نوع مقاله : مقاله پژوهشی
نویسندگان
1 2- استادیارگروه علوم کشاورزی، دانشگاه پیام نور، صندوق پستی 3697-19395 تهران، ایران
2 مشهد - دانشگاه فردوسی مشهد - گروه علوم دام
3 استاددانشکدهکشاورزی-غذا و مرکز PP ژنومیک دانشگاه بلونیا، ایتالیا
4 مشهد مشهد دانشگاه فردوسی مشهد دانشکده کشاورزی بخش علوم دامی
چکیده
کلیدواژه‌ها
عنوان مقاله [English]
نویسندگان [English]
In whole genome association study, genomic selection, Determining of extent and level of linkage disequilibrium (LD) is important in sample size and marker density. In this experiment, the blood and sperm samples were collected form 1089 Holstein bulls and 2030 markers on chromosome 6 were genotyped by using Illumina Bovine SNP50K BeadChip based on UMD3.1 genome assembly. Data were corrected for missing genotyped SNP and individual with unknown genotype by Plink. After correction 1606 markers remained (79%). The average observed heterozygosity was 0.37 and 80% of the markers had minor all frequency more than 0.2. The LD was calculated with r2 and Dˊ by Haploview v4.2. The extent of LD in this study was 40 kb with r2=0.3. The r2 value was decreasing to 0.2 (moderate level) in 80kb and 0.1 (background level) in 300 kb. The effective population size has been decreased to 100 individual in 10 generations ago. The 49 haplotype blocks with range 18-472 kb were detected that covering the 10.6 Mb of whole chromosome. These results showed that between 4000-70000 markers or one marker per 40-75 kb will be need for whole genome association study in this Holstein population.
کلیدواژه‌ها [English]
بررسی فاز عدم تعادل لینکاژی بر روی کروموزوم شماره 6 گاوهای نژاد هلشتاین
مریم نصرتی1*، مجتبی طهمورث پور2، لوکا فونتانزی3، محمدرضا نصیری2
1 استادیار، گروه کشاورزی، دانشگاه پیام نور، صندوق پستی 3697-19395، تهران، ایران
2،3 استاد گروه علوم دامی، دانشکده کشاورزی، دانشگاه فردوسی مشهد، ایران
3 استاد دانشکده کشاورزی- غذا و مرکزژنومیک دانشگاه بلونیا، ایتالیا
تاریخ دریافت: 21/12/1391، تاریخ پذیرش: 22/01/1395
چکیده
در مطالعات ارتباطی و انتخاب ژنومی تعیین وسعت عدم تعادل لینکاژی، در تشخیص میزان نشانگر مورد نیاز و اندازه نمونه، اهمیت دارد. دراین پژوهش از 1089 گاو نر هلشتاین نمونه خون و اسپرم تهیه شد و با استفاده از بسته نشانگری K50 شرکت ایلومینا ژنوتیپ 2030 نشانگر بر روی کروموزوم شماره 6 بر مبنای اسمبلی UMD3.1 ژنوم گاو تعیین شد. دادهها برای جهش تکنوکلئوتیدی نادرست و افراد با ژنوتیپهای نامشخص با استفاده از نرمافزار Plink تصحیح شد. پس از تصحیح 1606 نشانگر (%79) باقی ماند. متوسط هتروزیگوسیتی مشاهده شده 37/0 بود و %80 نشانگرها حداقل فراوانی آللی بالاتر از 2/0 داشتند. عدم تعادل لینکاژی با محاسبه دو پارامتر Dˊ و r2 از طریق نرمافزار Haploview محاسبه شد. در این مطالعه وسعت عدم تعادل لینکاژی kb40 ( 3/0=r2 ) برآورد شد و مقدار r2 در kb80 به 2/0(سطح متوسط) و در kb300 به 1/0 (سطح پایه)کاهش یافت. اندازه موثر جمعیت در 10 نسل قبل حدود 100 راس بود. علاوه بر این، 49 بلوک هاپلوتیپی با دامنه kb472-18 و پوشش Mb 6/10 از کل کروموزم شناسایی شد. نتایج این پژوهش نشان داد که بطور تقریبی بین 70000- 40000 نشانگر یا یک نشانگر به ازاء هر kb 75-40 برای مطالعات ارتباطی کل ژنوم در این جمعیت مورد نیاز است.
واژگان کلیدی: عدم تعادل لینکاژی، گاو هلشتاین، کروموزوم 6، اندازه موثر جمعیت.
مقدمه
در سالهای اخیر علاقمندی به استفاده از دادههای جهش تک نوکلئوتیدی در برنامههای اصلاحنژادی دام افزایش یافته است. از جمله این مطالعات که اخیرا˝ بطور گستردهای مورد توجه قرار گرفته است محاسبه عدم تعادل لینکاژی با استفاده از نشانگرهای همباز دوآللی، جهشهای تکنوکلئوتیدی، میباشد. عدم تعادل لینکاژی یا عدم تعادل فاز گامتی به ارتباط غیرتصادفی آللهای دو لوکاس مختلف بر روی یک کروموزم در یک گامت گفته میشود(Lewontion& Kojima,1960). تهیه نقشههای عدم تعادل لینکاژی ژنوم در انجام صحیح مطالعات ارتباطی، انتخاب ژنومی و نقشهیابی جایگاه صفات کمی مفید است (Meuwissen et al., 2001; Gautier et al., 2007). اساس انتخاب ژنومی بر مبنای پایداری فاز عدم تعادل لینکاژی بین نشانگر و جایگاه صفت کمی در خلال نسلها است. گاهی نشانگر و جایگاه صفت کمی در یک جمعیت در عدم تعادل لینکاژی هستند اما در جمعیت دیگر یا در نسلهای دیگر در عدم تعادل نیستند. علت این اختلاف میتواند در اشتقاق جمعیتها در سالهای خیلی قبل، تغییر در اندازه موثر جمعیت و/یا فاصله بزرگ بین نشانگر و جایگاه صفت کمی باشد که منجر به شکستن عدم تعادل لینکاژی جمعیت اولیه و تغییر آن در زیر جمعیتهای حاصله میشود (Hill & Robertson,1968; De Ross et al., 2008). بطور متداول عدم تعادل لینکاژی با دو پارامتر r2 و Dˊ اندازهگیری میشود. اولین مطالعه بر روی عدم تعادل لینکاژی ژنوم گاو توسط Farnir et al (2000) صورت گرفت. آنها با استفاده از 248 نشانگر میکروساتلیت سطح بالای از عدم تعادل لینکاژی را در فاصله cM 40 بر روی گاوهای سیاه-سفید هلندی شناسایی کردند. بسیار از مطالعات دیگر با استفاده از نشانگر میکروساتلیت سطح بالای از عدم تعادل لینکاژی در وسعت زیاد گزارش کردند (Vallejo et al., 2003; Tenesa et al. 2003; Varilo et al., 2003; odani et al., 2006). اولین مطالعه با استفاده از نشانگر دو آللی، جهش تکنوکلئوتیدی توسط Khatkar et al (2006) و با استفاده از 220 جهش تکنوکلئوتیدی بر روی کروموزوم شماره 6 در 433 گاو هلشتاین استرالیایی انجام شد. آنها دریافتند که میزان Dˊ در وسعتی معادل cM 20 تا سطح پایه کاهش مییابد، علاوه بر این، آنها نشان دادند که کاهش وسعت عدم تعادل لینکاژی در نشانگر جهش تکنوکلئوتیدی سریعتر از نشانگر میکروساتلیت است. مطالعات متعددی با استفاده از جهش تکنوکلئوتیدی نتایج آنها را تایید کرد (Khtakar et al., 2008; Marques et al., 2008, McKay et al., 2007). تراکم بالای جهش تکنوکلئوتیدی و توارثپذیری پایین جهشها، منجر به تشخیص بلوکهای هاپلوتیپی اجدادی و احتمال یکسان اجدادی بودن آن میشود (Vignal et al., 2002). مطالعات اخیر بر روی عدم تعادل لینکاژی با استفاده از بسته نشانگری K50 شرکت ایلومینا منجر به شناسایی سطح بالای عدم تعادل لینکاژی اما در مسافتهای کوتاه شده است (Sargolzaei et al., 2008; Qanbari et al., 2009; Bohmanova et al., 2010; Lu et al., 2012).
کروموزم شماره 6 گاو با طول حدود Mb 123 تاکنون موضوع بسیاری از مطالعات جایگاه صفت کمی مانند سخت زایی (Olsen et al.,2008)، تولید شیر (Olsen et al.,2004; Freyer et al., 2002 )، درصد چربی شیر (Schnabel et al 2005)، درصد پروتئین شیر (Freyer et al., 2002) بوده است. در پژوهشی Lee et al (2008) سه جایگاه صفت کمی برای ضخامت چربی پشت، افزایش وزن روزانه و وزن نهایی در فواصل 0، 35 و 63 سانتیمورگان در گاوهای گوشتی هانوو کره را شناسایی کردند. با وجود شناسایی تعداد قابل توجهی جایگاه صفت کمی بر روی این کروموزوم به نظر میرسد هنور تعداد قابل توجهی جایگاه باقی مانده است که به دلائل مختلف شناسایی نشده است. با توجه به تراکم بالای نشانگر برای این کروموزوم در بسته نشانگری k50، شناسایی تعداد بیشتری از این جایگاهها امکان پذیر خواهد بود. از این رو به نظر میر سد بررسی وسعت و سطح عدم تعادل لینکاژی کروموزوم 6 برای تعیین تراکم نشانگر مورد نیاز در مطالعات نقشهیابی جایگاه صفات کمی جمعیت مورد مطالعه مفید است. علاوه بر این انجام چنین مطالعاتی برای همگی کروموزومهای اتوزوم گاو مستلزم صرف وقت و انجام محاسبات پیچیده و طولانی است. لذا در این پژوهش تنها کروموزوم 6 مورد مطالعه قرار گرفت. مضاف بر این تاکنون مطالعاتی از این قبیل در کشور صورت نگرفته است، لذا با وجود این که دامهای مورد استفاده در این تحقیق بومی کشور ایتالیا بوده است اما انتشار نحوه انجام پژوهش و نتایج آن زمینه را برای آشنایی علاقمندان به اینگونه موضوعات فراهم خواهد کرد.
مواد و روشها
نمونهگیری و تعیین ژنوتیپ
بهطورکلی 1089 نمونه اسپرم و خون از گاوهای نر هلشتاین دارای شجره از موسسه[1]ANAFI ایتالیا تهیه شد. روابط شجره در غالب پدربزرگ پدری، پدر و پسران پدر بود. در آنالیزهای انجام شده شجره منظور نشد زیرا براساس مطالعات موجود اعمال شجره با برآورد بیش از واقعیت عدم تعادل لینکاژی همراه خواهد بود (Marques et al., 2008; Bohmanova et al., 2010). استخراج DNA از خون و اسپرم با استفاده از کیت استخراج DNA پرومگا (Wizard® Genomic DNA Purification kit (Promega Corporation, Madison, WI)) درآزمایشگاه ژنتیک مرکز ژنومیک حیوانات اهلی، دانشگاه بولونیا کشور ایتالیا انجام شد.
در این پژوهش از بسته نشانگری [2] K50 شرکت ایلومینا (نوع یک) برای تعیین ژنوتیپ 2030 جهش تکنوکلئوتیدی در سراسر کروموزوم شماره 6 استفاده شد. نمونههای DNA با غلظت(ng/ml) 400- 200 با محلول 1/0 نرمال سود دناتوره شده و سپس با محلول MA2 (کیت ایلومینا) خنثی شده تا برای تکثیر آماده شود. در مرحله بعد محلول MSM[3] که حاوی مستر میکس است به DNA اضافه شده و سپس پلیت در آون هیبریداسیون در دمای 37 درجه سانتیگراد به مدت 24-20 ساعت انکوبه شد تا تکثیر صورت گیرد. این روش موجب تکثیر DNA بطور یکنواخت تا چندین برابر و بدون خطا خواهد شد. DNA تکثیر شده توسط سیستم آنزیمی تحت کنترل به قطعات کوچکتر بریده شد. DNA هضم شده با 2-پروپانول 100% مخلوط و با سانتریفیوژ در دمای 4 درجه سانتیگراد رسوب داده شد و دوباره با محلول بافر هیبریداسیون سوسپانسیون شد. در مرحله بعد نمونههای DNA بر روی چیپ قرار داده شد و به مدت 24-16 در دمای 48 در آون هیبریداسیون نگهداری شد. در این مرحله از طریق سیستم مویرگی موجود در اطراف چیپ و تزریق محلولهای هیبریداسیون، ابتدا DNA دناتوره شده و سپس هیبرید میشود. پس از هیبریداسیون، شستشو چیپ برای حذف DNA هیبرید نشده انجام شد. نمونهها برای بسط تک بازی و رنگ آمیزی آماده شد و محلول TEM در اطراف چیپ رها شده تا با استفاده از نوکلئوتیدهای نشاندار (فلورسنس) تکثیر صورت گیرد. پس از این مرحله DNA الگو توسط محلول فرمامید %95 بر 1 میکرومول EDTA حذف شد. چیپ با استفاده از iScanReader تحت لیزر قرار گرفته تا فلورسنس تک باز انتهای پرایمرهای بسط داده شده در آرایه دانه برانگیخته شود. نور ساطع شده ثبت شد و دادهها بدست آمده از این تصویر با Illumina’s BeadStudio v1.0 تصحیح شد. بر اساس مطالعات Disken et al (2008) گاهی در هنگام هیبریداسیون بدلیل نوسان در غلظت DNA نمونههای مختلف و محتوی سیتوزین و گوانین متفاوت اتصال پروبها بطور یکنواخت صورت نمیگیرد این پدیده را امواج ژنومیکی[4] مینامند که بر بازخوانی ژنوتیپها اثر میگذارد. بدین منظور ژن کال اسکور (GenCall Score ) نمونهها بررسی شد. این یک کمیت متریک برای نشان دادن واقعیتپذیری ژنوتیپهای خوانده شده است که حد آستانه آن 15/0 است. ژنوتیپها با ژنکال اسکور کمتر از 15/0 بدلیل عدم اطمینان در تعیین ژنوتیپ صحیح حذف شد.
تصحیح دادهها
فایل ایجاد شده از نرمافزار BeadStudio بصورت یک فایل ردیفی داده است. با استفاده از برنامه نویسی به زبان پایتون فرمت ورودی نرمافزار Plink در غالب دو فایل Ped و Map تهیه شد. فایل Ped حاوی ژنوتیپهای هر فرد در تمامی لوکاسهای مورد نظر و فایل Map شامل محل و موقعیت این نشانگرها روی کروموزوم شماره 6 بر اساس اسمبلی UMD3.1 ژنوم گاو بود. نشانگرها با حداقل فراوانی آللی بیشتر از 5% و نرخ تعیین ژنوتیپ بیش از %90 برای آنالیزهای بعدی انتخاب شدند. افراد با بیش از 10% ژنوتیپ از دست رفته از آنالیزها حذف شد. پس از تصحیح 1606 نشانگر در غالب 1074 فرد باقی ماند. فایلها پس از تصحیح به فرمت ورودی نرمافزار Haploview تبدیل شد. کلیه گرافها با R ترسیم شد.
اندازهگیری عدم تعادل لینکاژی و تعیین ساختار بلوکهای هاپلوتیپی
دو پارامتر Dˊ (فرمول 1) و r2 (فرمول 2) برای اندازه گیری عدم تعادل لینکاژی وجود دارد. پارامتر Dˊ که در سال 1964 ارائه شد (Lewontin, 1964) از فرمول زیر بدست میآید به میزان زیادی وابسته به فراوانی آللی میباشد.
(1)
D اختلاف حاصلضرب فراوانی گامتهای جفتی از حاصلضرب فراوانی گامتهای دفعی است و DMax حداکثر مقدار D در فراوانی آللی داده شده است. DˊAB میزان عدم تعادل لینکاژی در دو لوکاس مجاور A و B است. بدلیل وابستگی پارامتر DˊABبه فراوانی آللی، در مطالعات سالهای اخیر کمتر از این پارامتر استفاده میشود. پارامتر r2 در قالب فرمول زیر محاسبه شد:
(2)
که D2AB همان مربع مقدار عدم تعادل لینکاژی در دو لوکاس مجاور A و B است. PAوPB فراوانی آللی در لوکاسA و B است. هر دو پارامتر توسط نرمافزار Haploview محاسبه شد. سپس جفت نشانگرها بر اساس فاصله از کم به زیاد مرتب شد و به فاصلههای متعدد تا مسافت Mb 5 تقسیم شد. برای هر فاصله متوسط و میانه پارامترهای r2 و Dˊ محاسبه شد.
ساختار بلوکهای هاپلوتیپی و الگوی آنها در ژنوم برای مطالعات ارتباطی در انسان و دام مفید است (Barrett et al., 2004; Qanbari et al., 2009). لذا، در این پژوهش ساختار بلوکهای هاپلوتیپی با استفاده از Haploview بررسی شد. بر اساس تعریف Gabrie et al (2002) بلوک هاپلوتیپی به ناحیهای از ژنوم اطلاق میشود که مقدار Dˊ با حدود اطمینان %95 بین 98/0-70/0 باشد.
محاسبه اندازه موثر جمعیت
در یک جمعیت ایدهآل به تعداد افرادی که مقدار مشخصی از پرورش خویشاوندی را نشان میدهند اندازه موثر جمعیت میگویند(Wright et al., 1938). در خلال نسلها عدم تعادل لینکاژی توسط نوترکیبی در فواصل بلند شکسته میشود. بنابراین عدم تعادل لینکاژی در فواصل بلند میتواند منعکس کننده اندازه موثر جمعیت در نسلهای اخیر و عدم تعادل لینکاژی در فواصل کوتاه منعکس کننده اندازه موثر جمعیت در نسلهای دور خواهد بود(Hayes et al 2003). در این مطالعه اندازه موثر جمعیت از رابطه زیر بدست آمد:
(3)
که E(r2) متوسط عدم تعادل لینکاژی در فاصله مورد نظر است، α میزان نرخ جهش، n اندازه نمونه و c نرخ نوترکیبی است. پارامتر αدر زمان عدم حضور جهش 1 و در حضور جهش 2 در نظر گرفته میشود(Sved, 1971) . سن اندازه موثر جمعیت برای هر فاصله از رابطه c2/1 محاسبه میشود. فاصله فیزیکی بین جهشهای تکنوکلئوتیدی از طریق رابطه cM1= Mb1 محاسبه شد. در این مطالعه بر اساس فواصل موجود، اندازه موثر جمعیت تا 2500 نسل قبل محاسبه شد.
نتایج و بحث
هتروزیگوسیتی و مشخصات نشانگری جمعیت
جدول 1 تعداد افراد و مشخصات نشانگرها را برای کروموزم 6 نشان میدهد. متوسط فاصله بین نشانگرها حدود kb63 بود که مشابه نتایج Bohmanova et al (2010) (kb 64) بود. میانگین حداقل فراوانی آللی 28/0 بود که کمی بیشتر از مقدار گزارش شده برای پانل K50 بود (25/0) ( Gibbs et al., 2009). بر اساس مطالعات مختلف پارامترهای Dˊ و r2 متاثر از فراوانی آللی پایین هستند (Pritchard & Przeworski, 2001; Sargolzaei et al., 2008). شکل 1 توزیع حداقل فراوانی آللی را در گروههای مختلف نشان میدهد. بیش از %80 از جهشهای تکنوکلئوتیدی فراوانی بالاتر از 2/0 داشتند. این مقدار نشان دهنده تاثیر پایین حداقل فراوانی آللی در محاسبه عدم تعادل لینکاژی است.
روند عدم تعادل لینکاژی
روند تغییرات عدم تعادل لینکاژی با افزایش فاصله بر روی کروموزوم 6 در شکل 2 نشان داده شده است. بطور کلی با افزایش فاصله جفت نشانگرها مقدار عدم تعادل لینکاژی کاهش یافت و بالاترین مقادیر در فواصل کوتاه مشاهده شد. این کاهش در r2 به شکل نمایی بود و شیب کاهش در r2 بیشتراز Dˊ بود. سطح پایه ( 1/0= r2 )، متوسط ( 2/0= r2 ) و مفید ( 3/0= r2 ) عدم تعادل لینکاژی در فاصله به ترتیب kb 300-200، kb 80-60 و kb40-20 مشاهده شد (جدول 2). در مطالعه Sargolzaei et al (2008) با استفاده از پانل K 10 شرکت افی متریکس با 5562 نشانگر پس از تصحیح، سطح مفید عدم تعادل لینکاژی در کمتر از kb 100 مشاهده شد.
جدول 1- مشخصات نشانگری کروموزم 6.
Table 1- Marker characteristic on chromosome 6.
|
کروموزوم Chr
|
طول کروموزوم Chr. Length(Mb) |
تعداد دام No. individual |
هتروزیگوستی مشاهده شده Obs. Heterozygosity |
تعداد SNP قبل/بعد تصحیح SNP No. before/ after correction |
میانگین MAF Mean MAF |
میانگین فاصله Mean distances(kb) |
میانکین r2±SD Mean r2±SD |
|
BTA6 |
122.5 |
1074 |
0.37 |
1606/2030 |
0.28 |
62.67 |
0.096±0.006 |
شکل 1- هیستوگرام توزیع فراوانی آللی کوچک.
Figure 1- Minor allele frequency histogram.
اختلاف مشاهده شده میتواند ناشی از این موضوع باشد که مقدار گزارش شده توسط Sargolzaei et al (2008) در فاصله مورد نظر برای کل ژنوم برای 5562 نشانگر بوده است، در حالی که مقدار گزارش شده در این مطالعه فقط برای کروموزوم شماره شش و با 1606 نشانگر پس از تصحیح بود. بر اساس مطالعات مختلف نرخ نوترکیبی در کروموزمهای مختلف متفاوت است، بعلاوه بر روی یک کروموزم نیز نرخ نوترکیبی از ناحیه سانترومریک به ناحیه تلومریک افزایش مییابد. این موضوع میتواند منجر به تنوع در مقدار و وسعت عدم تعادل لینکاژی در نواحی مختلف ژنوم شود (Arias et al. 2009). در مطالعهای دیگر بر روی گاوهای هلشتاین آلمان با استفاده از پانل K 50 شرکت ایلومینا، 3/0= r2 در فاصله کمتر از kb 25 و 2/0= r2 را در فاصله kb 75-50 مشاهده شد که تقریبا با نتایج این پژوهش مطابقت داشت (Qanbari et al., 2010). در پژوهش Bohmanova et al (2010) سطح متوسط عدم تعادل لینکاژی در گاوهای هلشتاین کانادا در فاصله کمتر ازkb 60 مشاهده شد که مشابه مقدار گزارش شده در این مطالعه است ولی سطح پایه در فاصلهkb 500 مشاهده گردید. علاوهبراین در مطالعه عدم تعادل لینکاژی در سه نژاد آنگوس، کارولایز( Charolais) و C با پانل K 50 به ترتیب سطح 29/0، 22/0 و 21/0 در فاصله کمتر از kb 30 گزارش گردید که کمتر از نتایج این پژوهش بود (Lu et al., 2012). علت آن میتواند در اختلاف نژاد باشد، زیرا نژادهای گوشتی مورد مطالعه در پژوهش Lu et al (2012) کمتر تحت انتخاب بوده و در نتیجه سطح عدم تعادل لینکاژی پایینتری در مقایسه هلشتاین دارند. برخی نقاط در تصویر 2 مشاهده میشود که حتی بافاصله بیش از Mb 2 دارای r2 بالای هستند در حالی که وسعت عدم تعادل لینکاژی پایه در این مطالعهkb 300-200 است یعنی بایستی در دورتر از این فاصله r2 کمتر از 1/0 باشد. دلیل آن میتواند ناشی از انتخاب برای صفات مهم اقتصادی مانند تولید شیر در نژاد هلشتاین باشد که منجر به انتخاب نشانگرهای موثر بر این صفات میگردد، انتقال همراه، آلل ها دور از هم که بر صفت موثرند در خلال نسلها منجر به تاثیر اثر اپیستاتیک در افزایش عدم تعادل لینکاژی میگردد (et al 2000 Farnir ). با توجه به حضور جایگاه صفت کمی موثر بر تولید شیر در کروموزوم شماره 6 وجود جفت نشانگرها با r2 بالا در فواصل نه چندان نزدیک مورد انتظار است. شکل (b)2 نرخ کاهش Dˊ با افزایش فاصله تا Mb 5 را نشان میدهد. با افزایش فاصله میزان Dˊ کاهش مییابد اما تا انتهای Mb 5 نرخ کاهش نسبتا˝ کند است و تعداد قابل توجهی نشانگر یافت میشود که Dˊ نزدیک به 1 دارد. در فاصله kb 40-20 میانگین Dˊ تقریبا %77 است و پس از آن در فاصله Mb 1- kb 500 به نزدیک %50 میرسد(جدول2). میانگین مقدار Dˊ در کمتر از kb20 برابر با 87/0 بود که با نتایج Khatkar et al (2008) مطابقت داشت. همچنین در فاصله kb 60-40 مقدار گزارش شده (73/0) با نتایج Bohmanova et al (2010) مطابقت داشت.
|
|
شکل 2- روند کاهش مقدار r2 (a) و Dˊ (b) با افزایش فاصله.
Figure 2- the trend of decay in r2 (a) and Dˊ(b) with increasing distance.
جدول 2- مقادیر پارامترهای r2 و Dˊ در فواصل مختلف بر روی کروموزم 6.
Table 2- The r2 and Dˊ value in different distance on chromosome 6.
|
فاصله Distance (Mb) |
جفت های نشانگری Markers pair |
میانگین فاصله Average distance (Mb) |
میانه Dˊ Median Dˊ |
میانگین Dˊ ±SD Mean Dˊ ±SD |
میانه r2 Median r2 |
میانگین r2±SD Mean r2±SD
|
تعداد نشانگر با r2>0.3 Marker number with r2>0.3 |
|
<0.02 |
261 |
6.07 |
1 |
0.82±0.42 |
0.22 |
0.42±0.35 |
126 |
|
0.02-0.04 |
629 |
29.6 |
0.99 |
0.77±0.33 |
0.17 |
0.30±0.33 |
224 |
|
0.04-0.06 |
419 |
49.4 |
0.92 |
0.73±0.32 |
0.09 |
0.22±0.26 |
97 |
|
0.06-0.08 |
457 |
69.6 |
0.84 |
0.71±0.31 |
0.10 |
0.19±0.23 |
96 |
|
0.08-0.1 |
459 |
89.98 |
0.73 |
0.65±0.34 |
0.07 |
0.15±0.21 |
62 |
|
0.1-0.2 |
2199 |
149.6 |
0.60 |
0.60±0.34 |
0.06 |
0.13±0.18 |
181 |
|
0.2-0.3 |
2230 |
250.1 |
0.60 |
0.56±0.34 |
0.05 |
0.1±0.14 |
174 |
|
0.3-0.4 |
2154 |
349.7 |
0.53 |
0.53±0.33 |
0.05 |
0.09±0.12 |
135 |
|
0.4-0.5 |
2156 |
449.9 |
0.47 |
0.51±0.33 |
0.04 |
0.08±0.11 |
110 |
|
0.5-1 |
10550 |
750.3 |
0.46 |
0.50±0.33 |
0.04 |
0.08±0.11 |
469 |
|
1-3 |
39200 |
1992.5 |
0.4 |
0.33±0.29 |
0.03 |
0.06±0.08 |
965 |
|
3-5 |
39311 |
3990.2 |
0.33 |
0.40±0.27 |
0.02 |
0.04±0.06 |
377 |
سطح مفید عدم تعادل لینکاژی در مطالعات ارتباطی
غالب صفات کمی تحت کنترل تعداد زیادی ژن (جایگاه صفت کمی) هستند که یافتن نشانگرهای پیوسته به این ژنها در مطالعات ارتباطی اهمیت فوق العادهای دارد. بدین منظور تعیین سطح مفید عدم تعادل لینکاژی برای محاسبه تراکم مناسب نشانگر در این مطالعات ضروری است (Zhao et al., 2005; Ardlie et al., 2002). سطح مفید عدم تعادل لینکاژی در واقع میزان تنوع جایگاه صفت کمی است که در نشانگر مشاهده میشود. Meuwissen et al (2000) گزارش کردند برای افزایش صحت برآورد ارزش ارثی ژنومی تا 85/0 مقدار عدم تعادل لینکاژی (r2) حداقل بایستی 2/0 باشد. از طرفی اندازه نمونه با میزان r2 رابطه معکوس دارد. یعنی اندازه نمونه بایستی بر اساس r2/1 افزایش یابد تا قدرت تعیین جایگاه صفت کمی برابر زمانی شود که بصورت مستقیم برآورد میشود (Pritchard and Przeworski 2001). بنابراین، r2 تعیینکننده قدرت آماری مطالعات ارتباطی است (Sargolzaei et al 2008). سطح مفید عدم تعادل لینکاژی برمبنای محدودیت در افزایش اندازه نمونه تعیین میشود. در اغلب مطالعات 3/0 < r2 بعنوان سطح مفید عدم تعادل لینکاژی در نظر گرفته شده است(Sargolzaei et al, 2008; Lu et al 2012; De Ross et al 2008; Ardlie et al., 2002). لذا، اگر سطح مفید عدم تعادل لینکاژی 3/0 در نظر گرفته شد. بر این اساس، سه برابر افزایش در اندازه نمونه نسبت به حالت شناسایی مستقیم جایگاه صفات کمی و 70000 نشانگر برای پوشش کل ژنوم یعنی یک نشانگر به ازاء هر kb 40 برای مطالعات ارتباطی و انتخاب ژنومی مورد نیاز است(شکل3). در صورتی که سطح مفید عدم تعادل لینکاژی 2/0 =r2 در نظر گرفته شود این مقدار به یک نشانگر به ازاء هر kb 75 و 40000 نشانگر برای پوشش کل ژنوم کاهش می یابد، اما اندازه نمونه بایستی به 5 برابر افزایش یابد (شکل 3).
شکل 3- تعیین سطح مفید عدم تعادل لینکاژی در نمودار روند کاهش r2 با افزایش فاصله.
Figure 3- Useful level of LD in r2 decay with increasing distance.
اندازه موثر جمعیت
تشخیص اندازه موثر جمعیت در جوامع مختلف در شناسایی ساختار صفات پیچیده اهمیت دارد (Reich & Lander 2001). گاو متعلق به یک گروه قدیمی از پستانداران به نام سیتارتیوداکتیل (Cetartiodactyla) است که حدود 60 میلیون سال قبل پیدایش یافته است. گاوهای اهلی امروز، در حدود 250 هزار سال پیش از اجداد مشترکی اشتقاق یافتهاند(Burt et al., 2009) و اندازه موثر جمعیت آنها در حدود ده هزار نسل قبل به چندین هزار راس کاهش یافته است. تشکیل نژادها و اصلاح ژنتیکی آنها منجر شد این مقدار به چند صد راس در 50 نسل قبل برسد (De Roos et al., 2008). شکل 4 روند کاهشی اندازه موثر جمعیت از 2500 تا 10 نسل قبل را نشان میدهد. اندازه موثر جمعیت در 2500 نسل قبل در حدود 1700 راس بوده است که این مقدار در 1000 نسل قبل به 1400 راس رسیده است و در حدود 10 نسل قبل به حدود 100 راس کاهش یافته است که با نتایج سایر مطالعات مطابقت دارد (Qanbari et al. 2009; Sargolzaei et al 2008; Bohmanova et al, 2010; De Ross et al 2008). این محاسبات در عدم حضور جهش است در صورتی که 2=α در معادله لحاظ شود این مقدار به کمتر از 100 راس کاهش مییابد. مقادیر گزارش شده برای اندازه موثر جمعیت بصورت تقریبی صحیح میباشد زیرا در معادله فرض میشود که اندازه Net ثابت است در صورتی که در حقیقت متغییر است. اما اگر Net بصورت خطی تغییر کند نتایج بطور تقریبی صحیح است.
شکل 4- اندازه موثر جمعیت در نژاد هلشتاین.
Figure 4- effective population size in Holstein population.
ساختار بلوکهای هاپلوتیپی
مطالعات ارتباطی برپایه هاپلوتیپها، روش قدرتمندی در شناسایی ژنهای موثر بر بیماریها(انسان) و صفات کمی (حیوانات اهلی) است. در این پژوهش بلوکهای هاپلوتیپی بر اساس روش Gabriel et al (2002) با استفاده از نرمافزار Haploview مشخص گردید. در حدود 49 بلوک هاپلوتیپی با طول Mb 6/10 در سرتاسر کروموزم 6 یافت شد. کوتاهترین بلوک kb 18 و بلندترین آنها kb 476 طول داشت. بیشتر بلوکها طولی در حدود kb 200-100 داشتند (%86/42) و کمترین میزان مربوط به بلوکهای با طول بیش از kb 400 و کمتر از kb 100 بود (شکل5). بطور کلی بدلیل انتخاب در نژاد هلشتاین تشکیل تعداد قابل توجهی بلوک هاپلوتیپی قابل پیش بینی است. انتخاب از چند طریق منجر به افزایش موضعی عدم تعادل لینکاژی و تشکیل بلوکهای هاپلوتیپی میشود. بدین ترتیب که انتخاب برای آللهای مطلوب و حذف آللهای نامطلوب باعث میشود آللهای لوکاسهای مجاور نیز، انتخاب و یا حذف شوند این پدیده را انتخاب همراه (Hitchhiking) می نامند که منجر به ایجاد عدم تعادل لینکاژی در ناحیه تحت انتخاب میشود (Farnir et al. 2000). علاوهبراین، انتخاب از طریق اثر اپیستاتیک بین آللهای لوکاسهای دور از هم منجر به افزایش عدم تعادل لینکاژی بین نشانگرهای روی یک کروموزوم میشود، میزان عدم تعادل لینکاژی ایجاد شده بستگی به شدت انتخاب و فاصله نسلی دارد (Ardlie et al., 2002).
شکل 5- پراکنش بلوکهای هاپلوتیپی بر روی کروموزم 6.
Figure 5- distribution of haplotype blocks in chromosome 6.
نتیجهگیری
در این پژوهش عدم تعادل لینکاژی بر روی کروموزوم شماره 6 گاوی مورد بررسی قرار گرفت و وسعت عدم تعادل لینکاژی kb40 در سطح 3/0=r2 مشاهده شد. بر این اساس اگر سطح مفید عدم تعادل لینکازی را 3/0 در نظر بگیریم 70000 نشانگر برای پوشش کل ژنوم در مطالعات ارتباطی مورد نیاز است. تعداد و وسعت بلوکها هاپلوتیپی نشان میدهد که بدلیل حضور جایگاه صفات کمی متعدد در سطح کروموزوم شماره 6، اثر انتخاب منجر به تشکیل بلوکهای با سطح بالای عدم تعادل لینکاژی شده است که Mb 6/10 کل کروموزم یعنی %12 آن را پوشش میدهد. نتایج مطالعات عدم تعادل لینکاژی اولین قدم در تعیین تراکم نشانگر و اندازه نمونه مناسب در مطالعات ارتباطی، انتخاب ژنومی و نقشه یابی جایگاه صفت کمی میباشد. لذا تهیه نقشه عدم تعادل لینکاژی جمعیتها برای افزایش صحت و دقت در مطالعات فوق امری اجتناب ناپذیر است.
منابع
Ardlie KG, Kruglyak L, Seielstad M (2002). Patterns of linkage disequilibrium in the human genome. Nature Reviews Genetics 3: 299–309.
Arias JA, Keehan M, Fisher P, Coppieters W, Spelman R (2009). A high density linkage map of the bovine genome. BMC Genetics 10: 18-30.
Barrett JC, Fry B, Maller J, Daly MJ (2005). Haploview: analysis and visualization of LD and haplotype maps. Bioinformatics 21: 263-265.
Bohmanova J, Sargolzaei M, Schenkel FS (2010). Characteristics of linkage disequilibrium in North American Holsteins. BMC Genomics 11: 421-435
Burt DW (2009). The cattle genome reveals its secrets. BMC Biology 8: 36
De Roos AP, Hayes BJ, Spelman RJ, and Goddard ME (2008). Linkage disequilibrium and persistence of phase in Holstein-Friesian, Jersey and Angus cattle. Genetics 179: 1503–1512
Diskin SJ, Li M, Hou C, Yang S, Glessner J, Hakonarson H, Bucan M, Maris JM, Wang K (2008). Adjustment of genomic waves in signal intensities from whole-genome SNP genotyping platforms. Nucleic Acids Research 36: e126.
Farnir F, Coppieters W, Arranz JJ, Berzi P, Cambisano N, Grisart B, Karim L, Marcq F, Moreau L, Mni M (2000). Extensive genome-wide linkage disequilibrium in cattle. Genome Resarch 10: 220-227.
Freyer G, Kuhn C, Weikard R, Zhang Q, Mayer M, Hoeschele I (2002). Multiple QTL on Chromosome six in Dairy Cattle affecting Yield and Content Traits. Journal of Animal Breeding and Genetic 119: 69–82
Gabriel SB, Schaffner SF, Nguyen H (2002). The structure of haplotype blocks in the human genome. Science 296: 2225–2229.
Gautier M Faraut T, Moazami-Goudarzi K (2007). Genetic and haplotypic structure in 14 European and African cattle breeds.Genetics 177: 59–70
Gibbs RA, Taylor JF, Van Tassell CP, Barendse W, Eversole KA, Gill CA, Green RD, Hamernik DL, Kappes SM, Lien S (2009). Genome-wide survey of SNP variation uncovers the genetic structure of cattle breeds. Science 324: 528-532.
Hayes B, Visscher PM, McPartlan HC, Goddard ME (2003). Novel multi-locus measure of linkage disequilibrium to estimate past effective population size. Genome Resarch 13: 635–643.
Hill WG, Robertson A (1968). Linkage disequilibrium in finite populations. Theoretical and Applied Genetics 38: 226–231.
Khatkar MS, Collins A, Cavanagh JAL. et al (2006). A first generation metric linkage disequilibrium map of bovine chromosome 6. Genetics 174: 79–85.
Khatkar MS, Nicholas FW, Collins AR, Zenger KR, Cavanagh JA, Barris W, Schnabel RD, Taylor JF, Raadsma HW (2008). Extent of genome-wide linkage disequilibrium in Australian Holstein-Friesian cattle based on a high-density SNP panel. BMC Genomics 9: 187-205.
Lee YM, Lee YS, Han CM, Lee JH, Yeo JS, Kim JJ (2008). Detection of Quantitative Trait Loci for Growth and Carcass Traits on BTA6 in a Hanwoo Population. Asian-Australasian Journal of Animal Sciences 23: 287 – 291
Lewontin RC (1964). The interaction of selection and linkage I. General considerations, heterotic models. Genetics 49: 49–67.
Lewontin RC, Kojima K (1960). The Evolutionary Dynamics of Complex Polymorphisms. Evolution 14: 458-472.
Lu U, Sargolzaei M, Kelly M, Li C, Vander Voort G, Wang Z, Plastow G, Moore S, Miller SP (2012). Linkage disequilibrium in Angus, Charolais, and Crossbred beef cattle. Frontiers in Genetics 3: 1- 10
Marques E, Schnabel RD, Stothard P, Kolbehdari D, Wang Z, Taylor JF, Moore SS (2008). High density linkage disequilibrium maps of chromosome 14 in Holstein and Angus cattle. BMC Genetic 9: 45-64.
McKay SD, Schnabel RD, Murdoch BM, Matukumalli LK, Aerts J, Coppieters W, Crews D, Dias Neto E, Gill C A., Gao C (2007). Whole genome linkage disequilibrium maps in cattle. BMC Genetic 8: 74-87
Meuwissen, THE, Hayes BJ, Goddard ME (2001). Prediction of total genetic value using genome wide dense marker maps. Genetics 157: 1819–1829
Odani M, Narita A, Watanabe T, Yokouchi K, Sugimoto Y, Fujita T, Oguni T, Matsumoto M, Sasaki Y (2006). Genome-wide linkage disequilibrium in two Japanese beef cattle breeds. Animal Genetic 37: 139–144.
Olsen HG, Lien S, Svendsen M, Nilsen H, Roseth A, Aasland Opsal M Meuwissen TH (2004). Fine mapping of milk production QTL on BTA6 by combined linkage and linkage disequilibrium analysis. Journal of Dairy Science 87(3): 690-698.
Olsen HG, Meuwissen THE, Nilsen H, Svendsen M, Lien S (2008). Fine Mapping of Quantitative Trait Loci on Bovine Chromosome 6 Affecting Calving Difficulty. Journal of Dairy Science 91: 4312–4322
Pritchard JK, Przeworski M (2001). Linkage disequilibrium in humans: Models and data. American Journal of Human Genetic 69: 1–14.
Qanbari S, Pimentel ECG, Tetens J, Thaller G, Lichtner P, Sharifi AR, Simianer H (2010). The pattern of linkage disequilibrium in German Holstein cattle. Animal Genetics.41: 346–356
Reich DE, Lander ES (2001). On the allelic spectrum of human disease. Trends in Genetics, 17: 502–510
Schnabel RD, Kim JJ, Ashwell MS, Sonstegard TS, Van Tassell CP, Connor EE, Taylor JF (2005). Fine-mapping milk production quantitative trait loci on BTA6: Analysis of the bovine osteopontin gene 102: 6896 – 6901
Sargolzaei M, Schenkel FS, Jansen GB, Schaeffer LR (2008). Extent of linkage disequilibrium in Holstein cattle in North America. Journal of Dairy Science 91: 2106-2117
Sved, JA (1971). Linkage disequilibrium and homozygosity of chromosome segments in finite populations. Theoretical Population Biology 2: 125–141.
Tenesa A, Knott SA, Ward D, Smith D, Williams JL, Visscher PM (2003). Estimation of linkage disequilibrium in a sample of the United Kingdom dairy cattle population using unphased genotypes. Journal of Animal Science 81: 617-623.
Vallejo RL, Li YL, Rogers GW, Ashwell MS (2003). Genetic diversity and background linkage disequilibrium in the North American Holstein cattle population. Journal of Dairy Science 86: 4137-4147.
Varilo T, Paunio T, Parker A, Perola M, Meyer J, Terwilliger JD, Peltonen L (2003). The interval of linkage disequilibrium (LD) detected with microsatellite and SNP markers in chromosomes of Finnish populations with different histories. Human Molecular Genetics 12: 51–59
Vignal A, Milan M, Sancristobal M, Eggen A (2002). A review on SNP and other types of molecular markers and their use in animal genetics. Genetics Selection Evolution 34: 275-305
Wright S (1938). Size of population and breeding structure in relation to evolution. Science (Wash DC) 87: 430–431.
Zhao H, Nettleton D, Soller M, Dekkers JCM (2005). Evaluation of linkage disequilibrium measures between multi-allelic markers as predictors of linkage disequilibrium between markers and QTL. Genetics Research 86: 77–87.
Investigations of linkage disequilibrium phase in chromosome 6 of Holstein breed
Nosrati M.*1, Tahmoorespur M.2, Fontanesi L.3, Nassiry, M.R.2
1 Assistant Professor, Department of agriculture, Payame Noor University (PNU), Tehran, Iran.
2 Professor, Department of animal science, Faculty of agriculture, Ferdowsi University of Mashhad, Mashhad, Iran.
3 Professor, Department of Agri-Food Science and Technology, University of Bologna, Bologna, Italy.
Abstract
In whole genome association study, genomic selection, Determining of extent and level of linkage disequilibrium (LD) is important in sample size and marker density. In this experiment, the blood and sperm samples were collected form 1089 Holstein bulls and 2030 markers on chromosome 6 were genotyped by using Illumina Bovine SNP50K BeadChip based on UMD3.1 genome assembly. Data were corrected for missing genotyped SNP and individual with unknown genotype by Plink. After correction 1606 markers remained (79%). The average observed heterozygosity was 0.37 and 80% of the markers had minor all frequency more than 0.2. The LD was calculated with r2 and Dˊ by Haploview v4.2. The extent of LD in this study was 40 kb with r2=0.3. The r2 value was decreasing to 0.2 (moderate level) in 80kb and 0.1 (background level) in 300 kb. The effective population size has been decreased to 100 individual in 10 generations ago. The 49 haplotype blocks with range 18-472 kb were detected that covering the 10.6 Mb of whole chromosome. These results showed that between 4000-70000 markers or one marker per 40-75 kb will be need for whole genome association study in this Holstein population.
Keywords: Holstein, linkage disequilibrium, chromosome 6, Ne.
* نویسنده مسئول: مریم نصرتی تلفن: 09153860827 Email: Mehraveh58@yahoo.com
[1] National Association of Italian Holstein Breeders
[2] Illumina Bovine SNP50K BeadChip
[3]Multi-Sample Amplification Master Mix
[4] Genomic wave
* Corresponding Author: Nosrati M. Tel: 09153860827 Email: Mehraveh58@yahoo.com
)