بررسی EST های گندم در برهمکنش با قارچ بیمارگر Mycosphaerella graminicola

جلال غلام­نژاد¹، فروغ سنجریان²، ابراهیم محمدی گل­تپه*³، ناصر صفایی⁴، خدیجه رضوی⁵

1دانشجوی دورۀ دکتری بیماری­شناسی گیاهی، دانشگاه تربیت مدرس

2استادیار پژوهشگاه ملی مهندسی ژنتیک و زیست فناوری

3استاد دانشکدۀ کشاورزی دانشگاه تربیت مدرس، بخش بیماری­شناسی گیاهی

4دانشیار دانشکدۀ کشاورزی دانشگاه تربیت مدرس، بخش بیماری­شناسی گیاهی

5استادیار پژوهشگاه ملی مهندسی ژنتیک و زیست فناوری

تاریخ دریافت: 28/12/1392، تاریخ پذیرش: 24/07/1393

چکیده

در این مطالعه، 10438 EST که در پایگاه NCBI در رابطه با تعامل گندم و بیمارگر  Mycosphaerella graminicola  (فرم غیرجنسی Zymoseptoria tritici)  ثبت شده بودند، استخراج شدند. پروتئین­های غیر تکراری و مرتبط با EST­ ها در بانک اطلاعاتی  NCBI  توسط نرم افزار SEQtoolsبه دست آمدند. این پروتئین ها بر اساس نوع، طبقه بندی شده و در 279 گروه قرار گرفتند. سپس در سایتKEGG ، مسیر 112 عدد از این پروتئین­ها تجزیه و تحلیل و 55 مسیر شناسایی و ارتباط بین این مسیرها و پاسخ­های دفاعی گندم مورد بررسی قرار گرفت. در ادامه این مسیرها بر اساس عملکرد گروه­بندی شده و در هشت گروه عملکردی (شامل پروتئین­های دفاعی، پروتئین­های درگیر در فرایند انرژی سلولی، پروتئین­های درگیر در فرایند متابولیسم سلولی، پروتئین­های درگیر در فرایند پردازش پروتئین­ها، پروتئین­های درگیر در فرایند پردازش RNA، پروتئین­های درگیر در چرخه­های سلولی، پروتئین­های درگیر در تخریب پروتئین­ها و پروتئین­های درگیر در فرایند سیگنال­دهی سلولی) قرار گرفتند. مسیرهای متابولیکی تثبیت کربن در فرایند فتوسنتز و پروتئین­های درگیر در فرایند دفاعی به ترتیب  با دارا بودن 745 و 251 EST، در مرتبۀ اول و دوم قرار داشتند.. سپس نقش ESTها مخصوصاً آن­هایی که در مسیرهای دفاعی گیاهی درگیر بودند به صورت موردی مطالعه شدند و عملکرد آن­ها در مسیر دفاع گیاه گندم مشخص شد. با استفاده از اطلاعاتی که این بررسی در اختیار قرار می‌دهد می­توان ژن­های دیگری که به طور مستقیم و همچنین غیر مستقیم در فعالیت­های دفاعی گیاهی شرکت می­­کنند، مورد بررسی قرار داد.

کلمات کلیدی: گندم، KEGG، NCBI، SEQtools، EST، Mycosphaerella graminicola.

مقدمه

بیماری لکه­برگی سپتوریایی گندم ناشی از Mycosphaerella graminicola (Fuckel) (آنامورفZymoseptoria tritici )  (Quaedvlieg, et al., 2011) از مهم­ترین بیماری­های این محصول درجهان می­باشد که سالیانه خسارات فراوانی را وارد می­سازد (Darestani Farahani et al., 2009). این بیماری از جمله عوامل محدود کننده گندم به­ویژه در سال­های اخیر بوده است. استفاده از ارقام مقاوم مؤثرترین، اقتصادی­ترین و سالم­ترین روش از نظر زیست­محیطی برای کنترل این بیماری به شمارمی رود (Gilchrist et al., 1999). در پژوهشی Brading et al. (2002) با بررسی مقاومت اختصاصی چند رقم گندم حساس و مقاوم و ژن­های کنترل کننده مقاومت آن­ها در مقابل جدایه­های عامل بیماری لکه برگی سپتوریایی، رابطه ژن برای ژن را بین مقاومت اختصاصی گندم و بیماریزایی M. graminicola مورد تأکید قراردادند (Brading et al., 2002).

  تا سال 2009، بیش از 45 میلیون Expressed Sequence Tag  (EST) متعلق به بیش از 1400 گونه مختلف از موجودات یوکاریوت ایجاد شده است.  غالباً، زمانی از اطلاعات حاصل ازEST  ها استفاده می­شود که پروژه ژنوم موجود مورد مطالعه، بطور کامل به پایان نرسیده است، همچنین ازEST  ها به عنوان راهی کم هزینه برای کشف ژن­های جدید می­توان بهره برد. از این ESTها می­توان در زمینه­های فیلوژنتیک، پروفایل بیانی ژن­ها و پروتئومیکس نیز استفاده کرد (Parkinson and Blaxter, 2009).

بر اساس اطلاعات موجود، تا سال 2012، تعداد 1318964 EST در پایگاه بانک ژن مربوط به جنس Triticumsp، و تعداد 1286060 EST مربوط به گونۀ  T. aestivum ثبت شده است http://avena.pw.usda.gov/genome)).

با تجمع انبوه اطلاعات EST، پایگاه TIGR در بخش Gene Index و زیر بخش Wheat وظیفه تجزیه، تحلیل و جمع‌بندی و بالاخره قابل مشاهده و بازیابی نمودن این اطلاعات را بر عهده گرفته، در این پایگاه ابتدا توالی‌های EST و همچنین ET با یکدیگر در یک ردیف (Align) قرار می­گیرند تا به توالی‌های مشترکی دست یابند که آن­ها را توالی‌های توافق پیشنهادی یا TC (Tentative consensus) نامیده‌‌اند (Majidian et al. 2011). برای سرهم کردن هر دو توالی کافی است ۹۵ درصد همسانی در توالی مشترکی به طول ۴۰ نوکلئوتید یافت شود. اطلاعات مربوط به  عملکرد ژن­ها، در بانک اطلاعات PATHWAY ذخیره شده­اند، این بانک­های اطلاعاتی محتوی اشکال گرافیکی از فرایندهای سلولی، نظیر متابولیسم، پردازش اطلاعات ژنتیکی، پردازش اطلاعات محیطی هستند (Ogata et al., 1999).

در مطالعه­ای برهمکنش گیاه گندم و Fusarium graminearum  در مراحل ابتدایی بیماری با استفاده از ساخت کتابخانۀ cDNA و بررسی EST ها، بررسی شد. در این مطالعه نشان داده شد که در توسعه اولیه بیماری، بیان هشتاد و چهار ژن قارچی افزایش می­یابد. عملکرد احتمالی 49 عدد از این ژنها با تجزیه و تحلیل بیوانفورماتیک مشخص شد. برای سی و پنج عدد از این EST  ها هیچ همولوگی در پایگاه داده مورد شناسایی قرار نگرفت. احتمالاً این EST­های ناشناخته، نشان دهنده ژن­هایی از graminearum F. هستند که قبلاً شناخته نشده­اند. چهار ژن موجود در یکی از این کتابخانه‌ها برای جایگزینی هدفمند ژن انتخاب شدند. تحقیق مذکور منجر به شناسایی یک همولوگ دو جزئی از تنظیم کننده پاسخ­های درگیر در بیماری­زایی قارچ شد. جهش در این ژن منجر به کاهش اسپورزایی و تاخیر در گسترش بیماری سوختگی خوشه قارچ در گندم شد (Goswami et al., 2006).

پژوهشی توسط Dracatos et al., (2006) باعنوان توصیف مارکرهای EST-SSR در مورد بیماری زنگ طوقۀ گیاه چاودار با عامل Puccinia coronata f.sp. lolii انجام شد. آن­ها از نشانگرهای مولکولی تکرار توالی ساده در ارتباط با ژن (SSR) برای مطالعۀ تنوع ژنتیکی عامل بیماری زنگ طوقه استفاده کردند. آنالیز 1100   توالی EST  که از یک کتابخانه cDNA مربوط به یوریدیوسپور به دست آمد، منجر به شناسایی 55 لوکوس SSR  شد. زیر مجموعه­ای از 12 نشانگر قوی  EST –SSR برای بررسی تنوع بیمارگر که از مناطق مختلف جمع آوری شده بود، مورد استفاده قرار گرفت. آنها نشان دادند که نشانگر   EST -SSR در مورد بیماری زنگ می­تواند برای گونه­های قارچی نزدیک و همچنین جنس  Puccinia spp.و دیگر قارچ­های رشته­ای مناسب باشد (Dracatos et al., 2006).

در مطالعۀ حاضر،  ESTهای گندم در برهمکنش با قارچ بیمارگر Mycosphaerella graminicola، که قبلاً ساخته شده و در پایگاه بانک ژن NCBI ثبت شده بودند، مورد بررسی قرار گرفته است. در مرحلۀ ابتدایی بعد از گردآوری و ذخیرۀ ESTها، ژن­های متناظر با هر EST مورد شناسایی قرار گرفتند. بعد از شناسایی این ژن­ها، مسیرهایی که این ژن­های شناخته شده در آن­ها شرکت می­کنند، مورد ارزیابی قرار گرفتند. در نهایت ارتباط این مسیرها با تنش این بیمارگر بررسی شدند.

مواد و روش ها

ابتدا در پایگاه NCBI ، ESTهایی که در بر همکنش قارچ M. graminicola و گیاه گندم ثبت شده بودند، مورد جستجو قرار گرفتند. در مورد این تنش پنج نمونه (Sample) در قسمت BioSample (Biological Baterial Descriptions) یافت شدند. این پنج نمونه مربوط به دو گروه تحقیقاتی مختلف بود. بیوسمپل 1 مربوط به صداقت فر و همکاران بود که در سال 2011  (EST: LIBEST_027453) با تعداد 32 EST در پایگاه NCBI ثبت شده بودند. بیوسمپل 2، 3، 4 و 5 مربوط به Tingey و همکاران در سال 2002 (EST: LIBEST_012193; EST: LIBEST_012194; EST: LIBEST_012201; EST: LIBEST_012202) بود که هر کدام به ترتیب دارای  2041، 2929، 2761 و 2675 EST بودند. این تعداد EST که مربوط به هر بیوسمپل بود به صورت دسته جمعی با فرمت FASTA ذخیره شدند. در نهایت اطلاعات توالی 10438 EST به صورت پنج فایل جداگانه به دست آمد.

همۀ EST های جمع آوری شده در مرحلۀ قبل، در پایگاه TIGR یا Computational Biology and Functional Genomics Laboratoary  وارد شدند، با استفاده از اطلاعات موجود در این پایگاه توالی توافقی یا TC متناظر اکثر ESTها به دست آمد. سپس با استفاده از جستجوگر BLASTx ژن­های مربوط به این توالی‌های توافقی بررسی شدند.

از نرم افزار Seqtools نیز جهت به دست آوردن پروتئین­های متناظر توالی­های EST استفاده شد. با انجام این عملیات مشخص شد که از 10438 توالی EST ، 3668 توالی دارای پروتئین متناظر هستند. این تعداد از EST ابتدا بر اساس نوع پروتئین­ها دسته­بندی شده و با حذف پروتئین­های تکراری در 279 دسته قرار گرفتند. این پروتئین­ها در سایت  KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes) وارد شدند تا مسیرهایی که این پروتئین­ها در آن­ها شرکت می­کنند مورد بررسی قرار گیرند. در نهایت از  279 پروتئین، 112 عدد در این پایگاه دارای مسیر (Pathway) بودند. بعضی از پروتئین­ها مانند پروتئین­های وابسته به بیماری­زایی (PR-Proteins) دارای مسیر مشخصی در پایگاه نبودند.

در نهایت مسیرهایی که پروتئین­های شناخته شده در آن­ها شرکت می­کنند با استفاده از پایگاه (KEGG) شناسایی شده و ارتباط بین این مسیرها با یکدیگر و همچنین با تنش بیمارگر مورد بررسی قرار گرفتند.

نتایج و بحث

طبقه بندی ژن­ها از نظر عملکرد

بیش از 95% از EST ها دارای توالی­های توافقی در پایگاه TIGR بودند، در نتیجه نیاز به همردیف سازی اینESTها و ساخت کانتیگ و یافتن سینگلتون­ها نبود. 46% از EST های جمع آوری شده (3668) بعد از جستجوی بلاست دارای پروتئین­های متناظر بودند. بر اساس نتایجی که از بررسی پروتئین­ها با استفاده از نرم­افزار Seqtools به دست آمد پروتئین­های مورد مطالعه در 279 دسته قرار گرفتند. سپس این 279 دسته بر اساس عملکرد در داخل سلول طبقه بندی شده و در 21 گروه قرار گرفتند (شکل 2).

شکل 1- مسیر پردازش اطلاعات در این تحقیق (برای مطالعۀ جزئیات هر بخش به متن مراجعه شود).

Figure 1- Data processing pathway in this study (See text for more information)

شکل 2- طبقه بندی پروتئین­های به دست آمده از بررسی ESTهای گندم در برهمکنش با بیمارگرM. graminicola از نظر عملکرد.

Figure 2- Functional classification of predicted proteins based on ESTs involving in M. graminicola and wheat interaction

بر اساس نتایج حاصل از نرم­افزار Seqtools حاصل از بررسی 3668 EST که دارای پروتئین متناظر بودند این پروتئین­ها در 279 گروه قرار گرفتند. مسیر تعدادی از این پروتئین­ها با استفاده از پایگاه KEGG تعیین شد. بر این اساس، 55 مسیر در پایگاه KEGG مورد شناسایی قرار گرفت که پروتئین­های شناخته شده در آن­ها شرکت می­کردند، سپس این مسیر یا چرخه­ها بر اساس عملکرد در هشت گروه طبقه بندی شدند. این گروه­های عملکردی شامل گروه­های زیر بودند:

1- گروه پروتئین­های دفاعی 2- پروتئین­های درگیر در فرایند انرژی سلولی 3- پروتئین­های درگیر در فرایند متابولیسم سلولی 4- پروتئین­های درگیر در فرایند پردازش پروتئین­ها 5- پروتئین­های درگیر در فرایند پردازش RNA 6- پروتئین­های درگیر در چرخه های سلولی 7- پروتئین های درگیر در تخریب پروتئین­ها و 8- پروتئین­های درگیر در فرایند سیگنال دهی سلولی (جدول1).

هر یک از گروه­های عملکردی دارای چندین مسیر هستند، که پروتئین­های شناخته شده دراین مسیرها درگیر هستند. جدول 1 گروه­بندی عملکردی، مسیرها و پروتئین­های متناظر با هر EST را به­همراه تعداد EST هر مسیر  نشان می­دهد.

پروتئین­های درگیر در فرایند انرژی سلولی، بیشترین تعداد EST (745) را در بین هشت گروه عملکردی به خود اختصاص دادند. در این گروه، پروتئین ریبولوز 1، 5- بیس فسفات کربوکسیلاز- اکسیژناز (روبیسکو) با تعداد 631 EST ، از بیشترین تعداد EST  برخوردار بود.

پس از پروتئین­های درگیر در فرایند انرژی سلولی، پروتئین­های درگیر در فرایند دفاعی با تعداد 231 EST، مرتبۀ دوم را به خود اختصاص دادند. در این گروه، آنزیم های پراکسیداز  با  74 EST بیشترین تعداد EST را در بین پروتئین­های دفاعی دارا بود.

گروه پروتئین­های درگیر در فرایند سیگنال دهی، 74 EST، پروتئین های درگیر در تخریب پروتئین ها، 45 EST، گروه پروتئین های درگیر در فرایند متابولیسم سلولی 43 EST، گروه پروتئین­های درگیر در فرایند پردازش پروتئین ها و پروتئین­های درگیر در فرایند پردازش RNA هر کدام با 31 EST و گروه پروتئین­های درگیر در چرخه­های سلولی،4 EST ثبت شده در پایگاه NCBI،  را در بر همکنش با قارچ Z. septoria به خود اختصاص دادند.

جدول 1- گروه­های عملکردی، مسیرهای سلولی و پروتئین های پیش بینی شده بر اساس آنالیز EST.

Table 1- Functional groups, Cell pathways and protein predicted by EST analysis.

پروتئین­های شناسایی شده

همانطور که قبلاً ذکر شد بیشترین تعداد EST (631) مربوط به ژن ریبولوز 1، 5- بیس فسفات کربوکسیلاز- اکسیژناز (روبیسکو) بود. این آنزیم کاتالیز کننده اولین مرحله از چرخه کالوین است که در استرومای کلروپلاست واقع است. روبیسکو فراوانترین آنزیم موجود در زمین است که ۵۰% کل پروتئین کلروپلاست را تشکیل می دهد. این آنزیم در واقع پلی بین حیات و دنیای بی­جان برقرار کرده و کربن آلی را از دی اکسید کربن غیرآلی موجود در هوا بوجود می­آورد. (Feller et al., 2008).

در اولین مرحله از چرخۀ کالوین، دی اکسیدکربن به یک قند پنج کربنه به نام ریبولوز ۱-۵ بیس فسفات متصل شده و تولید دو ملکول ۳- فسفو گلیسرات می‌کند، که این فعالیت به وسیلۀ آنزیم روبیسکو انجام می­گیرد، به این فرایند تثبت کربن (Carbon fixation) گفته می­شود (Kim et al., 2010) (شکل 2).

  (الف A)

  (ب B)

شکل2- مستطیل­های علامت گذاری شده با مکان نما، محل فعالیت آنزیم روبیسکو در مسیرهای متابولیسمی گلیکوزیلیت و دی­کربوکسیلیت (الف) و تثبیت کربن (ب) در مسیرهای فتوسنتزی است (منبع: http://www.genome.jp/kegg).

Figure2- Rubisco enzyme indicated with red box in metabolic pathways of Glycosylate and Dicarboxylate (a) and carbon fixation (b) in photosynthetic pathways (http://www.genome.jp/kegg).

در مورد تأثیر بیمارگر Septoria tritici بر روی فتوسنتز گیاه گندم آلوده Robert et al (2006) مطالعه­ای انجام دادند. نتایج این مطالعه نشان داد که این بیمارگر با ایجاد لکه های نکروتیک سبب اختلال در تبادلات گازی، کاهش تعداد برگ­های گندم، و محتوای نیتروژن و در نهایت کاهش فتوسنتز می­گردد (Robert et al., 2005).

در پژوهشی  Bonfig et al. (2006)  کاهش در فتوسنتز را در برهمکنش ناسازگار گزارش کردند (Bonfig et al., 2006). کاهش در فتوسنتز گیاه گندم در ایزوله­های غیربیماری­زا نسبت به ایزوله­های بیماری­زا زودتر قابل ردیابی بود. این موضوع نشان می­دهد که گیاهان فتوسنتز و دیگر مسیرهای متابولیسمی را تغییر می­دهند تا بتوانند انرژی لازم برای تنفس و دیگر فرایندهای لازم برای دفاع گیاهی را فراهم کنند (Berger et al., 2007).

هر کدام از گروه­های اصلی متابولیت های ثانویه مانند آلکالوئیدها، فنیل پروپانوئیدها و ترپنوئیدها و همچنین ترکیبات منحصر به فردی که در داخل گیاه تجمع پیدا می­کنند، به صورت گسترده­ای در برهمکنش گیاه با بیمارگر مورد مطالعه قرار گرفته­اند (Ishihara et al., 2011). یکی از مسیرهایی که دارای تعداد نسبتاً زیاد EST است مسیر بیوسنتز فنیل پروپانوئید با 96 عدد EST می باشد. در حقیقت این مسیر یکی از مهمترین مسیرهای تولید متابولیت­های ثانویه دفاع گیاه در برابر تنش­های زنده است. بیوسنتز ترکیبات فنلی از مسیر فنیل پروپانوئید و از اسیدآمینۀ فنیل­آلانین صورت می­گیرد. این مسیر باعث بیوسنتز کومارین­ها، استیلبن­ها، اسیدهای فنلی و لیگنین­ها می­شود. کلیدی­ترین آنزیم این مسیر فنیل آلانین آمونیا لیاز(PAL)  است (Chandra et al., 2007).

گروه دیگری از متابولیت­های ثانوی لیگنان­ها هستند که در بسیاری از گیاهان از مسیر فنیل پروپانوئید ساخته می­شوند. این ترکیبات معمولاً از دو واحد فنیل پروپانوئیدی تشکیل می­شوند و در مکانیسم­های دفاعی گیاهان در برابر عوامل بیماریزا نقش دارند و فعالیت زیستی متنوعی از خود نشان می­دهند. لیگنان مولکول­های کوچک فنلی هستند که دارای یک حلقه فنیلی و یک زنجیره سه کربنی هستند. این ترکیبات از مسیر بزرگ فنیل­پروپانوئیدی سنتر می­شوند(Dixon and Summer, 2003). این مسیر نقش بسیار زیادی در مقاومت در برابر تنش­های زنده و غیرزنده دارد. ترکیبات فنیل­پروپانوئیدی از اسیدسینامیک مشتق می شوند، که خود اسیدسینامیک از اسیدآمینۀ فنیل­آلانین تشکیل شده است (Vogt, 2010). آنزیم فنیل­آلانین­آمونیالیاز (PAL) واکنش تبدیل فنیل­آلانین را به ترانس­سینامیک اسید را هدایت می­کند. این آنزیم نقش مهمی در فعالیت­های دفاعی گیاه مانند بیوسنتز اسیدسالیسیلیک (به عنوان سیگنال مقاومت سیستمیک در گیاهان عمل می­کند)، بازی می­کند (Chaman et al., 2003).

یکی از آنزیم­هایی که دارای تعداد زیادی EST تحت مسیر فنیل پروپانوئید بود، پروکسیداز بود. این آنزیم 46 EST را به خود اختصاص داد. پراکسیداز از گروه گلیکوپروتئین­ها است و با مصرف پراکسیدهیدروژن (H2O2) باعث اکسیداسیون ترکیبات آلی و غیرآلی می­شود. پراکسیداز از طریق اکسیداسیون ترکیبات فنلی و دهیدوژنه کردن منولیگنال­ها باعث لیگنینی­شدن و در نتیجه باعث استحکام دیواره آوند چوبی می­شود؛ همچنین این آنزیم باعث تولید گونه­های اکسیژن فعال­، سنتز فیتوالکسین­ها و تجمع ترکیبات فنلی در دیوارۀ سلولی گیاهان و در نتیجه محدود کردن گسترش بیمارگر در گیاه می­شود (Sasaki et al., 2004).

گلوتاتیون پراکسیداز(GP) آنزیمی  دیگر تحت مسیر فنیل پروپانوئید است و دارای 28 EST می­باشد. این آنزیم نقشی کلیدی در حفاظت از غشاهای سلولی که در معرض تنش های اکسیداتیو قرار دارند، ایفا می­کند. تولید این آنزیم طی تنش  بیمارگر القا می­گردد. این آنزیم باعث تولید دوبارۀ اسیدهای چرب غیراشباع از فسفولیپید هیدروپراکسید می­شود. اسید اولئیک ،اسید لینولئیک و اسید پالمیتولئیک تعدادی از اسیدهای چرب غیر اشباع هستند. این ترکیبات در ساختار موم که از اولین سدهای دفاعی گیاه در برابر حملۀ بیمارگر است به کار می­روند  (Allen, 2008).

یکی دیگر از آنزیم­هایی که دارای تعداد زیادی EST در گروه پروتئین­های دفاعی می­باشد، آنزیم گلوتاتیون S ترانسفراز(GST) با 32 عدد EST است. این آنزیم جزئی از سیستم­های دفاعی گیاه در برابر آسیب­های ناشی از تنش­های زنده و غیرزنده است. این آنزیم در سم­زدایی ترکیبات خارجی زیستی نقش دارد. گلوتاتیون S ترانسفراز آنزیمی دایمر و چند عملکردی است که در سم­زدایی مواد داخلی (متابولیت‌های درون سلول) و خارجی مانند داروها، حشره­کش­ها و متابولیت بیمارگرها دخالت دارد، بنابراین در هنگام تنش اکسیداتیو و همین­طور جهت خنثی­سازی مواد سمی آلی ناشی از بیمارگرها این آنزیم نقشی اساسی ایفا می­کند (Hayes  and Pulford, 1995).

در این مطالعه بیشترین تعداد EST را همانطور که انتظار می­رفت، گروه عملکردی انرژی سلولی با تعداد 765 EST به خود اختصاص دادند، که با توجه به قرار گرفتن ژن روبیسکو در این گروه این امر منطقی به نظر می‌رسد. گروه پروتئین­های درگیر در فرایند دفاعی دومین گروه با 231 EST بود. نظر به فعال شدن واکنش های دفاعی در گیاه با حملۀ بیمارگر این یک پدیدۀ منطقی است.

در کلاس عملکردی پروتئین­های دفاعی، مسیرهای متابولیکی و آنزیم­های زیادی وجود دارند که به­طور خلاصه می­توان به پروکسیدازها، گلوتاتیون S ترانسفراز، کینازها، تکرارهای غنی از لوسین NBS-LRR، پروتئین­های شوک حرارتی Hsp70-90 و کاتالاز اشاره نمود. مطالعات زیادی نشان داده که ژن­های کدکنندۀ آنزیم­های پراکسیداز در اثر آلودگی­های قارچی، باکتریایی، ویروسی و ویروئیدی فعال می­شوند و ژن­های کدکنندۀ این گروه از آنزیم­ها در خانوادۀ PR9 از PR پروتئین­ها قرار گرفتند (Pshenichnov et al., 2011). ژن­های مقاومت گروه NBS-LRR متداول­ترین گروه ژن­های مقاومت هستند. تاکنون مقاومت به بیمارگرها و همچنین آفات، تنها نقش ثابت شده برای ژن­های رمزکننده پروتئین­های دارای NBS-LRR در گیاهان بوده است (Guo et al., 2010). بیشتر پروتئین­های رمزشده توسط ژن­های مقاومت دارای یک محل اتصال به نوکلئوتید (Nucleotide Binding Site: NBS) هستند که به یک تکرار غنی از لوسین (Leucine-Rich Repeats: LRR) با طول متغیر در انتهای کربوکسیل متصل می­باشد. این دامنه­ها در برهمکنش­های پروتئین-پروتئین و انتقال پیام­های مولکولی شرکت می­کنند (Alscher and Cumming, 1990). آنزیم­های کاتالاز و پراکسیداز از مهم­ترین آنزیم­های دفاعی  در برابر تنش­های زیستی هستند. آنزیم کاتالاز H2O2 را به  آب و O2 تجزیه می­کند و پراکسیداز با اکسیداسیون ترکیبات فنلی H2O2 را تجزیه می­کند. این آنزیم­ها به همراه آنزیم سوپراکسید دیسموتاز  سیستم­های اصلی آنزیمی سلول در برابر صدمات اکسیداتیو هستند (Yao and Tian, 2005).

EST ها ابزاری برای شناسایی ژن، کشف ژن و تعیین توالی ژن می­باشد (Nagaraj et al., 2007). در حال حاضر شناسایی EST ها، به سرعت در حال انجام است. تا اول ژانویۀ سال 2013 حدود 74،200،000 EST در پایگاه داده های اطلاعات ثبت شده بود. در مورد تنشی که در این تحقیق مورد بررسی قرار گرفت همانطور که قبلاً ذکر شد تعداد زیادی EST (10438) در دسترس بود. با مطالعاتی که در مورد هر EST و ژن کد کنندۀ پروتئین آن انجام گرفت، مرحله به مرحله اطلاعات مربوط به EST ها طبقه بندی شدند و در نهایت این حجم بالای اطلاعات در هشت گروه عملکردی، تعدادی مسیر و همچنین پروتئین های شرکت کنندۀ در هر مسیر، طبقه­بندی شد (جدول 1). در مرحلۀ پایانی پروتئین­هایی که دارای تعداد بیشتری EST مخصوصاً در مسیرهای دفاعی گیاهی بودند به صورت موردی مطالعه شدند و نقش آن­ها در مسیر دفاع گیاه گندم مشخص شد. با استفاده از اطلاعاتی که این بررسی در اختیار قرار می­دهد می­توان ژن­های دیگری که به طور مستقیم و همچنین غیر مستقیم در فعالیت­های دفاعی گیاهی شرکت می­­کنند، مورد بررسی قرار داد.

تشکر و قدردانی: تشکر و قدردانی: نگارندگان از پژوهشگاه ملی مهندسی ژنتیک و زیست فناوری و دانشگاه تربیت مدرس جهت فراهم کردن امکانات این پژوهش تشکر و قدردانی می نمایند.