیب بدست آمده با نام p13H88-FM نامگذاری شد.

واژه‌های کلیدی: تجزیه لیگنین، ناقل، لیگنوسلولز، منگنزپراکسیداز.

مقدمه

آنزیم منگنز پراکسیداز، یکی از عمومی‌ترین پراکسیدازهای تجزیه کننده لیگنین است که توسط اکثر قارچ­های تجزیه کننده چوب و نیز بسیاری از قارچ‌های تجزیه کننده کمپوست و قارچ‌های پوسیدگی سفید از جمله قارچ خوراکی صدفی تولید می‌شود Hofrichter, 2002)). منگنز پراکسیداز یک آنزیم خارج سلولی بوده و دارای یک هسته مرکزی پراکسیداز است. درصورتیکه این هسته مرکزی تحلیل پیدا کند، به یون Mn⁺² نیاز پیدا می‌کند. آنزیم منگنز پراکسیداز، Mn⁺² را به Mn⁺³ اکسیده می‌کند و Mn⁺³ نیز به نوبه خود ساختارهای فنولیک را به رادیکال‌های فنوکسیل اکسیده می­نماید (Gold et. al., 1989). Mn⁺³ایجاد شده، بسیار فعال است و با کلات­کردن اسیدهای آلی مانند اکسالات یا مالات که بوسیله قارچ‌ها تولید می‌شوند، کمپلکس تشکیل می‌دهد (Makela et. al., 2002). با کمک این کلات‌ها، یون‌های Mn⁺³ پایدار شده و می‌توانند به درون موادی مانند چوب نفوذ کنند. قارچ‌های پوسیدگی سفید و قارچ‌های تجزیه‌کننده کمپوست می‌توانند لیگنین را با سرعت بیشتری نسبت به میکروارگانیسم‌های دیگر، تجزیه کنند (Hatakka, 2001).

یکی از مشکلات موجود در صنعت پرورش قارچ خوراکی دکمه­ای سفید، کاهش و یا توقف تولید در برداشت سوم است که به‌نظر می‌رسد عامل اصلی این مشکل، اتمام مواد غذایی برای مصرف این قارچ و عدم توان استفاده بهینه از کمپوست تولید شده باشد. در نتیجه، استفاده از کمپوست نیازمند توانایی تولید مجموعه­ای از آنزیم‌های تجزیه کننده ترکیبات لیگنینی در قارچ خوراکی دکمه‌ای می‌باشد (Moloy, 2004).

cDNA ژن  mnpاز قارچ­های خوراکی صدفی (Irie et. al., 2001)، شی‌تاکه (Nagai et. al., 2007)، دکمه‌ای (Lankinen, 2004) و سه ایزوزایم ژن منگنز پراکسیداز از قارچ Phanerochaete chrysosporium (Godfrey et. al., 1990) جداسازی و تعیین توالی گردید. توالی ژن mnp-1 در گونه P. chrysosporium حدود 2539 جفت باز بوده و مقایسه cDNA و توالی‌های ژنومی نشان می‌دهد که در موقعیت 72-57، 6 اینترون متفاوت دارند. تجزیه و تحلیل نوردرن بلات[2] نشان داده که ژن mnp-1 توسط HSP_s (عناصر شوک حرارتی)[3] تنظیم می‌شود. همچنین ژنوم قارچ مدل Schizophyllum commune نیز که به احتمال زیاد منبع خوبی از آنزیم‌های تجزیه‌کننده ترکیبات لیگنوسلولزی است، توالی‌یابی شده است (Robin et. al., 2010). در مطالعه دیگری، بیان سه ژن منگنز پراکسیداز، لیگنین پراکسیداز و گلی‌اکسال اکسیداز با استفاده از تکنیک RT-PCR در قارچ P. chrysosporium بررسی شده و نتایج حاکی از بیان متفاوت این ژن‌ها است. الگوهای رونویسی به‌طور چشمگیری با همدیگر متفاوتند که این امر احتمالاً ناشی از فعالیت متفاوت آنزیم‌ها در خاک مناطق مختلف است (Janse et. al., 1998). دو ایزوزایم منگنزپراکسیداز در قارچ Pleurotus eryngii جداسازی و ویژگی‌های کاتالیزوری آن‌ها مشخص گردید. این بررسی نشان داد که بیشترین فعالیت آنزیمی منگنزپراکسیداز در محیط کشت مایع حاوی پپتون بدست می‌آید و استفاده از مکمل Mn⁺² در غلظت 4000-1 میکرومول، از تولید این آنزیم در محیط کشت مایع جلوگیری می‌کند (Maria et. al., 1996). همچنین (Sovan et al., 1997) خصوصیات بیوشیمیایی و مولکولی ایزوآنزیم‌های منگنز پراکسیداز قارچ Pleorotus ostreatus را بررسی کردند. نتایج بدست آمده نشان داد ترکیب مواد مورد استفاده در محیط کشت، در تولید متفاوت ایزوزایم‌ گونه‌های مختلف قارچ بسیار مهم است و ژن mnp در گونه‌های Pleorotus شبیه هم ولی متفاوت از گونه P. chrysosporium  است. در ادامه مطالعات مربوط به فعالیت آنزیمی منگنز پراکسیداز، تولید این آنزیم‌ در قارچ Pleorotus ostreatus بررسی گردید که با نتایج بدست آمده در گزارشات قبلی همخوانی داشت. در واقع با بررسی تولید ایزوزایم منگنز پراکسیداز در محیط‌های کشت با ترکیبات متفاوت، بیشترین سطح فعالیت این آنزیم پس از 8 روز در محیط کشت مایع PGY (پپتون- گلوکز-عصاره مخمر) بدست آمد (Kamitsuji et. al., 2004). اگرچه اطلاعات اندکی در مورد چگونگی تولید آنزیم منگنز پراکسیداز در بازیدیومیست‌ها در مقایسه با دیگر قارچ‌های پوسیدگی سفید وجود دارد، ولی اخیراً یک ژن سنتز کننده آنزیم منگنز پراکسیداز در قارچ‌های میکوریزا (Cortinarius rotundisporus) شناسایی شده که تاکنون هیچ‌گونه فعالیتی از آن گزارش نشده است (Chen et. al., 2004). به­علاوه، مهمترین قارچ تجزیه‌‌کننده کمپوست که آنزیم منگنز پراکسیداز را تولید می‌کند، قارچ دکمه‌ای خوراکی (Agaricus bisporus) است (Bonnen et. al., 1994, Lankinen et. al., 2004). گونه‌هایی از خانواده‌ قارچ‌های کوپرینوس مانند Paneolus sphinctrinus (Heinzkill et. al., 1998) و قارچ‌های تجزیه‌کننده ترکیبات گیاهی مانند Marasmius quercophilus (Tagger et. al., 1998)، نیز آنزیم منگنز پراکسیداز را تولید می‌کنند. از طرف دیگر، یکی از عوامل قابل­توجه به انتقال ژن در قارچ‌های خوراکی، پیشبر مورد استفاده است که سبب هدایت و بیان ژن موردنظر می‌گردد. مطالعات نشان می‌دهند موفقیت‌آمیزترین پیشبر مورد استفاده در این آزمایشات، gpdII می‌باشد که از قارچ دکمه‌ای سفید جداسازی شده است. پیشبر gpdII مربوط به ژن گلیسرآلدئید- 3 -فسفات دهیدروژناز II است که پیشبر یک ژن خانه‌دار[4] می‌باشد و هنوز خاموشی مهار مشترک[5] در آن گزارش نشده است (Burns et. al., 2006).

تکنیک جداسازی ژن جهت بررسی ویژگی‌های آن و ساخت سازه های اختصاصی برای اهداف مختلف سال‌هاست توسط محققان صورت می­پذیرد. ازجمله این پژوهش‌ها جداسازی ژن‌های PARSΙ و PARSΠ و همسانه‌سازی آن‌ها و متعاقبا مطالعه نرم‌افزاری خصوصیات فیزیکوشیمیایی، ساختار مولکولی و قرابت ژنتیکی نشان داد که دو آنزیم PARSΙ و PARSΠ به خانواده نوکلئازهای S1/P1 تعلق داشته و شباهت زیادی به نوکلئازهای اختصاصی DNA هترودوپلکس دارند (Mirzaei et.al., 2015). همچنین ساخت سازه پلاسمیدی چندگانه حاوی سه گروه مهم از پروتئین­های مربوط به بیماریزایی با نام­های PR1، PR2 و PR3 سبب شد که از یک سو دوام مقاومت نسبت به بیماری­ها را به­همراه داشته و از طرف دیگر باعث مقاومت به انواع گسترده‌ای از گونه‌های بیماریزا می‌گردد(Raufi et. al., 2011 ).

هدف این پژوهش، جداسازی ژن mnp از قارچ صدفی خوراکی نژاد فلوریدا و همسانه‌سازی آن در سازه اختصاصی قارچ دکمه‌ای خوراکی سفید (A. bisporus) با نام p13H88 حامل پیشبر gpdII، جهت انتقال به قارچ دکمه‌ای سفید از طریق روش مبتنی بر آگروباکتریوم بود.

مواد و روش­ها

کشت میسیلیوم: در این مطالعه، از قارچ خوراکی صدفی‌، نژاد فلوریدا (تهیه شده از مرکز اسپاون زیست‌فناوری قارچ‌های صنعتی جهاد دانشگاهی واحد مشهد) استفاده شد. کشت بافت میسیلیوم قارچ مطابق با روش Castle et. al., (1988) و کشت مایع نیز طبق روش ارائه شده توسط Calvo-bado et. al., (2000)انجام گرفت.

استخراج RNA و بررسی کمی و کیفی: استخراج RNA کل سلول، با استفاده از کیت تجاری RNA-X plus (CinnaGen, RN7713c) و مطابق دستورالعمل شرکت سازنده با کمی تغییرات انجام شد. برای تعیین کیفیت و کمیت RNA به ترتیب از الکتروفورز ژل آگارز یک درصد با بافر (X1)TAE و نانودراپ (Nanodrop 2000, UV-Vis spectrophotometer) استفاده شد.

تکثیر ژن mnp قارچ صدفی خوراکی: جهت سنتز cDNA از دستورالعمل کیت Revert Aid^TM First Strand cDNA Synthesis (Fermentas, k1631) و آغازگرOligo dT  استفاده شد. با توجه به توالی ژن mnp به شماره دسترسی U21879.1 در پایگاه NCBI، آغازگرها با در نظر گرفتن سایت‌های برشی، توسط نرم‌‌افزار Primer Premier (V. 5.0)  طراحی شدند. توالی آغازگر رفت 5'-ATACCATGGATGACCTTTGCTTCGCTTTC-3' و آغازگر برگشت 5'TTAGGTAACCTTACGCAGGTGGGACACG-3' بود. آغازگرها توسط شرکت ماکروژن (MACROGEN, Korea) سنتز گردید. برنامه حرارتی واکنش زنجیره‌ای پلیمراز به‌صورت، چرخه نخست : '3 در دمای °C94، 34 چرخه بعدی: °C94 به مدت "50، °C55 به مدت "50 و °C72 به مدت "90 و چرخه نهایی: °C72 به مدت '5 انجام گرفت. مخلوط اجزای واکنش PCR شامل 1 میکرولیتر آغازگر رفت و برگشت (10 پیکومول)، 150 نانوگرم cDNA، 5/0 میکرولیتر dNTP (10 میلی‌مولار)، 5/2 میکرولیتر بافر(X10)، 75/0 میکرولیتر کلرید منیزیم (250 میلی‌مولار)، 2/0 میکرولیتر مخلوط آنزیمی (5U/μL) با نسبت 5 به 1 (taq/pfu)، در حجم 25 میکرولیتر تهیه شد. برای بررسی کیفی، از الکتروفورز ژل آگارز یک درصد استفاده شد.

ساخت سازه حاوی پیشبر gpdII و ژن mnp: جهت انجام واکنش اتصال، باند مربوط به ژن mnp، با استفاده از کیتGel DNA Recovery  (Vivantis, GF-PL-050) مطابق دستورالعمل شرکت سازنده از ژل تخلیص شده و برای انجام همسانه‌سازی با ناقل پلاسمیدی PTG19-T (TAO10-S Vivantis,) آماده گردید. از سویه DH5α  باکتری مستعد Ecoli به‌عنوان میزبان در مراحل همسانه‌سازی و تکثیر DNA پلاسمیدی استفاده شد. با استفاده از دستورالعمل Maniatis et. al., (1987) و با اعمال تغییراتی پلاسمید به باکتری وارد شد. جهت انتخاب کلنی‌ها از روش آبی- سفید استفاده شد (Sambrook & Russel, 2001). آنتی‌بیوتیک مورد استفاده آمپی‌سیلین (100 میکروگرم بر میلی‌لیتر) بود. برای غربالگری کلون‌های حاوی قطعه DNA هدف از روش هضم آنزیمی و با استفاده از آنزیم‌های BstEII (Vivantis, RE1316) و NcoI (Vivantis, RE1190) و بافر مشترک V₅، مطابق دستورالعمل شرکت سازنده استفاده شد. این پلاسمید نوترکیب که pT-FM نامگذاری شد، جهت انجام توالی‌یابی به شرکت ماکروژن (MACROGEN, Korea) ارسال گردید. پس از تأیید ژن mnp، باند مربوط، از پلاسمید pT-FM (هضم شده توسط آنزیم‌های BstEII و NcoI) طبق دستورالعمل شرکت سازنده کیت، از روی ژل بازیابی گردید. قطعه‌ کلون شده در پلاسمید pTG19-T (شکل 2، B) با استفاده از آغازگرهای mnp-F و mnp-R که به ترتیب آغازگرهای رفت و برگشت بودند، به‌صورت دو بار خوانش توالی‌یابی شدند. سپس با استفاده از نرم‌‌افزار CLC Main workbench توالی‌های بدست آمده و قطعات همپوشان [6] تشکیل و قطعه‌ ‌توافقی ایجاد شده با نمودار توالی‌ها مورد بررسی قرارداده شد تا نواحی نامشخص بر اساس این نمودار تصحیح شود. برای بررسی همردیفی، قطعه‌ بدست آمده در بانک NCBI مورد بررسی قرار گرفت. نتایج این بررسی‌ها نشان داد که قطعه‌ی توالی‌یابی شده دارای شباهت 98.5 درصدی با قطعه موردنظر (gi|732512) می‌باشد. سپس با توالی‌های نشان داده‌ شده در شکل 1 مورد همردیفی قرار گرفت تا نشان داده شود که این توالی با دیگر ژن‌های mnp موجود در جنس Pleurotus متفاوت است. قطعه‌ای از ژن omtA قارچ Aspergillus flavus به‌عنوان Outgroup انتخاب شد تا صحت درخت فیلوژنی رسم شده تأییدگردد.

پلاسمید مورد استفاده با نام p13H88 حامل پیشبر gpdII و ژن گزینشگر hph[7] می‌باشد (شکل 2A). در بخش بعدی، پس از استخراج پلاسمید p13H88، هضم مضاعف با استفاده از آنزیم‌های BsTEII و NcoI انجام شد (شکل 6B). نسبتDNA های مورد استفاده برای انجام واکنش اتصال با استفاده از فرمول کراننبرگ (Cranenburgh, 2004) محاسبه گردید و از روش هضم آنزیمی (باآنزیم‌های BstEII و NcoI) برای شناسایی کلنی‌های حاوی ژن mnp استفاده شد.

پلاسمید نوترکیب حاوی ژن mnp (FM- (p13H88 به آگروباکتریوم سویه LBA4404 و تأیید به روش هضم آنزیمی: ترانسفورماسیون به روش یخ-ذوب (Sambrook & Russel, 2001) انجام گردید. آنزیم‌های مورد استفاده جهت هضم آنزیمی BstEII و NcoI می‌باشد که مطابق دستورالعمل شرکت سازنده استفاده شدند.

نتایج و بحث

تکثیر ژن منگنز پراکسیداز (mnp) در قارچ صدفی با استفاده از PCR

هشت روز پس از زمان کشت در محیط جامد PDA (شکل 3C)، پرگنه قارچ صدفی سطح پتری‌دیش را پوشاند (شکل 3A). نمونه‌هایی که رشد میسلیوم‌ها در آنها به‌صورت پنبه‌ای بودند، برای انجام آزمایش استفاده شد. علت استفاده از هر دو نوع محیط کشت جامد و مایع این است که RNAی کل استخراج شده (شکل 3B)از میسیلیوم محیط کشت مایع از کیفیت مطلوبتری نسبت به میسیلیوم محیط کشت جامد برخوردار است. در کشت‌های جامد به‌علت پیر شدن میسیلیوم، جداسازی آن به‌سختی انجام می­گیرد، لذا کشت مایع میسیلیومی نتیجه بهتری دارد. نسبت A260/A280 در نمونه‌های استخراج شده 1±98/1 بود. وضوح باندهای 28S و 18S بر روی ژل آگارز نشان‌دهنده کیفیت خوب RNA استخراج شده­است. تکثیر ژنmnp  با هر دو آغازگر طراحی شده به‌درستی انجام شد و همان‌طور که انتظار می‌رفت قطعه‌ حدود 1086 نوکلئوتیدی تکثیر گردید. شکل 3A محصول واکنش زنجیره‌ای پلیمراز ژن mnp به‌همراه مارکر نشانه 1 کیلوبازی (Fermentas, SM1163) را نشان می‌دهد.

شکل 1- همردیفی قطعه توالی‌یابی شده با ژن mnp موردنظر به همراه دیگر mnp­های موجود در جنس Pleurotus.

Figure 1-Sequence alignment of  the sequenced piece with the desired mnp gene and  other mnp’s  in the Pleurotus species.

جدول 1- مشابهت توالی­های به­دست آمده توسط نرم­افزار BioEdit 7.2.5.

Table 1- Similarities of  obtained sequences by the BioEdit 7.2.5.

همسانه‌سازی ژن منگنز پراکسیداز (mnp) در ناقل pTG19-T و توالی‌یابی

پس از انجام ترانسفورماسیون و کشت باکتری‌های ترانسفورم‌ شده بر روی محیط کشت LB حاوی آنتی‌بیوتیک آمپی‌سیلین (100 میکروگرم بر میلی‌لیتر)، X-Gal (2 درصد) و IPTG (20 درصد) و 13 ساعت انکوباسیون در دمای °C 37، یک کلنی سفید ظاهر گردید (شکل 4A). محصول اتصال حاصل از نسبت 2 به 1 (DNA به ناقل) بهترین نتیجه را داشت. از اتصال ژن mnp به پلاسمیدpTG19-T ، پلاسمید نوترکیبی ایجاد شد که pT-FM نامگذاری گردید  (شکل 5). هضم آنزیمی پلاسمید pT-MP با آنزیم‌ BamHI به تنهایی (به‌دلیل اینکه دقیقاً در دو طرف ژن همسانه شده دو جایگاه برش دارد) و همچنین آنزیم‌های NcoI و BstEII به ترتیب سبب ایجاد قطعات 1086 نوکلئوتیدی و حدوداً 3000 نوکلئوتیدی شد که نشان‌دهنده اتصال توالی ژن mnp به پلاسمید pTG19-T  است  (شکل 4B).

شکل 2-  A: نقشه ژنتیکی پلاسمید p13H88 (اشرفی، 1391). 1 و 2 و 3 : جایگاه برش آنزیمی توسط آنزیم‌های BstEII و NcoI. 4: محل پیشبر gpdII،B: نقشه ناقل pTG-19T : دارای ژن مقاومت به آمپی‌سیلین جهت بیان در باکتری (Vivantis, TA010).

Figure 2-A: The genetic map of the p13H88 plasmid (Aahrafi, 2012). 1,2,3 : Restriction Enzymes by BstEII and NcoI. 4: gpdII promoter site. B: pTG-19T map Vector: contains ampicillin resistance gene for expression in bacteria (Vivantis, TA010).

شکل 3- A: محصول واکنش زنجیره‌ای پلیمراز ژن mnp بر روی ژل آگارز یک درصد، مارکر نشانه 1Kb (Fermentas, SM1163)،B: RNAی کل استخراج شده با کیت تجاری RNA-X plus بر روی ژل آگارز یک درصد (بافر TAE، ولتاژ 90، 25 دقیقه)،C: کشت 8 روزه‌ی میسلیوم قارچ صدفی خوراکی نژاد فلوریدا در محیط­کشت جامد PDA.

Figure 3- A: Electrophoresis of mnp gene  polymerase chain reaction on a percent agarose gel product, marker sign 1Kb (Fermentas, SM1163), B: Total RNA was extracted using a commercial kit RNA-X plus one percent agarose gel (buffer TAE, voltage 90, 25 minutes), C: 8-days cultivation of edible oyster florida race mushroom mycelium in solid PDA media culture.

شکل 4- A: شمایی از پتری حاوی باکتری‌های Ecoli  تراریخته سویه‌ی DH5α  (ترانسفورماسیون TAvec+ mnp)،B: محصول واکنش هضم پلاسمید pTG19-T-MP با آنزیم‌ BamHI بر روی ژل آگارز یک درصد (بافر TAE ، ولتاژ 95، 20 دقیقه)، 1. مارکر نشانه 1Kb (Fermentas, SM1163)، 2. هضم TA vec  با آنزیم‌ BamHI.

Figure 4- A:the petridish containing transgenic strains Ecoli bacteria of DH5α (transformation TAvec + mnp) schema, B: The plasmid pTG19-T-MP digesting reaction with enzymes BamHI product on a percent agarose gel (buffer TAE, voltage 95, 20 minutes), 1. 1Kb Size marker (Fermentas, SM 1163), 2. TA vec digestion with BamHI enzymes.

شکل 5- نمای شماتیک پلاسمید نوترکیب PT-FM.

Figure 5- Schematic view of recombinant PET-FM plasmid.

شکل 6- الکتروفورز محصول استخراج و هضم پلاسمید p13H88 بر روی ژل آگارز یک درصد (بافر TAE، ولتاژ 95، 65 دقیقه). A: نمونه­های استخراج پلاسمید، چاهک شماره 1: مارکر نشانه 1Kb (Fermentas, SM1163). چاهک­های شماره 2 و 3 و 4: نمونه‌های پلاسمیدی استخراج شده به روش مانیتیس و همکاران (1989) و چاهک­های شماره 5 و6:نمونه‌های پلاسمیدی استخراج شده با کیت استخراج پلاسمید (Vivantis, GF-PL-050). B: هضم مضاعف پلاسمید p13H88 با آنزیم‌های برشی BstEII و NcoI، چاهک شماره 1: مارکر نشانه 1Kb (Fermentas, SM1163). چاهک­های شماره 2 و 3 :نمونه‌های پلاسمیدی هضم شده با آنزیم­های‌ برشی NcoI و BstEII. C: چاهک شماره 1: مارکر نشانه 1Kb (Fermentas, SM1163)، چاهک شماره2:  هضم منفرد پلاسمید p13H88 با آنزیم‌ برشی NcoI. چاهک شماره 3: هضم منفرد پلاسمید p13H88 با آنزیم‌ برشی BstEII.

Figure 6- Electrophoresis of plasmid p13H88 extraction and digestion product on one percent agarose gel (buffer TAE, voltage 95, 65 minutes). A: Plasmid extraction Instances Cell No. 1: 1Kb size marker (Fermentas, SM1163). Cells 2, 3, 4: extracted plasmid with Matianis et al (1989) method instances. Cell 5 and 6: extracted plasmid with plasmid extraction kit (Vivantis, GF-PL-050)instances. B: Double digesting p13H88 plasmid by BstEII and NcoI restriction enzymes, Cell No. 1: 1Kb size marker (Fermentas, SM1163). Cells No. 2 and 3 digested plasmid with NcoI and BstEII restriction enzymes instances. C: Cell 1: 1Kb size marker, (Fermentas, SM 1163), Cell (2): single digest p13H88 plasmid with NcoI restriction enzymes. Cell No. 3: single digest p13H88 plasmid with BstEII restriction enzymes.

تأیید هضم پلاسمید  p13H88با استفاده از آنزیم‌های برشی NcoI و BstEII

پس از استخراج پلاسمید p13H88 با روش (Matianis et al., 1987)، جهت هضم از آنزیم‌های BstEII و NcoI استفاده شد. آنزیم BstEII تنها یک جایگاه برش بر روی پلاسمید فوق دارد اما آنزیم NcoI دارای دو جایگاه برشی می‌باشد، انتظار می‌رفت پس از هضم مضاعف، سه باند (bp 8689، bp 2573، bp 911) مشاهده شود. در ادامه، از باند 8689 جفت­بازی جهت انجام همسانه‌سازی استفاده شد.

تأیید واکنش اتصال ژن منگنزپراکسیداز (mnp) و پلاسمید p13H88 با

هضم آنزیمی (با استفاده از آنزیم‌های برشی BstEII و NcoI)

پس از انتقال پلاسمید نوترکیب به باکتری‌های موردنظر، گزینش کلنی‌های ترانسفورم شده بر روی محیط کشت حاوی آنتی‌بیوتیک کانامایسین (50 میکروگرم بر میلی‌لیتر، Sigma, K1876-1G) انجام شد. کلنی‌های باکتری‌های Ecoli سویه DH5α و آگروباکتریوم سویه‌ی LBA4404 ترانسفورم شده به ترتیب در طی 24 و 48 ساعت پس از آزمایش ترانسفورماسیون در محیط انتخابی رشد کردند. برای انجام واکنش اتصال، مقادیر با نسبت 12:6 (به ترتیب از DNA به ناقل) بر اساس محاسبه فرمول (Cranenburgh, 2004) استفاده شد. از اتصال ژن mnp به پلاسمید p13H88، پلاسمید نوترکیبی بدست آمد که p13H88-FM نامیده شد. شکل­ 7 نمای شماتیک پلاسمید p13H88-FM و محصول هضم پلاسمید (شکل 8) را نشان می­دهند.

نتیجه­گیری

ایده انجام این پژوهش بر اساس تحقیقات انجام شده در دانشگاه فردوسی مشهد پایه ریزی شد. دستاورد آن، تکثیر ژن mnp از قارچ صدفی خوراکی نژاد فلوریدای موجود در واحد زیست‌فناوری قارچ­های خوراکی جهاد دانشگاهی  واحد مشهد، ساخت سازه حاوی ژن mnp با نام p13H88-FM و تایید پلاسمید p13H88 (حامل پیشبر gpdII و ژن گزینشگر hph که یک پلاسمید اختصاصی قارچ دکمه­ای سفید است) می­باشد. از طریق انتقال پلاسمید نوترکیب حاصل به قارچ دکمه­ای خوراکی می­توان جهت تولید نژاد برتر و افزایش عملکرد بهره گرفت.