تاثیر تنش خشکی بر بیان ژن‌های کدکننده آنزیم‌های فنیل آلانین آمونیالیاز (PAL)، اوژنول سینتاز 1 (EGS1) و کافئیک O- متیل ترانسفراز (COMT) در ریحان

تاثیر تنش خشکی بر بیان ژن­های کدکننده آنزیم­های فنیل آلانین آمونیالیاز (PAL)، اوژنول سینتاز 1 (EGS1) و کافئیک O- متیل ترانسفراز (COMT) در ریحان

بابک عبدالهی مندولکانی*¹، محمد علی­پور²، رضا درویش زاده¹، بختیار مجرومی سنجی²

¹به ئرتیب دانشیار و استاد گروه اصلاح و بیوتکنولوژی گیاهی، دانشکده کشاورزی، دانشگاه ارومیه، ارومیه، ایران.

²دانشجوی کارشناسی ارشد بیوتکنولوژی کشاورزی، گروه اصلاح و بیوتکنولوژی گیاهی، دانشکده کشاورزی، دانشگاه ارومیه، ارومیه، ایران.

تاریخ دریافت: 07/03/1396، تاریخ پذیرش: 02/10/1396

چکیده

ریحان (Ocimum basilicum L.) از مهمترین گیاهان دارویی متعلق به خانواده نعناعیان است که اسانس آن سرشار از ترکیبات فنیل پروپانوئیدی می­باشد. تنش­های محیطی مانند خشکی می­توانند درصد و میزان ترکیبات اسانس را تغییر داده و بر بیان ژن­های دخیل در سنتز آن نیز تاثیر بگذارند. به منظور مطالعه اثر تنش خشکی بر بیان برخی ژن­های کلیدی دخیل در بیوسنتز فنیل پروپانوئیدها از جمله فنیل آلانین آمونیالیاز (PAL)، اوژنول سینتاز1 (EGS1) و کافئیک o- متیل ترانسفراز ((COMT در رقم کشکنی لولوی ریحان، آزمایشی بر پایه طرح کاملا تصادفی با سه تکرار در گلخانه اجرا شد. تنش خشکی در سه سطح 100 (کنترل)، 75 و50 درصد ظرفیت زراعی در مرحله 6 تا 8  برگی اعمال شد. بیان ژن­های مورد نظر با استفاده از تکنیک Real time PCR  بررسی شد. تجزیه داده­های مربوط به بیان ژن­های موردنظر و مقایسه میزان بیان ژن EGS1 در تیمار 75 و 50 درصد ظرفیت زراعی نسبت به شاهد نشان داد که میزان بیان این ژن در تیمار 75 درصد تغییر چندانی نسبت به کنترل نداشته ولی در تیمار 50 درصد، 74/9 برابر کنترل افزایش یافت. میزان بیان ژن ­COMT در هر دو تیمار تنش خشکی نسبت به شاهد، تغییر چندانی نکرد ولی میزان بیان ژن PAL در هر دو تیمار تنش خشکی نسبت به کنترل، 5/1 تا 2 برابر افزایش یافت. البته میزان بیان این ژن بین دو تیمار تنش خشکی معنی دار نبود. بنابراین احتمال می­رود بتوان از طریق اعمال تنش خشکی و افزایش بیان ژن­های EGS1 و PAL محتوای ترکیبات فنیل پروپانوئیدی را در ریحان افزایش داد.

واژه­های کلیدی: ریحان، تنش خشکی، Real time PCR، ترکیبات فنیل پروپانوئیدی، بیان ژن.

مقدمه

ریحان (Ocimum basillicum L.) از خانواده Lamiaceae و بومی مناطق گرم آفریقا می‌باشد (Peyvast, 2007). این گیاه حاوی اسانس بوده و پیکر رویشی آن اشتها آور است و برای معالجه نفخ شکم و برخی ناراحتی­های قلبی و کمک به هضم غذا استفاده می­شود (Adigzel et al., 2005). گونه‌های ایرانی ریحان نیز در درمان تب، التهاب گلو و درد معده به ­کار می‌رود (Javanmardi et al., 2002). ریحان یک محصول مهم اقتصادی در سراسر جهان می­باشد که تولید سالیانه اسانس آن به 100 تن و ارزش فروش گلدانی آن به 15 میلیون دلار می­رسد. بزرگترین محل تجارت ریحان ایالات متحده، ژاپن و کشورهای اروپایی می­باشد (Begum et al., 2002). اسانس این گیاه به­طور گسترده­ای در صنایع غذایی، عطرسازی، فرآورده­های دهانی و دندانی و در طب سنتی کاربرد دارد و دارای خواص ضد میکروبی است (Khalid, 2006). اسانس ریحان حدود یک درصد است و شامل ترکیبات متنوع و پیچیده­ای می­باشد که به دو گروه ترپنوئیدها (مونوترپن­ها و سزکوئی ترپن­ها) و فنیل پروپانوئیدها (مانند اوژنول، چاویکول، متیل سینامات و غیره) تقسیم می­شوند (Sangwan et al., 2001).

فنیل پروپانوئیدها مولکول­های کوچک فنلی هستند که دارای یک حلقه فنیلی و یک زنجیره سه کربنی هستند. این ترکیبات عامل طعم، بو و مزه در اسانس هستند و نقش­های متفاوتی را در گیاهان بازی می­کنند. در میان فنیل پروپانوئیدها دو ماده متیل چاویکول و اوژنول از مهمترین اجزای سازنده اسانس ریحان به شمار می­روند. بیوسنتز ترکیبات فنیل پروپانوئیدی از مسیر شیکیمات می­گذرد و توسط چندین گروه از واکنش­های آنزیمی از طریق چندین کانال متابولیکی که در آنها این آنزیم­ها آزاد یا به اجزای سلولی وصل می­شوند، تنظیم می­شوند (Dixon et al., 1992). فنیل پروپانوئید­­ها از فنیل آلانین مشتق می­شوند که ابتدا توسط آنزیم فنیل آلانین آمونیالیاز (PAL)[1] در اثر دآمیناسیون به اسید ترانس سینامیک تبدیل می­شود. سپس توسط سینامات4- هیدروکسیلاز (C₄H) [2]اسید–کوماریک به ­وجود می­آید و 4-کومارات کوآنزیم آ لیگاز (4CL)[3] در ادامه مسیر P-کوماریک را به P-کوماریل­ آلدهید تبدیل می­کند. این ترکیب توسط سینامیل الکل دهیدروژناز (CAD)[4] به فرم الکلی خود تبدیل می­شود و در طی مراحلی به چاویکول و اوژنول تبدیل می­شود که از اجزای تشکیل دهنده اسانس ریحان محسوب می­شوند. یکی دیگر از آنزیم­های اصلی واکنش­های متابولیسم فنیل پروپانوئیدها، کافئیک اسید o-متیل ترانسفراز (COMT)[5]  بوده که تبدیل کافئیک اسید به فرولات را کاتالیز می­نماید. مرحله انتهایی هم متیله شدن 4-هیدروکسیل چاویکول، به وسیله آنزیم چاویکول O-متیل ترانسفراز و تشکیل متیل چاویکول می­باشد. اوژنول از ترکیبات مهم انتهای مسیر بوده و توسط آنزیم اوژنول سینتاز1 (EGS1)[6] از پیش ماده کونیفریل استات بوجود می­آید (2001 ,Gang et al.).

عوامل محیطی باعث تغییرات در رشد گیاهان دارویی و نیز در مقدار و کیفیت مواد موثره آنها نظیر آلکالوئیدها، استروئیدها و روغن­های فرار (اسانس­ها) می­گردند (Omidbaigi, 2008). رشد و عملکرد گیاهان در بسیاری از مناطق دنیا به وسیله تنش­های محیطی زنده و غیر زنده متعدد محدود می­گردد. حدود یک سوم کره زمین را مناطق خشک و نیمه خشک در برمی­گیرد که وسعت این مناطق بیش از 45 میلیون کیلومتر مربع تخمین زده شده است. یکی از مهم‌ترین فاکتورهای محیطی موثر در زندگی گیاهان آب می­باشد. به طور معمول یک دوره­ی کمبود آب سبب اثرات منفی در رشد و نمو گیاهان می­شود (Ebadi & Azizi, 2011). امروزه مشخص شده است که تنش خشکی همیشه به طور کامل مضر نیست و گزار­ش­هایی مبنی بر تاثیر مثبت آن بر ساخت مواد موثره­ی گیاهان دارویی و معطر وجود دارد (Omidbaigi, 2008). در گیاهان مختلف تنش خشکی باعث افزایش مواد موثره آنها می­شود که این مطلب در گیاهان گل راعی (Hypericum brasiliens)، ریحان (O. american L.) و مرزه (Satureja hortesis L.) نشان داده شده است (Khalid, 2006). از آنجایی که شرایط تنشی در غالب نقاط کشور وجود دارد، با بررسی ارتباط بین تنش­های محیطی از جمله خشکی و تولید و تجمع متابولیت­های ثانویه در گیاهان و شناسایی ژن­های کلیدی و موثر در مسیر بیوسنتز ترکیبات فنیل پروپانوئیدی از جمله فنیل آلانین آمونیالیاز (PAL)، کافئیک اسید o-متیل ترانسفراز ((COMT و اوژنول سینتاز1 (EGS1) می­توان زمینه لازم برای دستکاری ژنتیکی مسیر بیوسنتز این ترکیبات و امکان افزایش تولید آنها در گیاهان را فراهم ساخت. بنابراین هدف از این پژوهش مطالعه تاثیر تنش خشکی بر میزان بیان ژن­های PAL، COMT وEGS1 و شناسایی سطح بهینه تنش جهت تغییر بیان این ژن­ها و احتمالا افزایش ترکیبات مهم فنیل پروپانوئیدی ریحان مانند اوژنول و متیل چاویکول بود.

مواد و روشﻫﺎ

به منظور بررسی تاثیر تنش خشکی بر بیان ژن­های PAL، COMT وEGS1 در رقم کشکنی لولوی ریحان (پروفسور عباس حسنی، گروه علوم باغبانی دانشگاه ارومیه)، آزمایشی به صورت گلدانی در گلخانه دانشکده کشاورزی دانشگاه ارومیه بر پایه طرح کاملا تصادفی با سه تیمار و سه تکرار اجرا شد. جهت تعیین درصد ظرفیت زراعی، نمونه­هایی از خاک مورد استفاده که مقدار رطوبت آن در حد ظرفیت زراعی بود، با استفاده از استوانه برداشته و برای تعیین رطوبت به آزمایشگاه گروه علوم خاک دانشکده کشاورزی دانشگاه ارومیه منتقل و درصد ظرفیت زراعی با استفاده از دستگاه صفحات فشاری (شرکت آذر خاک آب، ارومیه) اندازه گیری شد. پس از آماده سازی گلدان­ها، تعدادی بذر داخل آنها کاشته و تا رسیدن به مرحله 6-8 برگی، بوته­ها بطور یکسان آبیاری شدند و از این مرحله به بعد تنش خشکی با 50، 75 و 100 (کنترل) درصد ظرفیت زراعی اعمال شد.

در مرحله گلدهی کامل برای مطالعه بیان ژن­های مذکور نمونه­های برگی برداشت و به فریزر 80- درجه سانتی­گراد منتقل شد. توالی ژن­های مذکور از پایگاه­های اطلاعاتی ذخیره و آغازگرهای اختصاصی با استفاده از نرم افزارهای Fast PCR و Gene Runner طراحی شد (جدول 1). استخراج RNA از نمونه­های برگی با استفاده از محلول استخراج RNX-plus^TM (سیناکلون، ایران) مطابق دستورالعمل پیشنهادی شرکت سازنده با کمی تغییرات انجام شد. جهت ساخت cDNA از آغازگر هگزامر تصادفی و کیت Revert Aid First Strand cDNA Synthesis (شرکت فرمنتاز، آلمان) مطابق دستوالعمل پیشنهادی شرکت سازنده استفاده شد. برای بررسی صحت ساخت cDNA از واکنش­های کنترل منفی RT (عدم استفاده از آنزیم RT در مرحله­ سنتز (cDNA و NTC (عدم استفاده از RNA مورد مطالعه در مرحله­ سنتز (cDNA و همچنین از واکنش کنترل مثبت مطابق دستورالعمل کیت سنتز cDNA استفاده شد (Abdollahi Mandoulakani et al., 2017). میزان بیان ژن­ها با استفاده از  Real time PCR (Rotor gene Q-Pure Detection-Qiagen) مدل 6000 (شرکت کیاژن، آمریکا) در گیاهان تیمار شده نسبت به کنترل بررسی شد. در این فرایند از ژن 18SrRNA به عنوان ژن­ مرجع جهت نرمال سازی استفاده شد. واکنش­های Real time PCR با در نظر گرفتن دو تکرار بیولوژیک در حجم 5/12 میکرولیتر با استفاده از کیت Maxima SYBR Green/Fluoresence qPCR Master Mix (2x) (شرکت فرمنتاز، آلمان) طبق دستورالعمل شرکت سازنده انجام گرفت. دوره­های زمانی جهت تکثیر ژن­های مورد نظر با توجه به توالی آغازگرها و محصول حاصل از تکثیر ژن شامل فعال سازی ابتدایی آنزیم در دمای 95 درجه سانتی­گراد به مدت 10 دقیقه در یک سیکل و بعد 40 چرخه شامل مراحل واسرشته سازی در دمای 95 درجه سانتی­گراد به مدت 15 ثانیه و اتصال آغازگرها در دماهای اتصال مربوط به هر ژن (جدول 1) به مدت 30 ثانیه و بسط در دمای 72 درجه به مدت 40 ثانیه انجام شد. پس از انجام واکنش، منحنی ذوب (Melt curve) برای هر کدام از ژن­ها (شکل 1) رسم و صحت تکثیر محصول مربوط به هر ژن با استفاده از منحنی ذوب مربوط به آن ژن و همچنین آنالیز ژل تایید شد.

شکل 1- منحنی ذوب ژن­های کافئیک اسید o-متیل ترانسفراز ((COMT، اوژنول سینتاز1 (EGS1) و فنیل آلانین آمونیالیاز (PAL) در واکنش­های real time PCR. (از راست به چپ)

Figure 1- The Melt curve of caffeic acid O-methyl transferase (COMT), eugenol synthase 1 (EGS1) and phenylalanine ammonia lyase (PAL) genes in real time PCR reactions (from right to left)

در واکنش Real time PCR کمیت نسبی به وسیله اندازه­گیری افزایش تشعشع فلورسنس در نتیجه اتصال رنگ SYBR Green با محصول دو رشته­ای تکثیر شده با نرم افزار Rotor-Gene Q انجام می­گیرد. پس از اتمام واکنش­ها مقدار Threshold طوری در نظر گرفته شد که سیگنال­های فلورسنت را در فاز نمایی واکنش قطع کند. پس از بدست آوردن Ct، مقدار بیان نسبی ژن­های مورد مطالعه با روش CtΔΔ (Pfaffl et al., 2004) محاسبه شد. نرمال بودن اشتباهات و داده­ها حاصل از بیان نسبی ژن­ها با استفاده از روش کلموگراف-اسمیرنوف در نرم افزار Minitab نسخه 16 بررسی شد. برای بررسی اختلاف بین تیمارهای تنش به لحاظ میزان نسبی بیان ژنهای مورد مطالعه، آزمون t جفت نشده با نرم افزار SAS نسخه 1/9 انجام گرفت.

نتایج و بحث

تجزیه داده­ها و مقایسه میزان بیان ژن PAL در تنش شدید (50 درصد ظرفیت زراعی) و تنش متوسط (75 درصد ظرفیت زراعی) نسبت به کنترل (بدون اعمال تنش) نشان داد که میزان بیان این ژن به ترتیب 5/1 و 2 برابر در تنش شدید و متوسط افزایش یافته است (شکل 2). بنابراین می­توان بیان کرد که تنش خشکی تاثیر چندانی بر میزان بیان این ژن نداشته است. مقایسه میزان بیان ژن COMT در هر دو تیمار تنش نسبت به کنترل، نشان داد که تنش 50 درصد ظرفیت مزرعه­ای میزان بیان این ژن را تغییر نداده است. همچنین تنش 75 درصد ظرفیت مزرعه­ای میزان بیان این ژن را نسبت به کنترل به میزان ناچیزی (2/1 برابر) افزایش داده است (شکل 2). در مطالعه ای اثر تنش خشکی بر بیان برخی ژن­های دخیل در بیوسنتز فنیل پروپانوئیدها در ریحان گزارش شد که تنش خشکی 50 و 75 درصد ظرفیت مزرعه­ای بیان ژن سینامیل الکل دهیدروژناز را تغییر نمی­دهد و بیان ژن­های 4-کومارات کوآنزیم A لیگاز (4CL) و سینامات 4-هیدروکسیلاز (C4H) را کاهش می­دهد (Abdollahi Mandoulakani et al., 2017). درمطالعه­ای که روی بیان ژن­های PAL و C4H در پاسخ به تنش خشکی در گیاه چای انجام شد؛ بیان این ژن­ها کاهش یافت. در این تحقیق تنش خشکی به صورت قطع آبیاری انجام شد که در روزهای 4 و 6 شدیدا بیان این ژن­ها کاهش یافته و تا روز هشتم این کاهش ادامه داشت. درمقایسه با شرایط کنترل، میزان بیان ژنهای PAL و C4H در روزهای مذکور به ترتیب 61 و70 درصد کاهش نشان داد (Singh et al., 2009). در حالی­که، در مطالعه حاضر بیان ژن PAL تحت تاثیر تنش خشکی به میزان 5/1 تا 2 برابر افزایش یافت. در تحقیقی دیگر اثر تنش خشکی بر بیان ژن­های درگیر در مسیر بیوسنتز گلیسیریزین (ترپنوئید) در گیاه شیرین بیان بررسی شد؛ ارزیابی بیان ژن با استفاده semi-quantitative RT-PCR نشان داد که بیان ژن­های (SQS) Sequalene synthase وβ-amyrin synthase (bAS) دراثر تنش خشکی در مرحله گیاهچه و گیاه بالغ افزایش داشت در حالی که سطح بیان ژن   cyclo artenol synthase (CAS) نسبتا ثابت باقی ماند (Nasrollahi et al., 2014). در مطالعه حاضر نیز بیان ژن COMT در اثر تنش خشکی تغییر چندانی نشان نداد. تجزیه داده­ها و مقایسه میزان بیان ژن EGS1 در تیمار 75 و 50 درصد ظرفیت زراعی نسبت به شاهد نشان داد میزان بیان این ژن در تیمار 75 درصد تغییر چندانی نسبت به کنترل نداشته ولی در تیمار 50 درصد، 74/9 برابر کنترل افزایش  می­یابد (شکل 3). آنزیم EGS1 در انتهای مسیر بیوسنتز فنیل پروپانوئیدها در ریحان دخالت دارد  و باعث تولید اوژنول می­شود (Gang et al., 2001). در مطالعه­ دیگری گزارش شده که تنش خشکی 50 درصد ظرفیت مزرعه­ای در ریحان میزان بیان ژن­های چاویکول O-متیل ترنسفراز و اوژنول O-متیل ترانسفراز (از ژن­های مهم دخیل در بیوسنتز فنیل پروپانوئیدها در ریحان) را به ترتیب 46/6 و 33/46 برابر نسبت به کنترل افزایش می­دهد و تغییرات میزان بیان این ژن­ها تحت تنش خشکی با میزان متیل چاویکول و متیل اوژنول در ریحان همبستگی معنی داری دارد (Abdollahi Mandoulakani et al., 2017). در تحقیقی تنش خشکی سبب افزایش بیان ژن لینالول سینتاز و افزایش تولید لینالول در گیاه ریحان گردید (Khakdan et al., 2015). در پژوهش دیگری افزایش بیان چشمگیر ژن S-like RNase در گندم و خویشاوند وحشی گندم (Aegilops tauschii) در پاسخ به تنش خشکی گزارش گردید (Ravash et al., 2013).

جدول 1- مشخصات آغازگرهای مورد استفاده در واکنش­های Real time PCR.

Table 1- Characteristics of the used primers in Real time PCR reactions.

PAL: phenyl alanine ammonialyase, EGS1: eugenol synthase 1, COMT: caffeic acid o-methyltransferase

شکل 2- تاثیر سطوح مختلف تنش خشکی بر بیان نسبی ژنهای فنیل آلانین آمونیالیاز (PAL) و کافئیکo-متیل ترانسفراز((COMT در گیاه ریحان (T50: تنش خشکی 50 درصد ظرفیت زراعی و T75: تنش خشکی 75 درصد ظرفیت زراعی. محور عمودی نمودار میزان نسبی بیان ژن را نشان می­دهد و حروف متفاوت روی نمودار نشان دهنده اختلاف معنی دار درسطح 5 درصد بین تیمارها می­باشد).

Figure 2- The Effect of drought stress on the expression levels of phenylalanine ammonia lyase (PAL) and caffeic acid O- methyltransferase (COMT) in basil (T50: 50% of field capacity and T75: 75% of field capacity, vertical axis of the graph shows the relative expression levels of the genes and common letters on the graph show no significant difference between drought treatments).

در مطالعه ای تنش خشکی سبب افزایش بیان ژن پلیگون ردوکتاز (Polygon Redoctase) و انباشت ماده پلیگون در پونه ­شد (Hassanpour et al., 2014). در پژوهشی دیگر بیان ژن کلیدی دخیل در متابولیسم پرولین (P5CS) در برگ­ها و جوانه­های گل ژنوتیپ­های لوبیای معمولی (Phaseolus vulgaris L.) تحت تنش خشکی مورد بررسی قرار گرفت و نتایج حاکی از افزایش بیان معنی دار ژن P5CS در اثر تنش خشکی بود (Garaghanipur et al., 2014).

در تحقیق حاضر نیز بیان ژن EGS1 در اثر تنش خشکی شدید (50 درصد) افزایش یافته است و به نظر می­رسد با تغییر میزان بیان ژن­های دخیل در سنتز ترکیبات فنیل پروپانوئیدی بتوان میزان برخی از این ترکیبات از جمله اوژنول را در ریحان افزایش داد. البته لازم است در مطالعات آینده میزان ترکیبات تولیدی توسط این ژن­ها نیز اندازه گیری شود و ارتباط آن­ها با میزان بیان ژن­ها مطالعه شود تا با اطمینان بیشتری ژن­های کلیدی جهت دستکاری­های ژنتیکی به منظور تولید واریته­های ریحان دارای میزان بالایی از ترکیبات با ارزش شناسایی شود.