القای کالوس و باززایی مستقیم در ریزنمونه‏های مختلف گیاه دارویی ازمک (Lepidium draba L.)

القای کالوس و باززایی مستقیم در ریزنمونه‏های مختلف گیاه دارویی ازمک (Lepidium draba L.)

زهرا زینهـاری¹، شهرام پورسیدی[*]²، جعفر ذوالعلی³

¹ دانش آموخته کارشناسی ‏ارشد رشته بیوتکنولوژی کشاورزی دانشگاه شهید باهنر کرمان

² دانشیار گروه بیوتکنولوژی کشاورزی دانشگاه شهید باهنر کرمان

³ استادیار گروه بیوتکنولوژی کشاورزی دانشگاه شهید باهنر کرمان

تاریخ دریافت: 10/08/1394، تاریخ پذیرش: 14/05/1395

چکیده

گیاه ازمک به ‏واسطه تولید ترکیب ضدسرطانی و ضدمیکروبی سولفورافان، از گیاهان دارویی ارزشمند به‏حساب می‏آید. بهینه‏سازی روش‏های کشت‏بافت به‏منظور آسان نمودن استحصال ترکیبات‏دارویی آن، فرآیند انتقال‏ژن و نیز بهبود صفات این گیاه‏دارویی، بسیار مهم است. این تحقیق، با ریزنمونه‏های برگ‏لپه‏ای، ساقه و ریشه در محیط کشت MS در قالب دو آزمایش جداگانه، صورت گرفت. تجزیه داده‏ها به صورت آزمایش فاکتوریل در قالب طرح کاملا تصادفی انجام شد. در نتایج آزمایش اول با غلظت‏های متفاوتی از تنظیم‏کننده‏های رشدNAA  وBAP، بیشترین درصد پاسخ‏دهی، شاخه‏زایی مستقیم و میانگین تعداد شاخه در ریزنمونه ریشه و بیشترین درصد ریشه‏زایی و میانگین تعداد ریشه در ریزنمونه برگ‏لپه‏ای مشاهده شد. تیمار 1 میلی‏گرم در لیتر BAP بدون حضور NAA سبب القای بیشترین میانگین تعداد شاخه مستقیم در جداکشت ریشه گردید. برگ‏لپه‏ای در تیمار 2 میلی‏گرم درلیتر NAA و5/0 میلی‏گرم درلیترBAP بالاترین درصد ریشه‏زایی و میانگین تعداد ریشه را تولید کرد. درصد کالوس‏زایی و آغازش کالوس ریزنمونه ساقه بیشتر از دیگر ریزنمونه‏ها بود، در‏حالی‏که درصد باززایی کالوس در سه ریزنمونه مورد مطالعه اختلاف معنی‏داری نداشت. اما بیشترین میانگین تعداد شاخه‏های حاصل از کالوس‏های باززا‏شده در ریزنمونه برگ‏لپه‏ای دیده شد. آزمایش دوم با ترکیبی از غلظت‏های مختلف 2,4-D و BAP، تحت تاثیر دو تیمار تاریکی مطلق و 16 ساعت دوره روشنایی، انجام شد. طبق نتایج، بالاترین مقدار صفات مورد بررسی، مربوط به تیمار 16 ساعت دوره روشنایی بود. ریزنمونه‏های برگ‏لپه‏ای و ساقه بیشترین درصد کالوس‏زایی و ریزنمونه برگی بیشترین وزن کالوس را نشان دادند. در‏حالی‏که بالاترین درصد باززایی کالوس و نرخ رشد کالوس از ریزنمونه ریشه بدست آمد. بیشترین وزن کالوس در ریزنمونه برگی و درغلظت 5/0 میلی‏گرم در لیتر 2,4-D و3 میلی‏گرم در لیتر BAP و بالاترین نرخ رشد کالوس در ریزنمونه ریشه و در غلظت 5/0 یا 1 میلی‏گرم در لیتر 2,4-D و3 میلی‏گرم در لیتر BAP و بیشترین درصد باززایی کالوس در ریزنمونه ریشه و درغلظت 2 میلی‏گرم در لیتر 2,4-D و2 میلی‏گرم در لیتر BAP و یا تنها درغلظت 3 میلی‏گرم در لیتر BAP مشاهده شد.

واژه‏های کلیدی: ازمک، القای کالوس، باززایی مستقیم، بهینه‏سازی کشت بافت.

مقدمه

ازمک (Lepidium draba L.) یک علف هرز چند‏ساله و متعلق به خانواده شب‏بو (Brassicaceae) است که توسط بذر، قطعات ریشه و ریزوم تکثیر می‏شود. هر گیاه حدود یک تا پنج هزار بذر تولید می‏کند که جوانه‏زنی آن‏ها در پاییز است و زمستان و اوایل بهار را به صورت روزت سپری می‏کنند (Jacobs, 2007).  گیاه ازمک بومی اروپا و آسیا است (Mohlenbrock, 2013). در حقیقت این گیاه بومی آسیای مرکزی  و سیبری است، که از آن جا به جنوب اروپا منتقل و در حال حاضر به همه قاره ها گسترش یافته است (Ball, 1993; Jalas et al., 1996) و البته در ایران نیز بومی جنوب غرب کشور است (Koie and Rechinger, 1954-55). این گیاه غنی از گلوکورافانین[†] است که از گلوکوزینولات‏ها[‡] به‏شمار می‏آید و شامل نیتروژن و سولفور می‏باشد، که تقریبا به‏طور انحصاری در گیاهان خانواده براسیکا یافت می‏شود ( Del Carmen Martínez-Ballesta et al., 2013). گلوکوزینولات در بافت آسیب‏دیده گیاهی به ترکیب ارزشمند سولفورافان[§] تبدیل می‏شود (Bones and Rossiter, 2006; Del Carmen Martínez-Ballesta et al., 2013). این متابولیت دارای خواص ضد‏سرطانی و ضد‏میکروبی است (Fahey et al., 2002). گلوکورافانین خالص‏شده از L. draba به‏عنوان افزودنی به رژیم غذایی برای درمان سرطان و فشار خون بالا استفاده شده است (Powell et al., 2005a,b). همچنین محققین، ازمک را دارویی با خاصیت ضد‏اسکروی[**] معرفی کردند (Mojab et al., 2003). براساس تحقیقات صورت‏گرفته، مشخص شده است که گیاه ازمک علاوه بر خواص دارویی و مقابله با پاتوژن‏ها، میزان جذب بالایی از نظر عناصر سرب، روی، منگنز، آهن، مس و کادمیوم دارد (Chehreghani and Malayeri, 2007; Cheraghi et al., 2011; Nouri et al., 2011). با این قابلیت، ازمک می‏تواند گیاهی ارزشمند در مباحث گیاه‏پالایی باشد. با وجود این خواص و ویژگی‏ها در گیاه ازمک، افزایش ترکیبات دارویی و اصلاح صفات آن بایستی مورد توجه قرار گیرد. تاکنون از کشت این ویترو به‏منظور باززایی یا تکثیر اغلب گونه‏های گیاهی از جمله گیاهان دارویی استفاده شده است. ازدیاد در شرایط درون شیشه­ای دارای پتانسیل بالایی برای تولید گیاهان دارویی با کیفیت مناسب است و این مهم، می تواند از طریق روش‏های مختلف ریزازدیادی بدست آید. ریزازدیادی در گونه‏های گیاهی متنوعی از جمله تعداد زیادی از گیاهان دارویی شامل Catharanthus roseus, Datura melet, Digitalis spp., Cinchona ledgeriana, Chlorophytum borivilianum, Bacopa monnieri نتایج مطلوبی را نشان داده است (Kayser and Quax, 2007; Tripathi, 2003). اندام‏زایی در شرایط درون شیشه به استفاده از هورمون‏های گیاهی و همچنین به توانایی بافت‏ها برای پاسخ به تغییرات هورمونی در طول کشت وابسته است (Akbas et al., 2009). اگرچه میزان تنظیم‏کننده­های خارجی به شدت به ژنوتیپ و مقدار هورمون داخلی گیاه بستگی دارد (Bhaskaran and Smith , 1990)، اما به‏طور کلی کنترل فرآیندهای تمایزیابی بستگی به حضور اکسین و سیتوکینین داشته و توازن بین آن‏ها تولید اندام هوایی و ریشه‏ها را سبب می­شود. انتخاب یک ریزنمونه در مرحله رشد مطلوب نقش اساسی در موفقیت‏آمیز بودن کشت بافت در شرایط درون شیشه بازی می کند. پیچیدگی مورفولوژیکی یک ریزنمونه به همراه انتخاب تنظیم‏کننده‏های رشد گیاهی مناسب، تاثیر چشم‏گیری بر باززایی نوساقه‏ها و القای کالوس دارد (Khawar et al., 2005). هرچند که سن ریزنمونه‏ها و نحوه قرار گرفتن آن‏ها روی محیط کشت نیز حائز اهمیت است (Neibaur et al., 2008). کشت بافت روشی مناسب جهت تکثیر آسان برای تولید گیاهان یکسان از نظر ژنتیکی و افزایش ماده مؤثره می‏باشد (Azizi and Omidbeigi, 2002).  در شرایط آزمایشگاهی می‏توان متابولیت‏های باارزش مورد‏نظر را در تمام فصول سال و با مقدار و کیفیت دلخواه تولید کرد (Debnath et al., 2006). همچنین پیش‏نیاز بسیاری از روش‏های انتقال ژن، بهینه‏سازی شرایط کشت بافت جهت انجام باززایی با راندمان بالا است. گونه‏های مختلف، ارقام درون گونه‏ای و اندام‏های مختلف یک گیاه، به یک روش کشت بافت واکنش یکسان نشان نمی‏دهند (Farsi and Zolala, 2003). بدیهی است دست‏یابی به روش‏های کارآمد و تکرار‏پذیر جهت باززایی و تولید گیاهچه‏های عاری از بیماری با حداقل تنوع ژنتیکی در زمان کوتاه، می‏تواند در این گیاه مؤثر واقع شود. لذا بهینه‏سازی کشت درون شیشه‏ای ازمک ضمن تکثیر استریل گیاه و استفاده از آن برای تولید متابولیت‏های ثانویه، جهت تهیه گیاه تراریخته دارای صفات مطلوب با روش‏های نوین مهندسی ژنتیک نیز اهمیت دارد. تاکنون از کشت درون شیشه‏ای به‏منظور تکثیر و باززایی Lepidium meyenii (Poizerova et al., 2010) و L. campestre   (Ivarson et al., 2013) و برخی دیگر از گونه های جنس  Lepidium استفاده شده است. اما تنها یک مورد،  باززایی گیاه ازمک از طریق کشت بافت، توسطGhotbzadeh Kermani et al.  (2012)، گزارش شده است و در مورد بهینه‏سازی کشت بافت گیاه دارویی ازمک گزارشی وجود ندارد. تحقیق حاضر با هدف بهینه‏سازی سیستم کشت بافت ازمک به منظور افزایش باززایی و عوامل مختلف تأثیرگذار بر آن برای مطالعات بعدی در خصوص ریزازدیادی، مهندسی ژنتیک و انتقال ژن‏های مطلوب به این گیاه و بهبود ویژگی­های کمی و کیفی آن انجام گرفت.

مواد و روش‏ها

بذور ازمک از اطراف شهر کرمان جمع‏آوری و در هرباریوم دانشگاه شهید باهنر کرمان شناسایی شدند. استریل کردن بذر، پس از شستشو با آب و مواد شوینده، با الکل 70 درصد به مدت30 ثانیه و محلول هیپوکلریت سدیم 5/2 درصد به مدت 15 دقیقه انجام شد. در نهایت بذرها سه مرتبه با آب مقطر استریل آبکشی شدند. بذرهای استریل بر روی محیط کشت پایه MS  با غلظت یک دوم (Murashige and Skoog, 1962) حاوی 5/1 درصد ساکارز و 5 گرم در لیتر آگار با  pHمعادل 8/5، برای جوانه‏زنی، قرار گرفتند. پس از دو هفته از گیاهچه‏های دو برگی یکنواخت، سه نوع ریزنمونه  برگ لپه‏ای و قطعات یک سانتی‏متری ساقه و ریشه تهیه گردید. ریزنمونه‏ها در قالب سه تکرار، بر روی محیط کشت پایه MS حاوی3 درصد ساکارز و 8 گرم در لیتر آگار با pH معادل 8/5، با شش سطح 4، 2، 1، 5/0، 2/0، 0 میلی‏گرم در لیتر NAA[††] و هفت سطح 5/4، 4، 3، 2، 1، 5/0، 0 میلی­گرم در لیتر BAP[‡‡] در اتاقک رشد در شرایط  16ساعت روشنایی و 8 ساعت تاریکی با دمای 26 درجه سانتی‏گراد کشت شدند. همچنین در آزمایشی دیگری به‏منظور  تولید کالوس، سه ریزنمونه  برگ لپه‏ای، ساقه و ریشه مشابه قبل، بر روی محیط کشت پایه MS حاوی 3 درصد ساکارز و 8 گرم در لیتر آگار با pH معادل 8/5، با چهار سطح  2، 1، 5/0، 0 میلی‏گرم در لیتر 2,4-D[§§] و پنج سطح 3، 2، 1، 5/0، 0 میلی‏گرم درلیترBAP  کشت و در دمای 26 درجه سانتی‏گراد تحت دو تیمار نوری، تاریکی مطلق و 16 ساعت دوره روشنایی قرار گرفتند.

اندازه گیری و محاسبه صفات مورد نظر

پس از گذشت یک ماه نمونه‏ها پایش و در آزمایش اول درصد پاسخ‏دهی، درصد شاخه‏زایی مستقیم، میانگین تعداد شاخه مستقیم، درصد ریشه‏زایی، میانگین تعداد ریشه، درصد کالوس‏زایی، درصد آغازش کالوس، درصد باززایی کالوس و میانگین تعداد شاخه حاصل از کالوس‏های باززا‏شده محاسبه شد. در آزمایش دوم نیز درصد کالوس‏زایی، وزن تر کالوس، نرخ رشد کالوس و درصد باززایی کالوس مورد بررسی قرار گرفت. درصد پاسخ‏دهی، درصد شاخه‏زایی مستقیم، درصد ریشه‏زایی و درصد کالوس‏زایی در هر پتری از تقسیم تعداد ریزنمونه‏هایی که صفت مورد نظر را نشان داده بودند، بر تعداد کل ریزنمونه‏های پتری و ضرب کردن در عدد 100 بدست آمد. برای محاسبه درصد آغازش کالوس تعداد کل کالوس‏های پتری بر تعداد ریزنمونه‏هایی که در آن پتری تولید کالوس کرده بودند تقسیم و در 100 ضرب شد. همچنین از تقسیم تعداد کالوس‏های باززا‏شده بر تعداد کل کالوس‏های پتری و ضرب در عدد 100، درصد باززایی کالوس‏ها بدست آمد. به‏منظور محاسبه میانگین تعداد شاخه مستقیم و میانگین تعداد ریشه، تعداد کل شاخه مستقیم یا ریشه در پتری بر تعداد ریزنمونه‏هایی که شاخه‏زایی یا ریشه‏زایی داشتند تقسیم شد. میانگین شاخه حاصل از کالوس‏های باززا‏شده از تقسیم مجموع تعداد شاخه‏های باززا‏شده از کالوس‏ها بر تعداد کل کالوس‏های باززا‏شده پتری بدست آمد. میانگین وزن تر کالوس و میانگین نرخ رشد کالوس محاسبه‏شده در تیمارهای حاوی سطوح مختلف 2,4-D و BAP به ترتیب از تقسیم وزن کل کالوس‏های پتری بر تعداد ریزنمونه‏های پاسخ‏داده و تقسیم وزن کل کالوس‏های پتری بر مجموع وزن اولیه ریزنمونه‏های پاسخ‏داده حاصل شد.

القای ریشه و سازگاری با محیط

ریزنمونه‏هایی که اندام‏زایی داشتند به قطعات کوچکتر تقسیم و در سطح محیط القای ریشه که محیط MS کامل حاوی 2/0 میلی‏گرم در لیترNAA  بود، کشت شدند. پس از ریشه‏دار شدن، نمونه‏ها جهت توسعه ریشه و رشد بیشتر ساقه‏ی نوپدید به محیط  MSکامل بدون هورمون، حاوی ساکارز و آگار با همان نسبت­های قبل منتقل شدند و به مدت دو هفته در شرایط نوری و دمایی قبل قرار گرفتند. گیاهچه‏هایی که در محیط توسعه رشد کافی داشتند، به گلدان‏های کوچک حاوی پیت ماس استریل انتقال یافتند. این نمونه‏ها تا زمان استقرار کامل و سازگاری با شرایط گلدانی، با محیط مایع حاوی نصف غلظت نمک های MS آبیاری شدند. برای سازگاری تدریجی با شرایط طبیعی (حفظ رطوبت نسبی بالا و کنترل آلودگی) از سرپوش‏های شفاف استفاده شد. پس از سازگاری، سرپوش‏ها حذف گردید و گیاهان به شرایط طبیعی خاک منتقل شدند.

تجزیه آماری

آزمایش به صورت فاکتوریل در قالب طرح کاملاً تصادفی با سه تکرار انجام و داده‏ها با استفاده از نرم افزار  SPSS 22 تجزیه گردیدند. با توجه به اینکه اکثر داده‏ها بر اساس درصد بودند، برای نرمال کردن توزیع داده‏ها، از تبدیل داده زاویه‏ای  استفاده شد و در مواردی که داده‏ی صفر نیز وجود داشت از   استفاده گردید (Westhof, 1999). تجزیه واریانس با استفاده از آزمون   Fو مقایسه میانگین‏ها با استفاده از آزمون چند‏دامنه‏ای دانکن در سطح احتمال 5 درصد صورت گرفت. در پایان نمودارها در محیط  Excel  رسم شدند.

نتایج و بحث

تحقیق حاضر با هدف بهینه‏سازی کشت بافت گیاه دارویی ازمک انجام شد. برای این منظور از گیاهچه‏های دو برگی یکنواخت ازمک سه نوع ریزنمونه برگ لپه، ساقه و ریشه تهیه شد. به‏طور معمول نوع ریزنمونه، ظرفیت شاخه‏زایی و باززایی متفاوتی در محیط کشت دارد و برگ لپه‏ای در بیشتر موارد شاخه‏زایی بیشتری نسبت به قطعات برگ نشان می‏دهد (Guo et al., 2005).  بنابراین، در این آزمایش ریزنمونه برگی، از برگ‏های لپه‏ای انتخاب شد. به‏منظور بررسی تأثیر برخی از تنظیم‏کننده‏های رشد (BAP,2,4-D, NAA)، ریزنمونه برگ لپه‏ای، ساقه و ریشه در محیط کشت­های پایه MS، حاوی نوع و غلظت‏های متفاوت هورمونی، کشت شدند. کشت­های حاوی دو هورمون NAA و BAP پس از گذشت یک ماه بررسی و صفات مورد‏نظر شمارش و محاسبه شد. نتایج حاصل از تجزیه واریانس داده‏های مربوط به درصد پاسخ‏دهی، درصد شاخه‏زایی مستقیم، میانگین تعداد شاخه مستقیم، درصد ریشه‏زایی، میانگین تعداد ریشه ، درصد کالوس‏زایی، درصد آغازش کالوس، درصد باززایی کالوس و میانگین تعداد شاخه حاصل از کالوس‏های باززا‏شده، به‏طور جداگانه، نشان داد که اثر هر یک از تنظیم‏کننده‏های رشد و ریزنمونه به تنهایی و همچنین اثرات متقابل آن‏ها، همگی در سطح احتمال 5 درصد معنی‏دار می‏باشند (جدول1). مقایسه میانگین‏ها با استفاده از آزمون دانکن در سطح احتمال 5 درصد مشخص کرد، بیشترین درصد پاسخ‏دهی ریزنمونه‏ها مربوط به ریزنمونه ریشه است (شکل1) و همچنین بیشترین درصد شاخه‏زایی مستقیم را نیز ریزنمونه ریشه داشته است (شکل2-الف). در جداکشت ریشه بین 53 تا 100  درصد، پاسخ­دهی مشاهده شد و در 22 تیمار از 42 تیمار اعمال‏شده، پاسخ‏دهی 100 درصد بود، که بیانگر قابلیت بالای باززایی این ریزنمونه است. در اکثر تیمارهای اعمال‏شده بر ریزنمونه ریشه درصد پاسخ‏دهی و درصد شاخه‏زایی مستقیم بالایی مشاهده شد، به‏طوری که مقایسه میانگین­ها اختلاف معنی‏داری بین آن‏ها نشان نداد. تیمارهایی که سطح هورمون BAP در آن‏ها بیش از NAA بوده است شاخه‏زایی مستقیم بیشتری را در ریزنمونه ریشه القا کردند. بیشترین درصد شاخه‏زایی مستقیم جداکشت ساقه در تیمارهای فاقد NAA دیده شد. برگ لپه‏ای در‏حالی‏که کمترین درصد شاخه‏زایی مستقیم را داشته است اما در تیمار2/0 میلی‏گرم درلیتر NAA و 5/0 میلی‏گرم درلیتر BAP و تیمار 4 میلی‏گرم درلیتر NAA و1 میلی‏گرم درلیتر BAP درصد شاخه‏زایی مستقیم بالایی را ایجاد کرد.

.

شکل1-  درصد پاسخ‏دهی ریزنمونه‏های مختلف گیاه ازمک در غلظت‏های متفاوت NAA و BAP. حروف روی شکل برحسب آزمون دانکن در سطح 5 درصد می‏باشد.

Figure 1- Response rate on different concentrations of NAA and BAP in  Lepidium draba explants.  The letters on columns are based on Duncan test (p≤0.05).

در مقایسه میانگین­ها ریزنمونه ریشه بیشترین میانگین تعداد نوساقه مستقیم را نیز نشان داد و ریزنمونه برگ و ساقه به ترتیب در گروه دوم و سوم قرار داشتند (شکل2-ب). این صفت در تیمار 1 میلی‏گرم درلیتر BAP بدون حضور NAA در جداکشت ریشه حداکثر میزان خود را نشان داده است. تیمار 1 میلی‏گرم درلیتر NAA و 5/0 میلی‏گرم در لیتر BAP و تیمار4 میلی‏گرم درلیتر NAA و 3 میلی‏گرم درلیتر BAP در ریزنمونه برگی بیشترین تعداد شاخه را ایجاد کردند. در‏حالی‏که  Ghotbzadeh Kermani et al.  (2012)، در تیمار 1 یا 3 میلی‏گرم در لیتر BAP بدون حضور NAA بیشترین میزان این صفت را در برگ لپه‏ای مشاهده کردند. ساقه‏زایی از ریزنمونه‏های مختلف در گونه‏های براسیکا تحت تأثیر تعادل هورمونی استفاده‏شده است که می‏تواند ناشی از موقعیت متفاوت فیزیولوژیکی ریزنمونه (Dunwell et al.,1976) و یا تحت کنترل ژنتیکی باشد (Jain et al., 1988). Guo et al. (2005) معتقدند که حضور اکسین در کنار سیتوکینین باعث باززایی بهتر بر روی ریزنمونه‏های برگ لپه‏ای می‏شود. Ghasemi et al. (2007) نیز بیان می‏کنند که حضورNAA  با غلظت یک میلی‏گرم در لیتر در محیط کشت باعث اندام‏زایی مؤثر کلزا می‏شود.

در تیمارهای شاهد نیز باززایی از ریزنمونه‏های گیاه ازمک خصوصا جداکشت ریشه مشاهده شد. البته درصد اندک جوانه‏زنی در محیط فاقد هورمون (شاهد) را می‏توان به حضور عناصر معدنی، کربن و نیز هورمون‏های ذخیره‏شده در قسمت‏های مختلف گیاه نسبت داد، اما باززایی در تیمار شاهد ریزنمونه ریشه این گیاه، به میزان قابل توجهی بوده است. در بررسی درصد ریشه‏زایی ریزنمونه‏ها، این‏بار جداکشت برگ لپه‏ای بیشترین درصد را داشته است (شکل2-ج). همچنین بیشترین میانگین تعداد ریشه تولید‏شده نیز مربوط به ریزنمونه برگی است (شکل2-د). با‏این‏حال در این گیاه ریزنمونه‏های برگ پاسخ‏دهی دیرتری به محیط کشت بافت داشتند.

ریزنمونه برگ در تیمار 2 میلی‏گرم درلیتر NAA و 5/0 میلی‏گرم درلیتر BAP و تیمار 2 میلی‏گرم درلیتر NAA و 1 میلی‏گرم درلیتر BAP بیشترین درصد ریشه‏زایی(100درصد) را داشته و بیشترین میانگین تعداد ریشه را نیز در تیمار اول یعنی 2 میلی‏گرم درلیتر NAA و 5/0 میلی‏گرم درلیتر BAP نشان داده است. جداکشت ریشه و ساقه کمترین درصد ریشه‏زایی و میانگین تعداد ریشه را داشتند با‏این‏حال تیمار 2 میلی‏گرم درلیتر NAA بدون حضور BAP هم در ریزنمونه ریشه و هم در ساقه توانسته است بالاترین درصد ریشه‏زایی و بالاترین میانگین تعداد ریشه را در این ریزنمونه‏ها القا کند.

جدول1- نتایج تجزیه واریانس اثر نوع ریزنمونه و تنظیم‏کننده‏های رشد NAA وBAP  بر صفات مورد بررسی در آزمایش اول.

Table1- Analysis of Effect of explants and growth regulators NAA and BAP on traits in first test.

*: در سطح 5 درصد معنی‏دار

در بررسی اثر تنظیم‏کننده‏های رشد NAA و BAP بر تولید کالوس، پس از گذشت دو هفته تشکیل کالوس بر روی ریزنمونه ساقه در اکثر محیط‏های کشت به‏کار‏رفته به جز محیط‏های شاهد فاقد هورمون و در تعداد زیادی از ریزنمونه‏های برگ و ریشه قابل مشاهده بود. محاسبه درصد کالوس‏زایی و تجزیه آماری داده‏ها پس از یک ماه نشان داد که اثر تیمارهای  NAA وBAP  به‏تنهایی و همچنین اثرات متقابل آن‏ها معنی‏دار است. بنابراین در هرسه ریزنمونه ترکیب مؤثرNAA  و  BAP موجب کالوس‏زایی می‏شود. در آزمایشات کشت بافت، استفاده از بخش‏های هوایی برای باززایی شاخه‏های نوپدید رایج‏تر است و نتایج مطلوب‏تری نیز دارد. در‏این‏میان قطعات هیپوکوتیل به دلیل قابلیت رشد سریع و عدم تمایزیابی شدید به سمت اندام‏ها بیشتر مورد استفاده قرار می‏گیرند (Sama et al., 2012; Dixon et al., 1996). درصد کالوس‏زایی و درصد آغازش کالوس ریزنمونه ساقه بیشترین مقدار بوده است (شکل3-الف و ب). بیشترین کالوس‏دهی در تیمار 4 میلی‏گرم درلیتر NAA و 2 میلی‏گرم درلیتر BAP و تیمار 4 میلی‏گرم درلیتر NAA و 5/0 میلی‏گرم درلیتر BAP ریزنمونه ساقه مشاهده شد. دو سطح 2و4 میلی‏گرم درلیتر NAA، برای اولین‏بار، در این آزمایش،  بر روی ریزنمونه‏های گیاه ازمک مورد بررسی قرار گرفته است که تأثیر چشم‏گیری بر روی کالوس‏زایی ریزنمونه‏ها به‏ویژه جداکشت ساقه نشان داد.

شکل2-  الف) درصد شاخه‏زایی مستقیم، ب) میانگین تعداد شاخه مستقیم، ج) درصد ریشه‏زایی و د) میانگین تعداد ریشه در ریزنمونه‏های مختلف گیاه ازمک در غلظت‏های متفاوت  NAA و BAP. حروف روی شکل برحسب آزمون دانکن در سطح 5 درصد می‏باشد.

Figure 2 - a) Direct shoot regeneration rate, b) Direct shoot generation, c) Root production rate and d) Root generation  on different concentrations of NAA and BAP in  Lepidium draba explants . The letters on columns are based on Duncan test (p≤0.05).

در مطالعه حاضر با استفاده از تنظیم‏کننده‏های رشد NAA  و BAP، ریزنمونه ساقه از نظر بیشترین میزان کالوس‏دهی به‏عنوان ریزنمونه بهتر پیشنهاد می‏شود؛ این در‏حالی است که Ghotbzadeh Kermani et al. (2012)، برگ لپه‏ای را در حضور این دو هورمون، ریزنمونه بهتر در تولید کالوس معرفی کردند؛ اما کهریزی و همکاران نیز اعلام کردند که محور زیر لپه و برگ لپه‏ای کلزا در محیط کشت بافت به ترتیب برای تولید کالوس و باززایی مستقیم مناسب هستند (Kahrizi et al., 2010). همچنین بالاترین درصد کالوس‏زایی در Brassica juncea (55/65 درصد) در محور زیر لپه مشاهده شده است (Bano et al., 2010). مشاهده شد که درصد آغازش کالوس به ناحیه برش‏خورده و نوع ریزنمونه بستگی دارد و در این آزمایش بین صفر تا280 درصد متغییر بوده است که بیانگر توانایی تولید بیش از یک کالوس، در یک ریزنمونه است.

شکل3-  الف) درصد کالوس‏زایی، ب) درصد آغازش کالوس، ج) درصد باززایی کالوس و د) میانگین تعداد شاخه حاصل از کالوس‏های باززا‏شده در ریزنمونه‏های مختلف گیاه ازمک در غلظت‏های متفاوت NAA و BAP. حروف روی شکل برحسب آزمون دانکن در سطح 5 درصد می‏باشد.

Figure 3- a) Callus induction rate, b) Callus initiation rate, c) Callus regeneration  rate and d) shoot generation from regenerated callus on different concentrations of NAA and BAP in  Lepidium draba explants.  The letters on columns are based on Duncan test (p≤0.05).

در ریزنمونه‏های ساقه، کالوس در دو سر برش‏یافته ریزنمونه تشکیل شد و در برخی از تیمارها به‏تدریج در طی چند روز سرتاسر ریزنمونه را فرا گرفت (شکل4-الف و ب). در ریزنمونه‏های برگ لپه‏ای ابتدا کالوس در نزدیکی دمبرگ و در ادامه روی قسمت‏هایی از برگ که در تماس با محیط کشت بود، دیده شد (شکل4-ج). قابل ذکر است که کالوس‏های تولید‏شده در محیط کشت حاوی تنظیم‏کننده‏های رشد NAA وBAP  اکثرا جنین‏زا بوده و پس از گذشت زمان، بدون انتقال به محیط باززایی، تولید نوساقه کردند (شکل4-د). در مقایسه میانگین‏ها هر سه نوع ریزنمونه از جهت درصد باززایی کالوس در یک گروه قرار گرفتند و اختلاف معنی‏داری بین آن‏ها مشاهده نشد (شکل3-ج). بیشترین میانگین تعداد شاخه‏های حاصل از کالوس‏های باززا‏شده در ریزنمونه برگ لپه‏ای بوده است و ریزنمونه ریشه و ساقه در گروه دوم قرار گرفتند (شکل3-د).

شکل4- روند کالوس‏زایی و باززایی کالوس درگیاه ازمک در غلظت‏های متفاوت  NAA و BAP. الف و ب) تشکیل کالوس در ریزنمونه ساقه، ج) تشکیل کالوس در ریزنمونه برگ لپه‏ای، د) باززایی کالوس.

Figure 4- Callus induction  and callus regeneration in Lepidium draba on different concentrations of NAA and BAP, a&b)  Callus induction in stem explants, c) Callus induction in cotyledon, d)  Callus regeneration.

تیمار 2 میلی‏گرم درلیتر NAA و 4 میلی‏گرم درلیتر BAP و تیمار 1 میلی‏گرم درلیتر NAA و 5/4 میلی‏گرم درلیتر BAP در برگ لپه­ای حداکثر مقدار میانگین تعداد شاخه‏های حاصل از کالوس‏های باززا‏شده را نشان دادند. کالوس‏های حاصل از ریزنمونه ساقه نیز در اکثر تیمارها باززایی مطلوبی نشان دادند. تیمار 2 میلی‏گرم درلیتر NAA و 3 میلی‏گرم درلیتر BAP و تیمار 2 میلی‏گرم درلیتر NAA و 4 میلی‏گرم درلیتر BAP در ریشه میانگین تعداد شاخه‏های حاصل از باززایی کالوس بالایی داشتند. به‏طور‏کلی بیشترین درصد باززایی کالوس و میانگین تعداد شاخه‏های حاصل از کالوس‏های باززا‏شده در هر سه ریزنمونه در تیمارهای حاوی 2،1و4 میلی‏گرم درلیتر NAA و سطوح مختلفBAP مشاهده شد.

در بحث القای ریشه، هدف از انتقال شاخه به محیط ریشه‏زایی تحریک آن به ایجاد ریشه و تبدیل به گیاه کامل و کسب شرایط لازم برای انتقال به محیط آزاد است. تحریک ساقه به ایجاد ریشه در گونه‏های علفی به آسانی انجام می‏گیرد. به همین دلیل در گیاه ازمک ریشه‏زایی، تکامل و سازگاری با محیط به سهولت انجام شد (شکل5).

در تکثیر گیاهان دارویی، باززایی گیاه از کالوس کاربرد فراوانی دارد (Kokate, 2006). باززایی گیاه از کالوس در گیاهان دارویی چون Echinacea pallid, Mentha arvensis, Plumbago rosea  Dioscorea alata,  و چندین گونه گیاه دارویی دیگر گزارش شده است (Tripathi, 2003). همچنین بافت کالوس گیاهی علاوه بر ازدیاد گیاهان، قابلیت‏های متنوع دیگری نیز دارد که از جمله می‏توان به استفاده از آن در انتقال ژن به گیاه و یا  کاربرد کالوس در تهیه کشت‏های سوسپانسیون سلولی به‏منظور تولید متابولیت‏های ثانویه و یا ترکیبات مفید دیگر حاصل از آن اشاره نمود (Kayser and Quax,  2007). میزان تولید کالوس بستگی به ترکیب هورمون‏های به‏کار‏رفته در محیط کشت دارد وتعادل بین هورمون‏های اکسین و سیتوکینین یک فاکتور مورفوژنتیکی تعیین‏کننده و مهم به‏ شمار می‏رود (Abbasi et al., 2007).

اکسین و سیتوکنین به‏عنوان تنظیم‏کننده‏های رشد گیاهی، فاکتورهای کلیدی برای کنترل تقسیم سلولی در شرایط کشت بافت می‏باشند. استفاده از  BAPبه‏عنوان سیتوکنین و 2,4-D به‏عنوان اکسین به‏منظور تولید کالوس در کشت بافت گیاهان زیادی گزارش شده است (Awale et al., 2006). همچنین گزارش شده است که ترکیب هورمون2,4-D  و سیتوکینین در تسهیل القای کالوس و حفظ آن موثر است (Abd Elaleem et al., 2009). بسته به گونه گیاهی، نوع و سن ریزنمونه‏های مورد استفاده، غلظت به خصوصی از این هورمون‏ها بیشترین تأثیر را در کالوس‏زایی گیاهان نشان داده است.

برای نمونه،  He et al.(2006) اثر هورمون‏های رشد گیاهی را بر کالوس‏زایی گیاه دارویی باباآدم بررسی کردند و نشان دادند که  2,4-D با غلظت 2  میلی‏گرم در لیتر و BAP در دامنه غلظتی 1 تا 2 میلی‏گرم در لیتر، بیشترین درصد فراوانی 100) درصد( را برای تولید کالوس داشتند. همچنین در گیاه  Ceropegia candelabrum L. ترکیبی از2,4-D  و BAPبرای القای کالوس مؤثر واقع شد (Beena and Martin, 2003).

کالوس‏زایی توسط ترکیبی از این دو هورمون گیاهی در گیاهان دیگری مانند Curcuma longa L.  و Kaempferia galanga L. نیز مورد بررسی قرار گرفته و نتایج مشابهی را داشته است (Saenouk, 2011).  تنوع در فراوانی تولید کالوس در پاسخ به سطوح مختلف هورمونی، می‏تواند به دلیل تمایز در بیان ژن‏های کنترل‏کننده تولید کالوس باشد. همچنین ممکن است که در بعضی از سطوح هورمونی مورد استفاده، برخی از ژن‏های مسئول در سنتز کالوس، به‏طور کامل بیان نشوند (Mahmood et al., 2012). به‏علاوه، گزارش شده است که غلظت‏های خیلی زیاد 2,4-D ممکن است برای بیان ژن‏های درگیر در تقسیم سلولی و تمایززدایی بافت، مهار‏کننده باشد (Mahmood et al., 2012). از جمله عواملی که در تولید کالوس موثرند، ژنوتیپ، تنظیم‏کننده‏های رشد، محیط کشت، نوع هیدرات کربن، نوع جداکشت، سن جداکشت و شرایط محیطی می‏باشد. نتایج نشان داده است که وابستگی خاص القای کالوس و باززایی گیاه به ژنوتیپ اجتناب‏ناپذیر و کلی است و القای کالوس و باززایی گیاه با ژنوتیپ گیاه تغییر می‏کند (Han et al., 2011).

شکل5- ساقه‏زایی مستقیم در غلظت‏های متفاوت  NAA و BAP و ایجاد گیاهچه ازمک. الف) ساقه‏زایی مستقیم، ب) گیاه در محیط توسعه، ج) گیاه کامل در محیط پیت ماس، د) گیاه سازگار‏شده با محیط.

Figure 5- Shoot regeneration on different concentrations of NAA and BAP and  regenerated plantlet of Lepidium draba. a) Direct shoot regeneration, b) Elongation, c) Plant in peat moss, d) Adapted plant to environment.

میزان تنظیم‏کننده‏های خارجی و مواد مغذی موجود جهت القای کالوس به رقم گیاهی وابسته است؛ بنابراین ترکیبات محیط کشت وابسته به ژنوتیپ گیاهی تغییر می‏کند (Han et al., 2011). رشد کالوس در یک گونه گیاهی بر اساس نوع جداکشت آن گیاه متفاوت بوده و علت آن به درستی مشخص نشده است. توانایی القای کالوس وباززایی با سن برگ نیز تحت تأثیر قرار می‏گیرد. معمولا برگ‏های جوان برای باززایی مناسب ترند (Magyar-tabori et al., 2010).  

تحقیق حاضر روش ساده‏ای برای القاء کالوس توسط هورمون‏های گیاهی 2,4-D و BAP نیز ارائه می‏دهد. به‏منظور  تولید کالوس سه ریزنمونه  برگ لپه‏ای، ساقه و ریشه، تحت دو تیمار نوری، تاریکی مطلق و 16 ساعت دوره روشنایی کشت شدند. پایش کشت‏های حاوی سطوح مختلف از دو هورمون 2,4-D و BAP پس از گذشت یک ماه انجام شد. بررسی‏های اولیه نشان داد، در مقایسه با تیمار شاهد، تیمارهای حاوی 2,4-D در هر سه ریزنمونه، پس از گذشت یک ماه، عموما باززایی مستقیم نداشته و بیشتر کالوس‏زایی دیده شد؛ اما در تیمارهایی که صرفا حاوی BAP بودند، باززایی مستقیم هم مشاهده شد. کالوس‏ها در کلیه نمونه‏ها ابتدا در محل برش ریزنمونه و به‏تدریج در طول آن ظاهر شدند. زمان بنیان‏گذاری کالوس در دوره نوری 16 ساعت روشنایی، هفته اول پس از کشت و رنگ این کالوس‏ها سبز روشن بود. این در‏حالی است که نمونه‏ها در تاریکی مطلق در هفته سوم و چهارم پس از کشت شروع به تولید کالوس‏هایی سخت‏تر، کم حجم‏تر و کرم رنگ نمودند (شکل 6). طبق گزارشی از Gasper et al. (1985)، نور، فعالیت IAA اکسیداز را افزایش می‌دهد و باعث تغییر تعادل اکسین/سیتوکینین و کاهش بنیان‌گذاری و رشد کالوس می‌شود.

شکل 6- کالوس‏زایی در غلظت‏های متفاوت  2,4-Dو BAP در گیاه ازمک. الف) در دوره نوری 16ساعت روشنایی ب) درتاریکی مطلق.

Figure 6- Callus induction  in Lepidium draba on different concentrations of 2,4-D and BAP. a) In 16 h photoperiod, b) In darkness.

در این آزمایش بالاترین مقدار صفات مورد بررسی، در تیمار 16 ساعت دوره روشنایی مشاهده شد و عامل نور در حضور تنظیم‏کننده‏های رشد 2,4-D و BAP، فاکتوری موثر بر تولید و رشد کالوس در هر سه ریزنمونه از گیاه ازمک شناخته شد. نتایج حاصل از تجزیه واریانس داده‏های مربوط به درصد کالوس‏زایی، میانگین وزن تر کالوس، درصد باززایی کالوس و میانگین نرخ رشد کالوس، به‏طور‏جداگانه، مشخص نمود که اثر هر یک از تنظیم‏کننده‏های رشد، ریزنمونه و فاکتور نور به‏تنهایی و همچنین اثرات متقابل آن‏ها، همگی در سطح احتمال 5 درصد معنی‏دار می‏باشند (جدول2). مقایسه میانگین‏ها با استفاده از آزمون دانکن در سطح احتمال 5 درصد نشان داد درصد کالوس‏زایی و درصد باززایی کالوس در ریزنمونه‏های برگ و ساقه تفاوت معنی‏داری نداشته و در یک گروه قرار می‏گیرند. درصد کالوس‏زایی در برگ و ساقه نسبت به ریشه بیشتر بوده (شکل7-الف)، در‏حالی‏که درصد باززایی کالوس‏های ریشه بیشتر از برگ و ساقه است (شکل7-ب). در مقایسه میانگین وزن کالوس‏های سه ریزنمونه، بیشترین میانگین وزن کالوس در برگ و کمترین آن در ریشه بود (شکل7-ج)، در‏حالی‏که مقایسه میانگین نرخ رشد کالوس در سه ریزنمونه نشان داد که، بیشترین میانگین نرخ رشد را ریشه و کمترین آن را برگ داشته است (شکل7-د). وزن اولیه ریزنمونه‏های ریشه کمتر از ریزنمونه‏های برگ بوده است بنابراین طبیعی است که میانگین نرخ رشد در ریشه بیشتر از برگ و در حدود سه برابر آن باشد در‏حالی‏که میانگین وزن کالوس در برگ بیشتر از ریشه است.

جدول2- نتایج تجزیه واریانس اثر نوع ریزنمونه و تنظیم‏کننده‏های رشد 2,4-D وBAP  بر صفات مورد بررسی در آزمایش اول.

Table2- Analysis of Effect of explants and growth regulators 2,4-D and BAP on traits in first test.

*: در سطح 5 درصد معنی دار

شکل7-  الف) درصد کالوس‏زایی، ب) درصد باززایی کالوس، ج) میانگین وزن تر کالوس و د) میانگین نرخ رشد کالوس در ریزنمونه‏های مختلف گیاه ازمک در غلظت‏های متفاوت 2,4-D و BAP. حروف روی شکل برحسب آزمون دانکن در سطح 5 درصد می‏باشد.

Figure 7- a) Callus induction rate, b) Callus regeneration  rate, c) Callus weight and d) Callus growth rate  on different concentrations of 2,4-D and BAP in  Lepidium draba explants.  The letters on columns are based on Duncan test (p≤0.05).

بالاترین مقدار صفات مورد بررسی، در تیمار 16 ساعت دوره روشنایی مشاهده شد. در این تیمار درصد کالوس‏زایی در اکثر تیمارهای اعمال‏شده بر ریزنمونه برگ وساقه بالا بوده و اختلاف معنی‏داری نداشتند، اما بیشترین وزن کالوس در ریزنمونه برگی و درغلظت 5/0 میلی‏گرم در لیتر 2,4-D و3 میلی‏گرم در لیتر BAP و بیشترین نرخ رشد کالوس در ریزنمونه ریشه و در غلظت 5/0 یا 1 میلی‏گرم در لیتر 2,4-D و3 میلی‏گرم در لیتر BAP و بیشترین فراوانی باززایی کالوس در ریزنمونه ریشه و درغلظت 2 میلی‏گرم در لیتر 2,4-D و2 میلی‏گرم در لیتر BAP و یا تنها در غلظت 3 میلی‏گرم در لیتر BAP بوده است. با توجه به نتایج حاصل از کشت سه نوع ریزنمونه برگ لپه‏ای ، ساقه و ریشه در  سطوح  مختلف 2,4-D و BAP مشخص شد، تیمار 16 ساعت دوره روشنایی و 5/0 میلی‏گرم در لیتر 2,4-D و3 میلی‏گرم در لیتر BAP در جداکشت برگ لپه‏ای گیاه ازمک جهت کالوس‏زایی، مناسب است؛ چرا که این تیمار علاوه بر تولید بیشترین وزن کالوس از جمله تیمارها با بیشترین فراوانی کالوس‏زایی است.

اگرچه باززایی از طریق کالوس درتولید انبوه گیاهان اهمیت قابل ملاحظه‏ای دارد اما به دلیل بالا بودن احتمال وقوع تنوع سوماکلونی و صرف زمان نسبتاً طولانی‏تر برای تکثیر رویشی با هدف حفظ ژنوتیپ‏های معین، چندان مناسب نیست (Dixon et al., 1996; Debnath et al., 2006). با این‏حال بافت کالوس گیاهی در انتقال ژن به گیاه، در تهیه کشت‏های سوسپانسیون سلولی به‏منظور تولید متابولیت‏های ثانویه و... کاربرد دارد.

بر اساس نتایج حاصل از این بررسی چنانچه در تحقیقی هدف از کشت بافت ازمک ایجاد تنوع، جهت امکان گزینش صفات باشد، بهتر است که از کشت ریزنمونه برگ لپه‏ای و ساقه  استفاده گردد. چرا که گذر گیاه از مرحله کالوس موجب تنوع می‏شود و کشت ریزنمونه برگ لپه‏ای و ساقه در این گیاه برای تولید کالوس مناسب‏تر است، پس برای ایجاد تنوع در گیاهچه‏های باززایی‏شده کشت ریزنمونه برگ لپه‏ای و ساقه  توصیه می‏شود. ولی چنانچه حفظ ریخته ژنتیکی در مراحل تراریختی و ریزازدیادی مورد نظر باشد، بهتر است که از کشت ریزنمونه ریشه  استفاده گردد، چرا که در گیاه ازمک ریزنمونه ریشه دارای درصد باززایی مستقیم بالایی می‏باشد. در تحقیق حاضر گیاه دارویی ازمک قابلیت باززایی مستقیم و تولید کالوس قابل توجهی را در محیط کشت بافت نشان داد که با نتایج Ghotbzadeh Kermani et al. (2012)، مطابقت دارد.

با توجه به اینکه ریزنمونه‏های گیاه دارویی ازمک، به‏ویژه جداکشت ریشه، درصد باززایی بالایی نه‏تنها در تیمارهای هورمونی مختلف بلکه در محیط شاهد فاقد هورمون نشان داده‏اند، می‏توان از این  قابلیت ویژه به‏منظور بررسی امکان انتقال ژن به گیاه ازمک در روش‏های بدون نیاز به  کشت بافت نیز بهره برد.