شناسایی نشانگرهای DNA مرتبط با ویژگی های فیتوشیمیایی میوه سماق (Rhus coriaria L.)

شناسایی نشانگرهای DNA مرتبط با ویژگی های فیتوشیمیایی میوه سماق (Rhus coriaria L.)

رسول محمدی آلاگوز[1]، رضا درویش زاده[2]^*،احمد علیجانپور³، حمید حاتمی ملکی⁴،راحله ابراهیمی⁵

1دانش آموخته کارشناسی ارشد بیوتکنولوژی کشاورزی، گروه اصلاح و بیوتکنولوژی گیاهی، دانشکده کشاورزی، دانشگاه ارومیه، ارومیه، ایران.

²استاد، گروه اصلاح و بیوتکنولوژی گیاهی، دانشکده کشاورزی، دانشگاه ارومیه، ارومیه، ایران.

³دانشیار، گروه جنگلداری، دانشکده منابع طبیعی، دانشگاه ارومیه، ارومیه، ایران.

⁴استادیار، گروه تولید و ژنتیک گیاهی، دانشکده کشاورزی، دانشگاه مراغه، مراغه، ایران.

⁵دانش آموخته کارشناسی ارشد اصلاح نباتات، گروه بیوتکنولوژی کشاورزی، پژوهشکده زیست فناوری دانشگاه ارومیه، ارومیه، ایران.

تاریخ دریافت: 30/05/1396، تاریخ پذیرش: 28/02/1397

چکیده

سماق (Rhus coriaria L.) که در ایران و خاورمیانه به عنوان یکی از ادویه های غذایی مهم شناخته می شود دارای اجزاء دارویی نظیر اسیدهای آلی، اسیدهای فنولی، فلاونوئیدها، آنتوسیانین ها، تانن ها و ترپنوئیدها می باشد. این گیاه از گونه­های مهم جنگلی است که پراکنش مناسبی در شمال غرب ایران دارد. در این بررسی، نمونه های برگ و میوه مربوط به 15 ژنوتیپ سماق از هریک از 5 ناحیه واقع در شمال غرب کشور به منظور انگشت نگاری با نشانگر ISSR و نیز اندازه گیری ترکیبات مالیک اسید، پروتوکاتکوئیک اسید و کوماریک اسید از طریق تکنیک LC-MS/MS مورد استفاده قرار گرفتند. نتایج آماره های توصیفی بیانگر وجود تنوع ژنتیکی در ژرم پلاسم سماق مورد مطالعه از نظر ویژگی های فیتوشیمیایی می باشد. در مورد مالیک اسید و کوماریک اسید تنوع بین جمعیتی بیشتر از تنوع درون جمعیتی بود. مطالعه ساختار جمعیت مربوط به 75 ژنوتیپ سماق با استفاده از داده های 18 آغازگر ISSR شامل 132 نشانگر ISSR و در نرم افزار Structure آن ها را در دو زیرجمعیت مختلف قرار داد. نتایج تجزیه ارتباطی نشان داد که نشانگرهایUBC867، UBC801 وUBC864  به ترتیب دارای ارتباط معنی دار با نواحی ژنومی کنترل کننده مالیک اسید، کوماریک اسید و پروتوکاتکوئیک اسید هستند. نشانگرهای شناسایی شده در این تحقیق در صورت تایید می توانند در برنامه به نژادی بواسطه گزینش به کمک نشانگر در سماق بکار گرفته شوند.

واژه های کلیدی: سماق، تنوع  ژنتیکی، LC-MS/MS، تجزیه ارتباطی.

مقدمه

سماق (Rhus coriaria L.) از خانواده Anacardiaceae بوده و در مناطق نیمه گرمسیری و معتدل بویژه در آسیای شرقی، آفریقا و آمریکای شمالی رشد می کند. سماق درختچه ای دیرزیست، تک پایه و با ارتفاعی حدود 1 تا 4 متر است که طعم گس اسیدی میوه آن بیشتر به دلیل وجود ترکیبات مختلف تانن و اسیدهای آلی می باشد (Rawashdeh et al., 2009). آنتوسیانین ها و چربی های ثابت به عنوان مواد اصلی تشکیل دهنده میوه سماق شناخته شده اند (Guvenc and Koyuncu, 1994). آنتوسیانین های Delphidin، Myrtillin و Chrysanthemin به عنوان آنتوسیانین های میوه سماق و اسید اولئیک، لینولئیک و پالمتیک به عنوان بیشترین اسیدهای چرب و اسید مالیک، سیتریک، فوماریک و تارتاریک به عنوان مهم ترین اسیدهای آلی در میوه سماق شناخته شده اند (Mavlyanov et al., 1997; Dogan & Akgul, 2005). امروزه از میوه سماق برای انعقاد خون، ضداسهال، درمان چرک گوش، درمان تراخم گرم چشم، و ممانعت از بروز آبله در چشم و موارد دیگر استفاده می گردد (Ahmadian-Attari et al., 2008). شناسایی مکان­های ژنی کنترل کننده صفات در گیاهان مختلفی از خانواده Anacardiaceae شامل بادام هندی (Cavalcanti et al., 2012) و انبه (Lal et al., 2017) انجام شده است این در حالی است که در گیاه سماق در این زمینه گزارشی وجود ندارد. در مطالعه ای که توسط Cavalcanti et al. (2012) با استفاده از 71 ژنوتیپ [3]F₁ بادام زمینی حاصل از تلاقیCCP1001×CP96  انجام شد، مشخص گردید که 11 [4]QTL در کنترل صفت عملکرد و صفات مورفولوژیک موثر در آن نقش دارند و ضریب تبیین مکان های ژنی شناسایی شده بین 79/3 الی 98/12 درصد متغیر می باشد. همچنین، Lal et al. (2017) با استفاده از تجزیه ارتباطی از طریق نشانگرهای ریزماهواره و روش مدل خطی مخلوط ([5]MLM) بیان نمودند که 5 جایگاه ریزماهواره ای ([6]SSR) با شش متغیر مربوط به میوه انبه دارای ارتباط معنی دار بوده و می توانند در برنامه های به نژادی بواسطه نشانگر ([7]MAB) بکار روند. با توجه به اهمیت دارویی گیاه سماق، مطالعه ژنتیکی و شناسایی نواحی ژنومی کنترل کننده مواد موثره دارویی آن می تواند گامی موثر در به نژادی گیاه مزبور باشد. امروزه با وجود نشانگرهای مولکولی [8]DNA، امکان شناسایی مکان های ژنی کنترل کننده صفات و گزینش به کمک نشانگر، برای به نژادی صفات با وراثت پذیری پایین و صفات با قابلیت ظهور در مراحل انتهایی رشد و توسعه گیاه میسر شده است. بدین منظور می توان با ارزیابی تنوع فنوتیپی و مولکولی جمعیت ژنتیکی علاوه بر اطلاع از غنای آللی، از طریق روش های تجزیه ارتباطی[9] و یا تجزیه مبتنی بر پیوستگی[10] نشانگرهای مولکولی پیوسته با عوامل کنترل کننده صفات را شناسایی کرد (Najafzadeh et al., 2016; Heydari et al., 2014). از طرفی با توجه به اینکه برخلاف درختان میوه و گیاهان زراعی، جمعیت های مربوط به درختان جنگلی، فاقد ساختار ژنتیکی ساده ای هستند بنابراین استفاده از روش تجزیۀ ارتباطی در درختان جنگلی به منظور شناسایی ارتباط نشانگر صفت بسیار مفید است (Awais Khan et al., 2012). این تحقیق با هدف شناسایی نشانگرهای بین ریزماهواره ای (ISSR[11]) مرتبط با صفات فیتوشیمیایی میوه در جمعیت های سماق جمع آوری شده از مناطق شمال غرب ایران انجام گرفته است.

مواد و روش ها

در این تحقیق 5 جمعیت طبیعی سماق از شمال غرب کشور شامل 2 منطقه از آذربایجان شرقی (آقبراز در هوراند و وینق در ارسباران) و 3 منطقه از آذربایجان غربی (دره خان، دره نیژ و کچله هر سه در ارومیه) مورد بررسی قرار گرفتند (جدول 1). نمونه­های برگی از سرشاخه­های جوان درختچه های سماق با ظاهر سالم در اواخر خرداد ماه 1394 از مناطق تحت بررسی و با انتخاب 15 پایه در هر منطقه آماده شد. نمونه برداری طبق الگوی خاص و با رعایت قوانین نمونه برداری و آماری با فاصله حدود 5 درخت (15 متر) انجام شد. سپس جهت استخراج DNA و تعیین تنوع ژنتیکی با نشانگرهای مولکولی ISSR، برگ های جمع آوری شده از هر پایه در داخل کاغذ آلومنیوم و در داخل فلاسک حاوی ازت مایع قرار داده شده و به آزمایشگاه منتقل و تا مرحله استخراج DNA در دمای °C80- نگهداری شدند. نمونه میوه از درختانی که نمونه های برگی از آنها انتخاب شده بود، برداشت (جدول 1) و در شرایط سایه خشک شدند. پریکارپ میوه از دانه آن جدا و بوسیله آسیاب خانگی خرد شد. به 5/0 گرم از پریکاپ های خرد شده مقدار 10 میلی لیتر متانول (HPLC grade) 80 درصد حجمی به حجمی، اضافه شد. نمونه ها در حمام اولتراسونیک شرکتELMA  (آلمان) به مدت 45 دقیقه و در دمای اتاق عصاره گیری شدند. بعد از این مرحله، نمونه ها به مدت 15 دقیقه در 3000 دور در دقیقه در دمای اتاق سانتریفوژ شده و سپس با فیلتر سرنگی 22/0 میکرونی (ساخت شرکت پال آمریکا) فیلتر شده و برای تجزیه در فریزر °C20- نگهداری شدند. نمونه های متانولی پریکارپ (Pericarp) میوه سماق در دستگاه LC-MS/MS[12] با سیستم اتاقک جداسازی پیوسته (Waters, Milford, MA, USA) شامل سیستم تحویل حلال چهار جزئی تجزیه شدند.

جدول 1- موقعیت جغرافیایی مناطق جمع آوری نمونه های برگ و میوه سماق.

 Table 1- Geographical situation of the collection areas of Sumac leaf and fruit.

در این سیستم چون ستون ها نسبتا طویل و اندازه ذرات کوچک است بنابراین بایستی برای جریان حلال در طول ستون فشاری اعمال شود که برای ایجاد فشار از موتور پمپ استفاده می شود. مهم است که مقدار فشار ثابت و بدون نوسان باشد.

پمپ فشاری حدود psi 4500 ایجاد می کند. حلال توسط پمپ با دمش ثابت بر روی فاز ثابت حرکت داده می شود. بسته به هدف، برداشت از مخازن و میزان دمش متفاوت است. در این بررسی از روش گرادیانت یا چهار جزئی استفاده گردید که در آن چهار نوع مخزن A، B، C، D با حلال های متفاوت وجود دارد و دستگاه قابلیت برداشت نسبت های مختلف از مخازن را دارا بود. شناسایی سه ترکیب  مهم مالیک اسید، پروتوکاتکوئیک اسید و کوماریک اسید در سطح الکترواسپری منفی انجام گرفت (شکل 1). مساحت زیر منحنی برای هر ترکیب در هر یک از نمونه های سماق به صورت AUC اندازه گیری شد. بدین صورت که برای محاسبه مقدار کمی ترکیبات شناسایی شده، سطح هر نوار جذبی (مساحت زیر منحنی یا Area Under a Curve) برای ترکیب مورد نظر محاسبه می گردد زیرا سطح هر نوار جذبی متناسب با مقدار نسبی ترکیبات می باشد که بوسیله انتگراتور یا سطح سنج به طریقه اتوماتیک توسط نرم افزار یا به صورت دستی (حاصلضرب قاعده × نصف ارتفاع) بدست می آید.

شکل 1- کروماتوگرام مربوط به یکی از نمونه های میوه سماق در سطح الکترواسپری منفی. (A) کروماتوگرام مربوط به شناسایی مالئیک اسید با استفاده از بانک های اطلاعاتی MAS. (B) کروماتوگرام شناسایی پروتوکاتکوئیک اسید. (C) کروماتوگرام شناسایی کوماریک اسید.

Figure 1- Chromatogram for one of sumac fruit sample in the negative electrospray level. (A) Chromatogram related to identification of Malic acid using MAS database. (B) Chromatogram related to identification of Protocatechoice acid. (C) Chromatogram related to identification of Coumaric acid.

نمونه های برگی با استفاده از ازت مایع در ظروف چینی ضدعفونی شده کوبیده شده و سپس استخراج DNA ژنومی از برگ های پودر شده طبق دستورالعمل و با استفاده از کیت استخراج DNA (dBIOZOL genomic DNA extraction Regent, Japan) انجام شد. کمیت و کیفیت DNA به وسیله الکتروفورز افقی با استفاده از ژل آگارز 1% تعیین شد و در زیر نور فرابنفش در دستگاه Gel Documentation عکس برداری انجام شد. جهت انگشت نگاری افراد، از 18 آغازگر ISSR (جدول 2) استفاده شد.

جدول 2- آغازگر های بین ریزماهواره ای انتخاب شده برای ارزیابی تنوع ژنتیکی گیاه سماق.

Table 2- Selected ISSR primers for evaluation of Sumac genetic diversity.

آغازگرهای مورد استفاده، با توجه به داشتن الگوی نواربندی واضح، از میان 60 آغازگر ISSR انتخاب شدند. واکنش PCR در دستگاه ترموسایکلر Applied Biosystem (ساخت آمریکا) برای آغازگرهای مورد بررسی در حجم 23 میکرولیتری شامل DNA ژنومی (20 نانوگرم)، 2 میکرولیتر بافر PCR (10X)، آب دو بار تقطیر شده (DDW)، 9/0 میکرولیتر کلرید منیزیم (25 میلی مولار)، 5/0 میکرولیترdNTPs  (10 میلی مولار)، 28/0 میکرولیتر آنزیم Taq DNA polymerase یک واحد و یک میکرولیتر از هر یک از آغازگرها با غلظت 100 میکرو مولار بود. مراحل PCR به ترتیب شامل واسرشت­سازی اولیه در دمای C°94 (4 دقیقه) و 35 چرخه شامل واسرشت سازی در دمای C°94 (30 ثانیه)، اتصال آغازگرها [بسته به نوع آغازگر استفاده شده، دمای اتصال بین 27 الی 53 درجه سانتی گراد متفاوت بود (جدول 2)] (به مدت 45 ثانیه) و مرحله بسط در دمای C°72 (2 دقیقه) و یک مرحله برای بسط نهایی در دمای C°72 (10 دقیقه) بودند. پس از تکثیر، فراورده های PCR روی ژل آگارز 8/1 درصد و در ولتاژ 80 ولت تفکیک گردید.

آماره های توصیفی برای صفات فیتوشیمیایی مورد مطالعه با استفاده از نرم افزارSPSS 23  محاسبه شد. قطعات حاصل از نشانگرها بصورت (1) حضور و (0) عدم حضور امتیازدهی و ماتریس حاصل برای بررسی ساختار جمعیت استفاده شد. سپس به منظور بررسی تمایز و تفکیک جمعیت های سماق با استفاده از نشانگرهای ISSR، تجزیه واریانس مولکولی (AMOVA) با استفاده از نرم افزارGenALEx 6.41 انجام گرفت. تجزیه مؤثر ساختار جمعیت و دسته بندی دقیق ژنوتیپ ها به زیرجمعیت های مناسب و تشخیص ژنوتیپ های مختلط با استفاده از روشBayesian  در نرم افزار Structure 2.3.4  (Pritchard et al., 2000) انجام گرفت. این روش هر یک از ژنوتیپ ها را با یک احتمال و طوری به زیرجمعیت های فرضی منتسب می کند که در هر زیرجمعیت میزان عدم تعادل پیوستگی حداقل و تعادل مرحله گامتی حداکثر باشد. مقادیر اولیه K (زیرجمعیت فرضی اولیه) بین 1 تا 10 در نظر گرفته شد و جهت افزایش دقت برای هر کدام از زیرجمعیت ها 5 تکرار منظور گردید. برای این منظور از مدل Admixture و استقلال فراوانی آللی با 10000 تکرار Burn-in (دوره گرم کردن) و 10000 تکرار [13]MCMC استفاده گردید تا منحنی حداکثر درست نمایی حاصل شود. نرم افزار Structure 2.3.4 برای هر مقدار  K(تعداد واقعی زیر جمعیت) یک ماتریس به نام Qst را محاسبه می کند که این ماتریس شامل برآورد ضرایب احتمال عضویت هر ژنوتیپ در هر یک از زیرجمعیت ها است. در بارپلات حاصل، وقتی درصد عضویت یک ژنوتیپ به یک کلاستر بیشتر یا مساوی 7/0 باشد، ژنوتیپ به آن کلاستر نسبت داده می شود، ولی در صورتی که درصد عضویت آن کمتر از این مقدار باشد، به عنوان ژنوتیپ ترکیبی (مخلوط شده) در نظر گرفته می شود (Spataro et al., 2011). تعداد واقعی زیرجمعیت توسط لگاریتم Likelihood برای هر K؛LnP (D)= L(K)  تعیین می شود (Rosenberg et al., 2002). از آنجایی که توزیع  LnP(D)عدد دقیق و واضحی از  Kواقعی را نشان نمی دهد، ΔK مبنی بر برآورد ثانویه تغییر در Likelihood جهت برآورد دقیق مقدار واقعی K استفاده می شود (Evanno et al., 2005). به منظور شناسایی نشانگرهای پیوسته با صفات مورد مطالعه از تجزیۀ ارتباط به روش مدل خطی مخلوط (MLM) وابسته به مدل Q+K در نرم افزار TASSEL 3.0 استفاده شد.

نتایج و بحث

نتایج آماره های توصیفی (جدول 3) نشان داد که از میان سه ترکیب فیتوشیمیایی مورد مطالعه در میوه سماق شامل مالیک اسید، پروتوکاتکوئیک اسید و کوماریک اسید، بیشترین و کمترین مقدار به ترتیب مربوط به مالیک اسید و پروتوکاتکوئیک اسید می باشد. یافته ها نشان داد که بر خلاف پروتوکاتکوئیک اسید در مورد مالیک اسید و کوماریک اسید تفاوت در بین جمعیت ها بیشتر از درون جمعیت ها است که این تفاوت احتمال دارد ناشی از اختلاف شرایط رویشی و توپوگرافی نمونه ها باشد. در اکثر موارد بر نقش رویشگاه به عنوان عامل تاثیرگذار در تجمع متابولیت های ثانویه تاکید شده است (Hemati et al., 2003; Srivastava & Shym, 2002; Hemmati et al., 2006). مکان رشد گیاه می تواند از طریق تغییرات دمایی و رطوبتی بر فرایند تشکیل مواد موثره تاثیرگذار باشد. مکانیسم تاثیرات محیط بر تجمع متابولیت های ثانویه به درستی روشن نیست. با این وجود روشن است که محیط از طریق تاثیری که در فرایند تولید متابولیت و عوامل مرتبط به فرآیند تولید (مثل آنزیم ها) دارد، در نوع و شدت واکنش های شیمیایی موثر است. مقادیر ضریب تغییرات (جدول 3) بیانگر وجود تنوع فیتوشیمیایی در ژرم پلاسم مورد بررسی است که این امر در توافق با گزارشات قبلی (Rawashdeh et al., 2009) مبنی بر وجود تنوع ژنتیکی در سماق و با استفاده از داده های نشانگرهای AFLP (تفاوت طول قطعه های حاصل از تکثیر) می باشد. همچنین، توزیع فراوانی ترکیبات فیتوشیمیایی (شکل 2) نشان دهنده وجود تنوع ژنتیکی و سیستم چندژنی در کنترل متغیرهای مورد مطالعه است.

جدول 3- مقادیر آماره های توصیفی برای صفات فیتوشیمیایی در جمعیت های سماق مورد مطالعه (مقادیر بصورت مساحت زیر منحنی (AUC) محاسبه شده اند و واحد ندارند).

Table 3- The values of descriptive statistics of phytochemical characteristics in studied sumac populations.

 CV: Coefficient of variation, MS: Mean-square

وجود چنین جمعیت های متنوعی از سماق در کشور بیانگر امکان گزینش در جمعیت های مذکور و نیز کارا بودن شناسایی مکان های ژنی کنترل کننده صفات با استفاده از تکنیک تجزیه ارتباطی در این جمعیت ها است. 

در ارزیابی تنوع ژنتیکی با  18 آغازگر ISSR، 132 مکان ژنی تکثیر شدند. نتایج تجزیه واریانس مولکولی بر اساس داده های نشانگر ISSR نشان داد که 71 درصد از تنوع برآورد شده مربوط به تنوع درون جمعیت ها و 29 درصد مربوط به بین جمعیت ها می باشد (جدول 4). تاریخ پیچیده اصلاحی بسیاری از گیاهان مهم و جریان ژنی محدود شده در بیشتر گیاهان وحشی، ساختارهای پیچیده ای در ژرم پلاسم به وجود می آورد که باید در مطالعات تجزیه ارتباطی در نظر گرفته شود (Zhu et al., 2008).

شکل 2- توزیع فراوانی ترکیبات فیتوشیمیایی  در جمعیت های سماق مورد مطالعه. در شکل بیشترین میزان تولید هر ترکیب و همچنین عرض و طول موقعیت جغرافیایی برداشت نمونه آن مشخص شده است. (φ): عرض جغرافیایی. (λ): طول جغرافیایی.

Figure 2- Frequency distribution of studied phytochemical characteristics in Sumac populations.

جدول 4- تجزیه واریانس مولکولی (AMOVA) 5 جمعیت سماق با استفاده از نشانگرهای ISSR

Table 4- Analysis of molecular variance of 5 Sumac populations using ISSR markers.

تجزیه مؤثر ساختار ژنتیکی جمعیت و دسته بندی دقیق افراد به زیرجمعیت های مناسب با استفاده از داده های 18 آغازگر ISSR شامل 132 نشانگر ISSR در نرم افزار Structure انجام گرفت و 2 زیرجمعیت احتمالی (2 K=) در ژنوتیپ های مورد مطالعه شناسایی شد و 2 K= به عنوان مقدار K بهینه در تخمین ساختار جمعیت و محاسبه ماتریس سهم عضویت افراد در هر گروه (ماتریس Q) تعیین شد. بر اساس نتایج ارائه شده در بارپلات (شکل 3) در مجموع 84 درصد ژنوتیپ های مورد مطالعه دارای درصد عضویت بیشتر و مساوی 7/0 و 16 درصد ژنوتیپ ها دارای سهم عضویت کمتر از 7/0 می باشند. با احتمال 41 درصد، 31 فرد متعلق به زیر ساختار اول (قرمز) و 32 فرد متعلق به زیر ساختار دوم (سبز) می باشند. وجود ساختار در ژنوتیپ­های مورد مطالعه بیانگر اهمیت استفاده از ماتریس ساختار جمعیتی در مطالعات مرتبط با تجزیه ارتباطی در ژرم­پلاسم سماق است تا بتوان درصد خطاهای مثبت را کاهش داد. ساختار یک جمعیت، حاصل انتخاب و در سطوح بالاتر اختلاط در آن جمعیت می باشد و منجر به افزایش عدم تعادل پیوستگی بین نشانگرهای غیرپیوسته می شود (Cardon & Palmer, 2003; Rostok et al., 2006). بنابراین در نظر گرفتن ساختار جمعیت در مطالعات تجزیه ارتباطی به منظور شناسایی واریانت های کمیاب در مکان هایی که بین جمعیت ها متغیر هستند، ولی بطور شایعی درون زیرجمعیت ها تثبیت شده اند، از اهمیت خاصی برخوردار می باشد (Flint-Garcia et al., 2005). نتایج تجزیه ارتباطی برای صفات فیتوشیمیایی در ژنوتیپ های سماق در جدول 5 ارائه شده است. در این تحقیق، از طریق روش MLM در مجموع تعداد 3 نشانگر ISSR با هر یک از صفات مورد مطالعه پیوسته بودند (جدول 5). ضریب تبیین (درصد واریانس فنوتیپی توجیه شده توسط هر نشانگر) نشانگرهای پیوسته با مالیک اسید، پروتوکاتکوئیک و کوماریک اسید به ترتیب 13%، 1% و 9% می باشند (جدول 5). بیشترین میزان ضریب تبیین مربوط به ارتباط سومین جایگاه ژنی نشانگر UBC867 با عملکرد مالئیک اسید می باشد (شکل 4). اگرچه در مورد مکان یابی ژنی در سماق گزارشی وجود ندارد ولی نتایج تحقیقات مکان یابی ژنی در گیاهان هم خانواده آن نظیر بادام هندی و با استفاده از 85 خانواده تمام خواهری حاصل از تلاقی CCP1001×CP96 نشان داد که تعداد 3، 4 و 4 QTLs در کنترل صفات وزن مغز، گل های نر و گل های هرمافرودیت نقش دارند.

شکل 3- تجزیه ساختار جمعیتی مربوط به 75 ژنوتیپ سماق (از 5 ناحیه مختلف) به دو زیرجمعیت با استفاده از داده های حاصل از 132 مکان ژنی تکثیر یافته توسط 18 آغازگر ISSR. اعداد روی محور افقی و عمودی به ترتیب شماره افراد و ضریب تعلق هر فرد به هر کلاستر را نشان می دهند.

Figure 3- Population structure analysis of 75 Sumac genotypes (from 5 different regions) into 2 sub-populations using data of 132 amplified loci by 18 ISSR primers. Digits on horizontal and vertical axis show individual number and individual affiliation coefficient to each cluster, respectively. 

شکل 4- الگوی باندی 30 نمونه سماق با آغازگر UBC867. شکل نمایانگر باندی با اندازه تقریبی 900 جفت باز است که ارتباط معنی داری با تولید مالئیک اسید دارد.

Figure 4- Banding profile of 30 Sumac genotypes using UBC867 ISSR primer. The position of band with 900 bp weight with significant association by malic acid production has been presented.

با توجه به غالب بودن نشانگر ISSR مورد استفاده در تحقیق حاضر، می توان با تبدیل نشانگرهای شناسایی شده به نشانگرهای هم بارز نظیرSCAR  (ناحیه تکثیر شونده با ردیف مشخص) با قابلیت اطمینان بیشتری از این نشانگرها در گزینش به کمک نشانگر (Marker-Assisted Selection) استفاده نمود (Osipova et al., 2003).

جدول 5-  نشانگرهای پیوسته شناسایی شده برای صفات فیتوشیمیایی از طریق تجزیه ارتباطی  در جمعیت های سماق مورد مطالعه.

Table 3- Identified linked markers with phytochemical characteristics via association mapping in Sumac populations.

R²: Coefficient of determination

از آنجائیکه محتوای مالیک اسید، پروتوکاتکوئیک و کوماریک اسید از مهمترین ترکیبات برای تعیین میزان خواص آنتی اکسیدانی، ضد میکروبی و در  کل خواص دارویی میوه سماق است با شناسایی نشانگرهای مرتبط با این ترکیبات می توان در جهت بهبود میزان تولید این ترکیب گام برداشت. به طوریکه با شناسایی مکان های مرتبط با میزان تولید کوماریک اسید که به عنوان شروع کننده مسیر تولید ترکیبات فنلی است می توان میزان تولید این ترکیبات را افزایش داد. البته باید این مطلب را در نظر داشت که تولید این ترکیبات تا حد زیادی تحت تاثیر عوامل محیطی مانند ارتفاع از سطح دریا و جهت عمومی دامنه رشدی و غیره قرار دارد که می توان در مطالعات بعدی این عوامل را نیز لحاظ کرد و یک ارتباط کانونی (تجزیه همبستگی کانونیک) را بوجود آورد. در این پژوهش تجزیه ارتباط با تعداد نشانگر کم (تعداد 132 نشانگر تولیده شده با استفاده از 18 آغازگر ISSR) انجام گرفت که نوعی محدودیت برای تحقیق به حساب می آید. البته آغازگرهای زیادی تست شدند که با توجه به داشتن الگوی نواربندی واضح، 18 آغازگر برای ادامه تحقیق انتخاب شدند. بنابراین لازم است در مطالعات تکمیلی با تغییر سیستم نشانگر این مشکل برطرف شود. در این مورد نشانگرهای مبتنی بر توالی یابی از قبیل SNP (چند شکلی تک نوکلئوتیدی) می توانند گزینه مناسبی باشند. هرچند که در مطالعات قبلی (Abdurakhmonov and Abdukarimov, 2008) نشان داده شده است که در گیاهان دگرگرده افشان سطح بالایی از نامتعادلی پیوستگی ژنی وجود دارد که این مسئله نیاز به تعداد زیاد نشانگر را کاهش می دهد.