بررسی بیان mRNA ژن‌های IL-2 و IL-12 در خوکچه‏های هندی واکسینه شده با واکسن غیر فعال شده تب برفکی تیپ O

بررسی بیان mRNA ژن‌های IL-2 و IL-12 در خوکچه‏های هندی واکسینه شده با واکسن غیر فعال شده تب برفکی تیپ O

ابراهیم هنربخش¹، علی‏اصغر اسلمی‏نژاد²، محمد‏رضا نصیری³، سعید زیبایی⁴، رضا پسندیده*⁵

¹ دانش‏آموخته کارشناسی ارشد ژنتیک و اصلاح نژاد دام، گروه علوم دامی، دانشکده کشاورزی، دانشگاه فردوسی مشهد، ایران

^{2 و3} به ترتیب دانشیار و استاد ژنتیک و اصلاح نژاد دام، گروه علوم دامی، دانشکده کشاورزی، دانشگاه فردوسی مشهد، ایران

⁴ استادیار موسسه تحقیقات سرم و واکسن سازی رازی شعبه مشهد، ایران

^5* دانشجوی دکتری ژنتیک و اصلاح نژاد دام، دانشگاه کشاورزی و منابع طبیعی رامین خوزستان، ملاثانی، اهواز، ایران.

تاریخ دریافت: 24/05/1394، تاریخ پذیرش: 24/01/1395

چکیده

تب برفکی یک بیماری ویروسی بشدت واگیردار است که عمدتاً دام‏های سم‏شکافته و حیوانات وحشی را متأثر می‏سازد. تب برفکی در ایران یک بیماری بومی محسوب شده که گاهی همه‏گیری‏های آن موجب خسارت‏ها و تلفات سنگین به خصوص در دام‏های جوان می‏شود. در این مطالعه، بیان mRNA ژن‏های سایتوکاینی IL-2 و IL-12 در خوکچه‏های هندی واکسینه شده با واکسن غیر فعال شده تب برفکی تیپ O (بدون استفاده از یاور) مورد بررسی قرار گرفت. نمونه‏های خون از سیاهرگ سافن 8 سر خوکچه هندی نر (در دو گروه شاهد و واکسینه) در روز‏های 7 و 28 پس از اولین واکسیناسیون گرفته شد. استخراج RNA کل از نمونه‏های خون با استفاده از کیت استخراج ستونی صورت گرفت و پس از آن طی واکنش نسخه‏برداری معکوس به cDNA تبدیل شد. سپس به منظور بررسی بیان ژن‌های IL-2 و  IL-12از روش Real-time PCR نسبی استفاده شد. نتایج نشان داد بیان ژن IL-2 در حیوانات واکسینه شده نسبت به گروه شاهد در خونگیری‏های اول و دوم تفاوت معنی‏داری نداشت، ولی افزایش معنی‏داری در بیان ژن IL-12 مشاهده شد (P<0.05). از تغییر سطوح بیان ژن‏های سایتوکاینی می‏توان به عنوان شاخص‏هایی جهت ارزیابی اثرات واکسن‏های جدید بر سیستم ایمنی در مطالعات آینده استفاده نمود.

واژه‏های کلیدی: تب برفکی، خوکچه هندی، IL-2؛ IL-12، Real-time PCR.

مقدمه

بیماری تب برفکی (FMD)[1]یکی از مسری‏ترین بیماری‏های ویروسی دام‌ها است که می‏تواند تمام دام‌های سم شکافته نظیر گاو، گوسفند، بز، خوک‌ و همچنین بیش از 30 گونه از حیوانات وحشی را آلوده کند (Thomson et al., 2003). ویروس این بیماری، عضوی از جنس آفتاویروس[2] در خانواده پیکورناویریده[3] است. از نظر ایمونولوژیکی این ویروس دارای سروتایپ‏هایA ، O و C در اروپا، SAT1[4]، SAT2 و SAT3 در آفریقا و یک سروتایپ کاملاً مشخص در آسیا به نام Asia1 می‏باشد. سروتایپ O رایج‏ترین سروتایپ در سراسر جهان می‏باشد (Brown, 2003). تب برفکی در ایران یک بیماری بومی محسوب شده که گاهی همه‏گیری‏های آن باعث خسارات و تلفات سنگین به خصوص در دام‏های جوان می‏شود. تیپ‏های شایع ویروس تب برفکی در ایران، تیپ‏‏های A و O می‏‏باشند. بیماری تب برفکی فشار بزرگی بر صنعت دامپروری وارد می‏کند و خسارات اقتصادی آن عمدتاً در نتیجه کاهش تولید گوشت و شیر در دام‏های آلوده و کاهش صادرات محصولات در هنگام شیوع بیماری به وجود می‏آیند. هزینه‏های پیشگیری و درمان‏های کمکی بیماری تب برفکی زیاد بوده و سالانه میلیاردها تومان برای خرید واکسن هزینه می‏گردد. بنابراین برنامه‏های کنترل و ریشه‏کنی این بیماری یکی از اولویت‏های بخش دامی محسوب می‏شوند (Rasouli Beyrami et al., 2010). واکسن‏های تولیدی در جهت مقابله با تب برفکی در یک کشور، ممکن است برای مقابله با این بیماری در سایر کشور‏ها نتایج مثبت و مشابه را ایجاد نکنند. بنابراین همواره به تولید واکسن‏های جدید جهت ایمن نمودن دام‏ها نسبت به سویه‏های جهش یافته نیاز است. در سال‏های اخیر تولید نسل سوم و جدیدی از واکسن‏ها تحت عنوان واکسن DNA[5] برای مقابله با بیماری تب برفکی در جهان آغاز شده است که بررسی عملکرد و اثرات این واکسن‏ها بر سیستم ایمنی بدن امری ضروری است. یکی از راه‏های ارزیابی عملکرد واکسن‏های DNA، اندازه‏گیری سطوح بیان برخی از ژن‏های سیستم ایمنی از جمله سایتوکاین‏ها در پاسخ به این واکسن‏ها در حیوانات آزمایشگاهی می‏باشد. اگر تغییر بیان این ژن‏ها طی تزریق یک واکسن DNA مشابه تزریق واکسن تجاری به حیوان باشد، می‏توان این پاسخ مشابه را دلیلی بر تاثیر واکسن‏ DNA بر سیستم ایمنی و کارایی آن تلقی نمود. سایتوکاین‏ها پروتئین‌های محلولی هستند که از سلول‏های سیستم ایمنی ترشح شده و باعث تحریک، القا و یا مهار پاسخ‏های ایمنی در بدن می‏شوند. با توجه به نحوه‏ی تولید، ویژگی، کیفیت تاثیر و نوع سلول‏های هدف، برخی از این مواد را اینترلوکین[6](IL)، بعضی را اینترفرون[7](IFN)، تعدادی را فاکتور نکروز دهنده‏ی توموری[8](TNF) و برخی را کموکاین[9] می‏نامند (Fong & Lowry, 1990). در مطالعات گذشته میزان بیان سایتوکاین‏ها در شرایط تزریق واکسن تب برفکی یا آلودگی حیوانات به این ویروس مورد بررسی قرار گرفته است. مینگالا و همکاران (Mingala et al., 2009) سطوح بیان سایتوکاین‏های Th2 شامل (IL-10 و IL-4)، Th1 شامل (IL-2، IL-12 و IFNγ) و التهابی شامل (IL-6 و TNFα) را در گاومیش آبی در پاسخ به تزریق واکسن غیر فعال شده تب برفکی مورد بررسی قرار دادند. همچنین مطالعات دیگری بر روی سطوح بیان برخی سایتوکاین‏ها در گونه‏هایی نظیر موش (Ostrowski et al., 2005)، خوک (Barnard et al., 2005؛ Barnett et al., 2002) و گاو (Zhang et al., 2009؛Zhang et al., 2006 ) در پاسخ به واکسن یا ویروس بیماری تب برفکی گزارش شده است. در ایران، پاسخ ایمنی در خوکچه هندی در مواجهه با ویروس تب برفکی تیپ A87/IRN با بررسی سطوح آنتی‏بادی‏ها مورد مطالعه قرار گرفته است (Motamedi Sedeh et al., 2007). در تحقیقی Pasandideh et al. (2016) سطوح بیان ژن‏های IFN-γ، IL-10 و TNF-α را در خوکچه‏های هندی واکسینه شده با واکسن غیر فعال شده تب برفکی تیپ O مورد مطالعه قرار دادند.

خوکچه هندی حساس‏‏ترین حیوان آزمایشگاهی به ویروس تب برفکی می‏باشد (Eslampanah et al., 2010) که در این مطالعه به عنوان یک مدل حیوانی، جهت ارزیابی کارکرد واکسن مورد آزمایش، توسط روش PCR Real-time نسبی[10] و با اندازه‏گیری بیان ژن‏های‏ IL-2 و IL-12 مورد استفاده قرار گرفت. هدف از این مطالعه، معرفی ژن‏های سایتوکاینی القا شونده در پاسخ به واکسن غیر فعال شده تب برفکی، به منظور استفاده از آن‏ها به عنوان شاخص‏هایی جهت ارزیابی اثرات واکسن‏های نسل جدید در مطالعات آینده بود.

مواد و روش‏ها

حیوانات آزمایشگاهی، نمونه‏گیری خون و واکسیناسیون

در این مطالعه از 8 سر خوکچه هندی نر با وزن تقریبی 500-400 گرم و سن 3 ماه استفاده شد که 4 سر از آن‏ها در گروه شاهد (بدون واکسن) و 4 سر در گروه واکسینه شده طبقه‏بندی شدند. در طی دوره نگهداری، حیوانات با خوراک پلت شده تغذیه شدند. هم‏چنین به دلیل این‏که خوکچه هندی قادر به سنتز ویتامین C در بدن نمی‏باشد، پودر این ویتامین به میزان یک گرم در لیتر به صورت یک روز در میان به آب آشامیدنی اضافه شد. سیستم نوری بر مبنای 12 ساعت روشنایی و 12 ساعت تاریکی تنظیم شد. حیوانات در دو نوبت در روز‏های صفر و 14 با واکسن تجاری غیر فعال شده‏ تب برفکی تیپ O (بدون استفاده از یاور)[11] به میزان 5/0 سی سی به ازای هر حیوان، به صورت زیرجلدی در ناحیه پشت پا واکسینه شدند. این واکسن از موسسه تحقیقات واکسن و سرم‏سازی رازی (کرج، ایران) تهیه شد. به حیوانات گروه شاهد 5/0 سی سی PBS[12] تزریق شد. خونگیری از سیاهرگ سافن[13] حیوانات و در دو نوبت در روز‏های 7 و 28 پس از اولین تزریق واکسن صورت گرفت. در هر مرتبه 5/0 تا 1 سی‏سی خون درون میکروتیوپ‏های حاوی مقدار کمی EDTA نیم مولار جمع‏آوری و تا زمان استفاده در دمای 20- درجه سانتی‏گراد نگهداری شد.

طراحی پرایمر

ابتدا توالی‏های مربوط به ژن‏های IL-2 (با شماره دسترسی: AB010093)، IL-12 (با شماره دسترسی: AB025723) و β-actin (با شماره دسترسی: NM_001172909) به عنوان ژن مرجع، از بانک اطلاعات ژنی (NCBI)[14] استخراج شد. سپس پرایمر‏‏ها با استفاده از نرم‏افزار Primer Premier طراحی گردید و سفارش ساخت به شرکت Bioneer (کره جنوبی) داده شد (جدول 1).

استخراج RNA

استخراج RNA از نمونه‏های خون با استفاده از کیت استخراج ستونی [15]RNA (DENAzist، ایران)، مطابق دستورالعمل شرکت سازنده انجام شد. پس از استخراج RNA، برای اطمینان از صحت کار و غلظت مناسب RNA، غلظت‏های RNA با استفاده از دستگاه اسپکتوفتومتر نانودراپ (Thermo-Scientific، امریکا) و در جذب نوری OD₂₆₀/OD₂₈₀ اندازه‏گیری و تا زمان استفاده در دمای 70- درجه سانتی‏گراد نگهداری شد.

واکنش RT-PCR

نمونه‏های RNA استخراج شده، برای انجام مرحله‏ی نسخه برداری معکوس و ساخت cDNA توسط کیت RevertAid^TM H Minus ساخت شرکت فرمنتاز (آلمان) مورد استفاده قرار گرفت. ابتدا 2 میکرولیتر (90 نانوگرم) از RNA کل به همراه 1 میکرولیتر Oligo-dT (با غلظت 100 میکرومولار) و 9 میکرولیتر DEPC treated water درون یک میکروتیوب استریل عاری از نوکلئاز[16] بر روی یخ اضافه شد. میکروتیوب به مدت 5 دقیقه در دمای 65 درجه سانتی‏گراد انکوبه شد. سپس 4 میکرولیتر بافرX 5، 1 میکرولیتر (20 U) RNase Inhibitor، 2 میکرولیتر dNTPs (با غلظت 10 میلی‏مولار) به همراه 1 میکرولیتر آنزیمMM-MuLV Reverse Transcriptase (200 U)  به مخلوط اضافه شد.

جدول‏ 1- لیست پرایمر‏های مورد استفاده در ‏ Real-time PCR.

Table 1- Real-time PCR primers used in this study.

میکروتیوب به مدت 60 دقیقه در دمای 42 درجه سانتی‏گراد قرار گرفت و در نهایت محصول واکنش به مدت 5 دقیقه در دمای 70 درجه سانتی‏گراد به منظور توقف واکنش نسخه برداری معکوس انکوبه گردید. محصول واکنش در دمای 20- درجه سانتی‏گراد تا زمان استفاده نگهداری شد.

اندازه‏گیری بیان mRNA سایتوکاین‏ها

به منظور اندازه‏گیری بیان mRNA ژن‏های IL-2 و IL-12، از روش Real-time PCR نسبی با استفاده از دستگاه 7300 (ABI (Applied Biosystems و کیتMaxima SYBR Green/ROX qPCR Master Mix  ساخت شرکت Thermo Scientific (امریکا) استفاده شد. 5/12 میکرولیتر مسترمیکس سایبرگرین، 1 میکرولیتر از هر پرایمر (با غلظت 10 پیکو‏مول)، 1 میکرولیتر نمونه حاوی 50 نانوگرم cDNA و 5/9 میکرولیتر آب دو بار تقطیر در حجم نهایی 25 میکرولیتر مخلوط شد. پس از تهیه حجم مورد نظر، ابتدا یک مرحله واسرشت‏سازی در دمای 95 درجه سانتی‏گراد به مدت 10 دقیقه صورت گرفت. سپس واکنش PCR در 40 چرخه، شامل 95 درجه سانتی‏گراد برای 15 ثانیه، 58 درجه سانتی‏گراد برای 30 ثانیه و 72 درجه سانتی‏گراد برای 30 ثانیه انجام شد. برنامه دمایی PCR برای تمامی ژن‏ها، مشابه بود. با اتمام واکنش PCR، منحنی ذوب با برنامه دمایی 5/0 درجه سانتی‏گراد در هر چرخه و بین دمای 60 تا 95 درجه سانتی‏گراد به منظور بررسی اختصاصی بودن واکنش PCR و تعیین وجود یا عدم وجود آلودگی با محصولات غیر اختصاصی و پرایمر دایمر رسم گردید. از هر نمونه سه تکرار گذاشته شد.

آنالیز داده‏های Real-time PCR

در انتهای واکنش Real-time PCR، نرم افزار دستگاه به طور خودکار خط آستانه را رسم و نتایج را به صورت چرخه آستانه (CT)[17] گزارش کرد. در اندازه‏گیری نسبی، تغییر در سطوحmRNA  یک ژن نسبت به یک ژن مرجع (ژن خانه‏دار)[18] که به عنوان کالیبراتور در نظر گرفته می‏شود، اندازه‏گیری می‏شود (Bustin, 2002). در تحقیق حاضر، تغییرات نسبی بیان ژن‏های IL-2 و IL-12 نسبت به ژن β-actin نرمال شد. برای تعیین میزان بیان ژن‏های IL-2 و IL-12 از روش لیواک و فرمول ^-∆∆CT2 استفاده شد (Livak & Schmittgen, 2001). در این روش فرض بر این است که بازدهی ژن مورد نظر و ژن مرجع، برابر و نزدیک به 100 درصد است که به منظور تعیین کردن این فرض، از منحنی استاندارد استفاده شد. برای این کار، رقت‏های مختلف از cDNA تهیه و برای آن‏ها تستReal-time PCR  انجام شد. بررسی آماری داده‏ها توسط نرم‏افزار SAS و آزمون t استیودنت[19] در سطح معنی‏داری 5% (P<0.05) انجام شد.

نتایج

منحنی‏های ذوب پرایمرهای مورد استفاده در این مطالعه در شکل‏های 1، 2 و 3 نشان داده شده است. همان طور که در این منحنی‏ها دیده می‏شود برای هیچ کدام از پرایمرها، پیک اضافی قبل از پیک محصولات وجود ندارد که نشانگر عدم ایجاد پرایمر دایمر است. همچنین عدم وجود پیک اضافی بعد از پیک محصولات نشان از عدم تکثیر قطعات غیر اختصاصی می‏باشد. بنابراین پرایمرهای مورد استفاده در این مطالعه به صورت اختصاصی عمل کرده و یک نمونه منفرد از cDNA را تکثیر نموده‏اند. منحنی‏های روند تکثیر ژن‏های β-actin، IL-2 و IL-12 در شکل‏های 4، 5 و 6 نشان داده شده است. در این منحنی‏ها، خط آستانه به صورت خط سبزرنگ افقی نشان داده شده است. محل تلاقی خط آستانه و منحنی‌ تکثیر نشان دهنده چرخه آستانه (CT) است. این منحنی‏ها حاکی از آن می‏باشند که تکثیر ژن‏های مورد نظر به خوبی صورت گرفته است. نتایج سطوح بیان ژن‏های IL-2 و IL-12 در شکل 7 نشان داده شده است. بیان ژن IL-2 در خوکچه‏های هندی واکسینه شده نسبت به گروه شاهد در خونگیری‏های اول (7 روز بعد از اولین واکسیناسیون) و دوم (28 روز بعد از اولین واکسیناسیون) تفاوت معنی‏داری نداشت (0.05<P). با این وجود بیان ژن IL-2 در خونگیری دوم نسبت به اول افزایش داشت (P<0.05). میزان بیان ژن IL-12 در حیوانات واکسینه شده نسبت به گروه شاهد در خونگیری‏های اول و دوم افزایش معنی‏داری داشت (P<0.05). همچنین میزان بیان ژن IL-12 در خونگیری دوم نسبت به خونگیری اول افزایش داشت (P<0.05). میانگین بیان ژن‏های IL-2 و IL-12 در خونگیری‏های اول و دوم در جدول 2 نشان داده شده است.

شکل 1- منحنی ذوب محصولات ژن  .β-actin

Figure 1- Melting curve of β-actin gene products.

شکل‏ 2- منحنی ذوب محصولات ژن .IL-2

Figure 2- Melting curve of IL-2 gene products.

شکل 3- منحنی ذوب محصولات ژن .IL-12

Figure 3- Melting curve of IL-12 gene products.

شکل 4- منحنی تکثیر ژن β-actin. خط سبز رنگ افقی، خط آستانه است.

Figure 4- Amplification curve of β-actin gene. The horizontal green line is threshold line.

شکل 5- منحنی تکثیر ژن .IL-2 خط سبز رنگ افقی، خط آستانه است.

Figure 5- Amplification curve of IL-2 gene. The horizontal green line is threshold line.

شکل 6- منحنی تکثیر ژن IL-12. خط سبز رنگ افقی، خط آستانه است.

Figure 6- Amplification curve of IL-12 gene. The horizontal green line is threshold line.

شکل 7- بیان ژن‏های IL-2 و IL-12 در خوکچه‏‏های هندی واکسینه شده با واکسن غیر فعال شده تب برفکی. نمونه‏های خون در روز‏های 7 و 28 پس از اولین تزریق واکسن جمع‏آوری شدند. میله‏های عمودی نشان دهنده خطای استاندارد از میانگین می‏باشند.  dpi: روز پس از اولین تزریق.

Figure 7- The expression of IL-2 and IL-12 genes in guinea pigs vaccinated to FMD inactivated vaccine. Blood samples were collected in 7 and 28 days post the first vaccination. Bars represent standard error of the mean. dpi: days post the first injection.

جدول 2- میانگین بیان ژن‏هایIL-2  و IL-12 در روز‏های 7 و 28 پس از اولین تزریق واکسن. dpi: روز پس از اولین تزریق.

Table 2- Mean of IL-2 and IL-12 genes expression in 7 and 28 days post the first injection (dpi).

بحث

در این مطالعه سطوح بیان mRNA ژن‏های سایتوکاینی IL-2 و IL-12 در خوکچه‏‏های هندی واکسینه شده با واکسن غیر فعال شده تب برفکی تیپ O با روش PCR Real-time نسبی مورد بررسی قرار گرفت. IL-2 عمدتاً توسط لنفوسیت‏های T CD4+ و در مقادیر کمتر به وسیله سلول‌های T CD8+ تولید می‏شود. IL-2 گلیکوپروتئینی با وزن مولکولی 14 تا 17 کیلو دالتون می‏باشد و از 133 آمینو اسید تشکیل شده است که به صورت یک مارپیچ α چین خوردگی حاصل کرده است. IL-2 مهم‌ترین سایتوکاینی است که باعث پیشبرد لنفوسیت‏های T از فاز G1 به S و انتقال به فاز رشد سلولی می‏شود (Vojgani, 2002). در این مطالعه میزان بیان IL-2 در خوکچه‏‏های هندی واکسینه شده نسبت به گروه شاهد در خونگیری‌های اول و دوم اختلاف معنی‏دار نداشت (P>0.05). در پژوهشی Mingala et al.  (2011) افزایش بیان IL-2 در گاومیش آبی واکسینه شده با واکسن غیر فعال شده تب برفکی بلافاصله یک هفته پس از واکسیناسیون و سپس افزایش آن در هفته دوم را گزارش کردند که نتیجه این مطالعه با آن مغایرت داشت. در پژوهشی دیگر Toka et al.  (2009) نتوانستند IL-2 را در سرم خون هیچکدام از خوک‏های آلوده به ویروس تب برفکی تشخیص دهند. در پژوهشیBarnett et al.  (2002) نشان دادند که سطوح بیان IL-2 در پلاسمای خون خوک‏های واسینه شده با واکسن تب برفکی برابر با سطوح قبل از واکسیناسیون یا پایین‏‏تر از آن بود. نتیجه تحقیق حاضر برای بیان ژن IL-2 با نتایجToka et al.  (2009) و Barnett et al.  (2002) مطابقت داشت. عدم وجود اختلاف معنی‏دار برای بیان ژن IL-2 بین گروه واکسینه شده نسبت به گروه شاهد در خونگیری‌های اول و دوم می‏تواند به این دلیل باشد که عمل برخی از سایتوکین‏ها به شکل گذرا است و معمولاً دامنه کوتاهی دارد. فعالیت نسخه برداری از ژن‏های سایتوکاینی معمولا موقتی بوده و mRNA کد‏کننده آن‏ها ناپایدار است (Clements, 1991). برخلاف هورمون‏های اندوکرین، قسمت اعظم سایتوکین‏ها به طور موضعی و به شکل پاراکراین[20] (اثر بر سلول مجاور) و یا حتی اتوکراین[21] (اثر بر سلول تولید کننده سایتوکین) عمل می‏کنند. بنابراین سایتوکین‏های مشتق شده از لنفوسیت‏ها نظیر IL-2 بندرت در جریان خون باقی می‏مانند (Abbas et al., 2014 Robb, 1984;).

IL-12 یک هترودایمر متشکل از دو زیر واحد 35 و 40 کیلو دالتونی با یک پیوند دی سولفیدی است. منابع اصلی تولید IL-12 بیگانه خوارهای تک هسته‏ای و سلول‌های دندریتیک هستند. IL-12 واسطه اصلی پاسخ زودرس ایمنی ذاتی به میکروب‏های درون سلولی و القا کننده اصلی ایمنی وابسته به سلول (پاسخ ایمنی اکتسابی در برابر این میکروب‌ها) است (Trinchieri, 1994). در این مطالعه میزان بیان ژن IL-12 در خوکچه‏های هندی واکسینه شده نسبت به گروه شاهد در خونگیری‏های اول و دوم افزایش معنی‏داری داشت (P<0.05). این نتایج با تحقیقات Mingala et al.  (2011) در گاومیش آبی وBarnett et al.  (2002) وCox et al.  (2003) در خوک مشابه بود. ولی با نتایجToka et al.  (2009) در خوک‏های آلوده به ویروس تب برفکی مغایرت داشت. به نظر می‏رسد که واکسن مورد استفاده در این مطالعه موجب القای بیان ژن IL-12 در خوکچه‏های هندی شده باشد. بررسی بیان ژن‏های سایتوکینی در مطالعات آینده می‏تواند به عنوان یک ابزار ارزشمند برای ارزیابی اثرات واکسن های جدید مانند واکسن‏های DNA بر سیستم ایمنی بدن و بررسی ایمنی‏زایی‏ آن‏ها، باشد.

نتیجه‏گیری

به منظور شناسایی پاسخ‏های ایمنی سلولی علیه ویروس تب برفکی و نیز بررسی اثرات متقابل سایتوکاین‏ها، نیازمند بررسی بیان سایر سایتوکاین‏ها در مطالعات آینده می‏باشیم. Real-time PCR روشی دقیق و مناسب برای مطالعه میزان بیان ژن‏های سایتوکاینی بوده که می‏تواند به عنوان ابزاری دقیق برای بررسی برنامه‏های ایمنی‏زایی واکسن‏های جدید استفاده شود. به دلیل این‏که افزایش بیان سایتوکاین‏ها شاخصی از پاسخ سیستم ایمنی می‏باشد، در مطالعات آینده می‏توان از این ژن‏ها به عنوان شاخص‏هایی جهت بررسی اثرات واکسن‏های جدید و تحقیق در رابطه با القای آن‏ها توسط این گونه واکسن‏ها استفاده نمود. همچنین با ارتباط دادن سطوح بیان این ژن‏ها به آزمایشات بالینی، می‏توان اثر بیان آن‏ها بر ایجاد مصونیت در میزبان را بررسی نمود.