تجمع رونوشت ژن-های PALو PR-1 قبل از مواجهه با آلودگی پوسیدگی بلال در ذرت، عاملی موثر در مقاومت به قارچ فوزاریوم

نوع مقاله : مقاله پژوهشی

نویسندگان

1 دانشیار گروه زراعت و اصلاح نباتات، دانشکده کشاورزی، دانشگاه بوعلی سینا همدان، همدان، ایران

2 دانشیار گروه بیوتکنولوژی و اصلاح نباتات، دانشکده تولید گیاهی، دانشگاه علوم کشاورزی و منابع طبیعی گرگان، گرگان، ایران.

3 دانش‌آموخته دکتری اصلاح نباتات، دانشگاه بوعلی سینا همدان

چکیده

پوسیدگی فوزاریومی بلال با عامل Fusarium verticillioides یکی از مهمترین بیماری­های ذرت در سراسر دنیا می­باشد. گیاهان از طریق فعال­سازی راهبردهای دفاعی پیچیده به حمله پاتوژن­ها پاسخ می­دهند. پاسخ دفاعی به عفونت پاتوژن شامل تغییرات در بیان شمار زیادی از ژن­های گیاه است که ممکن است بیان ژن افزایش یا کاهش یابد. سه لاین با سطح مقاومت متفاوت به قارچ فوزاریوم (C7, B73, MO17) در قالب طرح  بلوک کامل تصادفی کشت شدند. بعد از ظهور ابریشم، گرده افشانی دستی انجام گرفت و 15 روز پس از آن مایه­زنی با قارچ فوزاریوم با استفاده از سرنگ (آلوده سازی دانه) و سرسرنگ (آلوده سازی ابریشم) انجام گرفت. سپس در 12، 24، 48، 72 و 96 ساعت پس از آلودگی نمونه­برداری از ابریشم و دانه ذرت صورت گرفت. بلال تلقیح نشده به عنوان شاهد استفاده شد. بعد از استخراج RNA و ساخت cDNA ، با استفاده از تکنیک Real-time PCR الگوی بیان نسبی ژن­های PAL و PR-1 اندازه­گیری و داده­ها با استفاده از نرم افزار REST تجزیه شدند. همه ژنوتیپ­ها قادر به بیان ژ­ن­های PAL و PR-1 بعد از آلودگی به قارچ فوزاریوم هستند و تنها تفاوت آن­ها در سطح بیان ژن­ها است. تغییرات عمده در بیان ژن­های دفاعی در لاین مقاوم و حساس قبل از آلودگی اتفاق می­افتد. لاین مقاوم قبل از ایجاد آلودگی دارای سطح بالایی از بیان ژن­های PAL و PR-1 است و شاید همین به عنوان مانع اولیه در برابر حمله پاتوژن عمل کند ولی لاین حساس نسبت به لاین مقاوم، بعد از آلودگی بیان ژن­های PAL و PR-1 را آغاز می­کند.

کلیدواژه‌ها

عنوان مقاله [English]

The accumulation of PAL and PR-1 gene transcription before exposure to corn ear rot infection is an effective factor in resistance to Fusarium fungus

نویسندگان [English]

  • Hojat-ol-allah Mazaheri 1
  • Hasan Soltanloo 2
  • Afshin Mosavat 3
1 Associate Professor, Department of Agronomy and Plant Breeding, Faculty of Agriculture, Bu-Ali Sina University, Hamedan, Iran.
2 Associate Professor, Department of Plant Breeding & Biotechnology, Plant Production College, Gorgan University of Agricultural Sciences and Natural Resources, Gorgan, Iran.
3 Graduated PhD, Bu-Ali Sina University, Research Instructor of Agronomy
چکیده [English]

 
Fusarium ear rot with Fusarium verticillioides is one of the most important corn diseases around the world. Plants respond to pathogens attack by activating complex defense strategies. Defense response to pathogen infection includes changes in the expression of a large number of plant genes which may be a gene expression increase or decrease. Three lines with different resistance levels to fusarium fungus (C7, B73, MO17) cultivated based on RCBD design. After silking manual pollination was carried out and 15 days after that inoculation with fusarium funus was done by syringe (for seed inoculation) or needle (for silk inoculation). Then, silk and corn grain were sampled at 12, 24, 48, 72 and 96 hours after contamination. Non inoculated ear was used as control. After RNA extraction and cDNA production, synthesis the Real-Time PCR technique, the relative expression pattern of PAL, PR-1 genes were measured and data were analyzed using REST software. All genotypes are able to express PAL and PR-1 genes after infection with Fusarium fungus and their only difference is in the level of gene expression. Major changes in the expression of defense genes in the resistant and susceptible lines occur before infection. Resistant line have a high level of expression of PAL and PR-1 genes before contamination and that may be the primary barrier against a pathogen attack, but susceptible line to resistant line, after infection, the expression of PAL, PR-1 genes begins.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Corn
  • Fusarium funus
  • Gene expression
  • PAL
  • PR-1

اصل مقاله

تجمع رونوشت ژن-های  PALو PR-1 قبل از مواجهه با آلودگی پوسیدگی بلال در ذرت، عاملی موثر در مقاومت به قارچ فوزاریوم

 

سید افشین مساوات1، حجت الله مظاهری لقب2*، حسن سلطانلو3

1دانش­آموخته دکتری اصلاح نباتات، دانشگاه بوعلی سینا همدان و مربی پژوهش بخش تحقیقات زراعی و باغی، مرکز تحقیقات و آموزش کشاورزی و منابع طبیعی گلستان، سازمان تحقیقات، آموزش و ترویج کشاورزی، گرگان. ایران.

2 دانشیار گروه زراعت و اصلاح نباتات، دانشکده کشاورزی، دانشگاه بوعلی سینا همدان، همدان، ایران.

3 دانشیار گروه بیوتکنولوژی و اصلاح نباتات، دانشکده تولید گیاهی، دانشگاه علوم کشاورزی و منابع طبیعی گرگان، گرگان، ایران.

تاریخ دریافت: 11/10/1396، تاریخ پذیرش: 28/03/1397

چکیده

پوسیدگی فوزاریومی بلال با عامل Fusarium verticillioides یکی از مهمترین بیماری­های ذرت در سراسر دنیا می­باشد. گیاهان از طریق فعال­سازی راهبردهای دفاعی پیچیده به حمله پاتوژن­ها پاسخ می­دهند. پاسخ دفاعی به عفونت پاتوژن شامل تغییرات در بیان شمار زیادی از ژن­های گیاه است که ممکن است بیان ژن افزایش یا کاهش یابد. سه لاین با سطح مقاومت متفاوت به قارچ فوزاریوم (C7, B73, MO17) در قالب طرح  بلوک کامل تصادفی کشت شدند. بعد از ظهور ابریشم، گرده افشانی دستی انجام گرفت و 15 روز پس از آن مایه­زنی با قارچ فوزاریوم با استفاده از سرنگ (آلوده سازی دانه) و سرسرنگ (آلوده سازی ابریشم) انجام گرفت. سپس در 12، 24، 48، 72 و 96 ساعت پس از آلودگی نمونه­برداری از ابریشم و دانه ذرت صورت گرفت. بلال تلقیح نشده به عنوان شاهد استفاده شد. بعد از استخراج RNA و ساخت cDNA ، با استفاده از تکنیک Real-time PCR الگوی بیان نسبی ژن­های PAL و PR-1 اندازه­گیری و داده­ها با استفاده از نرم افزار REST تجزیه شدند. همه ژنوتیپ­ها قادر به بیان ژ­ن­های PAL و PR-1 بعد از آلودگی به قارچ فوزاریوم هستند و تنها تفاوت آن­ها در سطح بیان ژن­ها است. تغییرات عمده در بیان ژن­های دفاعی در لاین مقاوم و حساس قبل از آلودگی اتفاق می­افتد. لاین مقاوم قبل از ایجاد آلودگی دارای سطح بالایی از بیان ژن­های PAL و PR-1 است و شاید همین به عنوان مانع اولیه در برابر حمله پاتوژن عمل کند ولی لاین حساس نسبت به لاین مقاوم، بعد از آلودگی بیان ژن­های PAL و PR-1 را آغاز می­کند.

واژه­های کلیدی: بیان ژن، ذرت، قارچ فوزاریوم، PAL، PR-1.

مقدمه

 

ذرت (Zea mays) با عدد کروموزمومی  2n=2x=20 به عنوان یک محصول غذایی راهبردی، قسمت عمده­ای از زمین­های قابل کشت جهان را به خود اختصاص داده و برای غذا، خوراک دام، سوخت و فیبر، نه تنها در مناطق معتدل بلکه در مناطق گرمسیری و نیمه­گرمسیری مورد استفاده قرار می­گیرد. چنانچه عوامل بازدارنده رشد این محصول از جمله بیماری­های ذرت به خوبی شناخته و با آنها مقابله اصولی انجام گیرد، افزایش سطح کشت و تولید بیشتر آن کاملاً قابل پیش بینی است. بنابراین با توجه به افزایش روند روز افزون جمعیت، ضرورت افزایش تولیدات زراعی و نقشی که ذرت می­تواند در این ارتباط داشته باشد ایجاب می­کند که ضمن به­کارگیری دستاوردهای تحقیقاتی به عوامل دیگری از جمله بیماری­ها و خسارات ناشی از آن­ها پرداخته گردد.

از میان بیماری­های گوناگون مبتلا کننده ذرت که در مجموع تعداد آنها به 60 مورد می­رسد، یکی از مهمترین و زیان­بارترین آنها پوسیدگی فوزاریومی بلال ذرت (Fusarium ear rot) می­باشد که علاوه بر خسارت­های کمی و کیفی به محصول، با تولید مایکوتوکسین­های مختلف، سلامت انسان و دام را نیز به خطر می­اندازد (Bacon et al., 2004). تاکنون گونه­های مختلفی از فوزاریوم به عنوان عامل این بیماری معرفی شده­اند ولی گونه Fusarium verticillioides به عنوان یکی از مهمترین عوامل بیماری­زای بلال، ساقه، ریشه و گیاهچه شناخته شده استDrepper and Renfro. 1990) ). نشانه آلودگی در بلال، ابتدا به صورت لکه‌‌‌ها و مناطق تغییر رنگ یافته صورتی عنابی تا قرمز قهوه‌ای روی نوک دانه‌‌‌ها ظاهر‌ می‌شود. این لکه‌‌‌ها ممکن است به صورت پراکنده یا پیوسته روی دانه‌‌‌ها در قسمت نوک بلال به وجود بیایند. در صورت پیشرفت بیماری کپک پودر مانند یا پنبه‌ای صورتی رنگ روی دانه‌های آلوده رشد‌ می‌نمایند. عامل این بیماری می‌تواند یک متابولیت ثانویه از خانواده مایکوتوکسین به نام moniliform بسازد که یک ماده سرطان­زاست و با نقص لوله عصبی در انسان و بیماری شدید در دام ارتباط داده‌ می‌شود (Gelderblom et al., 1988).

مقاومت به بیماری در گیاهان با فعال شدن مجموعه وسیعی از پاسخ­های دفاعی همراه است که برای جلوگیری از آلودگی با بیمارگر استفاده می­شود. این مکانیسم­ها شامل موانع فیزیکی و شیمیایی است که از قبل در گیاه وجود دارد و واکنش­های دفاعی القایی است که در قالب بیان ژن­های مرتبط با دفاع در برابر بیمارگر فعال می­شوند. تعادل بین بیمارگر-میزبان، گیاه را وادار به ایجاد برخی تغییرات در متابولیسم سلول می­کند که عمدتاً شامل تغییر در فعالیت آنزیم­های سلول، از قبیل PAL[1]، POX[2] ،PPO[3] ،LOX[4] ،SOD[5]  و B-1,3 glucanase است (Fukasawa-Akada et al., 1996).

 بر اساس مطالعات PAL آنزیم اولیه در مسیر فنیل پروپانوئید است که با حذف آمونیاک منجر به تبدیل فنیل آلانین به اسید ترانس- سینامیک می­شود. PAL در فعالیت متابولیکی بسیاری از گیاهان نقش دارد و آنزیم کلیدی در سنتز چندین ترکیب ثانویه مرتبط با دفاع، مانند فنول­ها و لیگنین است (Hemm et al., 2004). قطع و برش و زخم­های حاصل از آن منجر به افزایش فعالیت PAL در بسیاری از بافت­های گیاه می­شود (Camm et al., 1977). بیشتر تحقیقات روی القاء PAL پس از آلودگی توسط قارچ، و یا قرار گرفتن در معرض پلی ساکاریدهای مشتق شده از آنها متمرکز شده است (Hahlbrock & Grisebach, 1979).

بسیاری از مطالعات نشان داده­ که فعالیت PAL در گیاهانی که با بیمارگر مواجه هستند افزایش می­یابد (Niranjanraj et al., 2006). PAL اولین و کلیدی­ترین آنزیم مسیر فنیل پروپانوئیدی است که منجر به بیوسنتز فیتوالکسین­ها، پیش­سازهای لیگنین و ترکیبات فنولی می­شود (Daayf et al., 1997). مطالعات زیادی نشان داده است که القاء PAL بعد از آلودگی بیمارگر منجر به واکنش­های دیگر، مانند چوب شدگی و تولید ترکیبات فنولی می­شود که به نوبه خود محافظت در برابر بیماری­ها را فراهم می­کند (Umesha, 2006).

عفونت ممکن است باعث فعال سازی مسیر­های سیگنالی شود که هماهنگ با آن باعث مقاومت در برابر بیمارگر در بافت­های دور از نقطه آلودگی شود (Lanubile et al., 2010). پروتئین­های PR[6] تا حدی جلوی رشد، تکثیر یا گسترش بیمارگر را می­گیرند. بیان ژن­های PR همچنین فعال سازی مقاومت اکتسابی عمومی در هر دو بافت آلوده و سالم را نشان ­می­دهد (Ward et al., 1991). PR-1 معمولاً به عنوان نشانگر برای افزایش مقاومت اعطاء شده و یا مقاومت اکتسابی عمومی گزارش شده است و به طور گسترده برای فعالیت­های ضد قارچی استفاده می­شود (Sekhon et al., 2006). ساختار یکی از اعضای خانواده PR-1 (PR1-b گوجه فرنگی) توسط رزونانس مغناطیسی هسته­ای شناخته شده و ساختار مولکولی منحصر به فرد را نشان داد.

پروتئین­های PR اولین بار در اجزای دانه مشاهده شدند. بسیاری از ژن­های PR بسته به سطح مقاومت ژنوتیپ­های ذرت در سطوح مختلفی بعد از آلودگی به Fusarium verticillioides بیان شدند (et al., 2010 Lanubile). تمام گیاهان از جمله گیاهان حساس، به حمله بیمارگر­ها پاسخ می­دهند که عمدتاً وابسته به تغییرات فعالیت ژن است. تفاوت در پاسخ ژنوتیپ­های حساس و مقاوم، ممکن است منعکس کننده تفاوت در سرعت، شدت، الگوی فضایی و محدوده بیان ژن­های مختلف، به خصوص ژن­های دفاعی، است. این تفاوت ممکن است باعث تفاوت پاسخ ارقام مختلف به بیمارگر خاص شود (Alexander et al., 1993). مشاهدات میکروسکوپی سلولی نشان می­دهد که حمله قارچ Fusarium verticillioides به سلول­های گیاه حساس، کمی زودتر از گیاه مقاوم رخ می­دهد (Yuan et al., 2013). همچنین عکس­های گرفته شده از منطقه آلوده نشان داد منطقه آلوده در گیاه مقاوم کوچکتر از گیاه حساس است. منطقه آلوده کوچکتر و تأخیر در حمله Fusarium verticillioides  در گیاه حساس ممکن است به پیشگیری حمله و پیشرفت بیماری کمک کند (Yuan et al., 2013).

تجمع سطوح بالای پروتئین­های دفاعی در سلول­هایی که برای اولین بار با بیمارگر تماس پیدا کرده­اند، یک مانع دفاعی در مقابل نفوذ قارچ ایجاد می­کند. میزبان و بیمارگر قارچی به احتمال زیاد ترکیبات فعال را به منظور حمله به یکدیگر تولید می­کنند. در همین راستا ضروری است که با مکانیسم­های ایجاد شده در گیاهان بعد از ورود پاتوژن آگاه شویم. با مطالعه و درک تفاوت­هایی که در بیان ژن­های دفاعی در گیاهان مقاوم نسبت به حساس وجود دارد، می­توان راهبردهایی را برای مقاومت بیشتر گیاهان حساس اتخاذ کرد. به همین منظور، در این تحقیق هدف بررسی روند تغییرات و تفاوت میزان بیان ژن PAL و PR-1 در پاسخ به آلودگی قارچ فوزاریوم در رقم مقاوم، نیمه­مقاوم و حساس ذرت است.

 

مواد و روش­ها

سه ژنوتیپ ذرت با فنوتیپ‌های متفاوت از نظر تحمل به پوسیدگی فوزاریومی بلال ذرت به نام‌های C7 (لاین مقاوم)، B73 (لاین نیمه­مقاوم) و MO17 (لاین حساس) مورد بررسی قرار گرفتند. آزمایشات مزرعه‌ای در ایستگاه تحقیقات کشاورزی عراقی محله گرگان انجام شد. این ایستگاه در فاصله 5 کیلومتری شمال شهر گرگان واقع شده است. خاک مزرعه از نوع لومی رسی، عمق خاک زراعی 30 تا 45 سانتی متر و اسیدیته آن بین 5.7 الی 8 می­باشد. از لحاظ آب و هوایی ایستگاه جزء مناطق گرم و معتدل به شمار می­رود و میزان بارندگی سالیانه آن 400 الی 450 میلی متر است. آزمایش در 3 تکرار و هر لاین در دو خط 5 متری به فاصله بوته 20 سانتی­متر در قالب طرح بلوک کامل تصادفی انجام شد.

 برای تهیه اسپور قارچ، Fusarium verticillioides بر روی صفحه‌های پتری دیش به قطر cm9 در محیط کشت آگار سیب زمینی دگستروز (PDA) در انکوباتور با دمای 25 درجه سانتی گراد و دوره نوری 12 ساعت به مدت 14 روز کشت داده شدند. کنیدیوم‌‌‌ها پس از شستشوی صفحات با آب مقطر، خراش دادن سطح آگار با اسکالپل و عبور دادن سوسپانسیون اسپور از پارچه استریل جمع آوری شدند. در نهایت، سوسپانسیون اسپور با اضافه کردن 200 میلی لیتر آب استریل تهیه شد.

برای ارزیابی ژنوتیپ­ها، بلال‌‌‌ها 15 روز پس از گرده افشانی دستی (به منظور داشتن بلال­های یکنواخت) با استفاده از روش مایه‌کوبی سرنگ، مایه­زنی شدند. مایه‌کوبی از یک سوم بالایی بلال برای آلوده سازی نمونه دانه و از نوک بلال برای آلوده سازی ابریشم با سوسپانسیون Fusarium verticillioides انجام شد و برای بالا بردن رطوبت و ایجاد شرایط بیماری با کیسه پلاستیکی تا 48 ساعت پوشیده شدند. بلال‌های دوم هر بوته نیز با دو روش آلوده سازی از طریق دانه و ابریشم به صورت جداگانه آلوده سازی و برای ارزیابی فنوتیپی تا زمان رسیدگی فیزیولوژیکی نگهداری شدند. در زمان رسیدگی فیزیولوژیکی، تعداد 10 بلال از هر ردیف برداشت شد و نسبت به یادداشت­برداری شاخص شدت بیماری (DS)[7] هر تیمار اقدام گردید. نمره­دهی شدت بیماری بر اساس مقیاس 1 تا 7 بر مبنای درصد آلودگی و پیشرفت بیماری در بلال از صفر تا 100% انجام شد (Reid & Zhu, 2005).

 بلال مایه‌کوبی نشده (T0) به عنوان شاهد انتخاب و از بلال‌های آلوده در زمان‌های (T1)12،(T2) 24،(T3) 48،(T4) 72 و(T5) 96 ساعت پس از مایه­زنی نمونه­برداری شد و برای هر زمان، ابریشم و دانه سه بلال با هم مخلوط شدند. برای جلوگیری از خطای ناشی از آسیب مکانیکی، نمونه­گیری از بذرهای مجاور قسمت مایه‌کوبی شده انجام شد (Lanubile et al., 2010). نمونه دانه با استفاده از اسکالپل استریل و نمونه ابریشم با قیچی استریل جدا و در نیتروژن مایع منجمد و در فریزر 80- درجه سانتی گراد نگهداری شد. نمونه‌های جمع آوری شده کوبیده و جهت استخراج RNA از بافر پی‌بایوزول (p-Biozol Buffer) بر اساس دستورالعمل شرکت (BioFlux, Japan) استفاده شد. برای تعیین کمیت RNA استخراج شده از دستگاه Nanophotometer مدل p300 محصول شرکت IPMLEN و جهت تعیین کیفیت، نمونه­های  RNA ابریشم و دانه، بر روی ژل آگارز یک درصد الکتروفورز شد.

cDNA تک­رشته­ای با استفاده از دستور شرکت Fermentase ساخته شد. آغازگرهای مورد نیاز بر اساس اطلاعات موجود در بانک اطلاعاتی NCBI و با استفاده از نرم افزار primer3 و با در نظر گرفتن خصوصیات مطلوب برای استفاده در روش qRT-PCR (واکنش زنجیره­ای پلی­مراز کمی) طراحی شد. در این تحقیق از ژن خانه­دار β-actin استفاده شد. در جدول 1 اطلاعات و توالی مربوط به ژن­های β-actin، PR-1 و PAL نشان داده شده است.



جدول1- توالی آغازگرهای مورد استفاده درPCR  qRT-.

Table 1- Sequence of primers used in qRT-PCR.

نام ژن

Gene Name

شماره دسترسی

Accession Number

نام آغازگر

Primer Name

توالی آغازگر (5´→3´)

Primer Sequence

دمای اتصال (درجه سانتیگراد)

Annealing Temperature (0c)

اندازه محصول(جفت باز)

Product Size(bp)

 

β-actin

AB022041

F

GCG TTA CCG GCT CAT TGT

59.68

173

 

 

 

R

GAG GCA ACA CGT TAC ACC AG

59.21

 

 

PR-1

M59196

F

CCG GCG TCT TCA TCA TCT

55.9

223

 

 

 

R

CAA ATC GCC TGC ATG GTT

55.4

 

 

PAL3

P45725

F

AGA ACG CCA AGG AGA AGA GG

58.4

166

 

 

 

R

GAA AGA GCA ACG CCA CAC A

58

 

 
                 

 

 

واکنش زنجیره­ای پلی­مراز کمی با استفاده از تکنولوژی رنگ SYBR Green Ι و کیت سایبر بیوپارس (شرکت زیست فرایند تولید پایدار، ایران) در دستگاه iQ5 (شرکت بیورد، آمریکا) انجام شد. شرایط بهینه برای اجرای واکنش Real-time PCR در حجم 20 میکرولیتر و از هر نمونه سه تکرار تکنیکی فراهم گردید. برای ارزیابی و محاسبه میزان بیان ژن دو روش کمی کردن نسبی وجود دارد که از روش Ct مقایسه­ای (Comparative CT (2 -DDCT)) استفاده شد (Souaze et al., 1996.). داده­های بدست آمده از دستگاه توسط نرم­افزار Rest مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفتند و نمودارهای مربوطه توسط نرم­افزار Excel رسم شدند.

 

نتایج و بحث

بر اساس روش پیشنهادی Tenuta  (2006) شدت آلودگی از طریق دانه و ابریشم به صورت جداگانه‌ اندازه‌گیری شد. در شکل 1 بلال­هایی که از طریق ابریشم آلوده شده­اند با خط قرمز مشخص شده­اند. نتایج نشان داد آلودگی از طریق ابریشم شدت آلودگی بیشتری را نسبت به آلودگی از طریق دانه ایجاد‌ کرد (شکل 1). بلال‌هایی که از طریق ابریشم آلوده شده بودند تعداد دانه کمتر و بلال‌های ضعیف­تری را تولید کرده بودند (شکل 1). همچنین مشاهده شد که لاینC7 با بروز کمترین شدت آلودگی به عنوان مقاوم­ترین و لاین MO17 با بیشترین شدت آلودگی به عنوان حساس­ترین لاین شناخته شد (شکل 1). تفاوت دیگری که در این دو لاین به صورت فنوتیپی مشاهده شد این بود که آلودگی در لاین مقاوم محدود به همان قسمت مایه­کوبی شده بود و کمتر به دانه‌های مجاور آلودگی پخش شد ولی در لاین حساس تعداد دانه در بلال آلوده شده، کمتر مشاهده شد و آلودگی در کل بلال گسترش پیدا کرده بود (شکل 1).

شکل 2 تفاوت شدت آلودگی را در بین لاین­های مورد بررسی و همچنین تفاوت شدت آلودگی با تزریق از طریق دانه و ابریشم را نشان‌ می‌دهد. همانطور که در این شکل مشاهده‌ می‌شود C7 در هر دو روش مایه­کوبی شدت آلودگی کمتری را نشان داده است. لاین B73 نیز به عنوان لاین نیمه­مقاوم شناخته شد. مایه­زنی از طریق ابریشم خسارت بیشتری را به بلال وارد کرد.

قبل از آلودگی (صفر ساعت) بیان ژن PAL در ابریشم لاین مقاوم حدود 8 برابر لاین حساس و 2 برابر لاین نیمه­مقاوم مشاهده شد (شکل 4 و 5). این نتایج نشان داد هر چه بیان ژن PAL در لاین­های ذرت قبل از مایه­زنی بیشتر باشد مقاومت آن لاین به بیماری قارچ فوزاریوم افزایش می­یابد.

این مقاومت بستگی زیادی به سطح بیان ژن دارد و هر چه بیان ژن قبل از آلودگی بیشتر باشد گیاه توانایی بیشتری برای مقابله با بیمارگر و تنظیم مکانیسم­های دفاعی دارد. سنتز و حضور ترکیبات فنولی در پاسخ به آلودگی بیمارگر، با مقاومت به بیماری همراه بوده است. تفاوت در مکانیسم­های دفاعی در ارقام مقاوم و حساس ممکن است به علت تفاوت در سطح فعالیت PAL مربوط باشد (El Modafar & El Boustani, 2001).

 در بافت ابریشم لاین مقاوم، حداکثر بیان ژن PAL در ساعات اولیه آلودگی (12 ساعت) بود و بعد از آن بیان تا 48 ساعت پس از آلودگی کاهش و دوباره در 96 ساعت بیان ژن افزایش یافت. در نمونه ابریشم لاین نیمه­مقاوم همانند لاین مقاوم حداکثر بیان در ساعات اولیه آلودگی مشاهده شد و بعد ازآن بیان کاهش و در 72 ساعت بیان مجدداً افزایش یافت. در بافت ابریشم لاین حساس، افزایش بیان کمی دیرتر از لاین مقاوم و نیمه­مقاوم، و در 24 ساعت بعد از آلودگی مشاهده شد. در نمونه ابریشم لاین حساس، نمودار به صورت باینومیال بود و در 24 و 72 ساعت بعد از آلودگی بیان ژن افزایش و بعد از آن در 48 و 96 ساعت بیان ژن کاهش یافت (شکل 3).

 

 

 

شکل1- مقایسه بلال­های آلوده شده به وسیله سوسپانسیون قارچ فوزاریوم در سه لاین مورد مطالعه  (A) لاین C7، (B)  لاین B73 و (C) لاین MO17).

Figure 1- Comparison of inoculated ears by Fusarium fungi suspension in the three studied lines, A) Line C7, B) Line B73, C) Line MO17. 

 

 

 

شکل 2- شدت آلودگی تزریق از طریق تارهای ابریشمی و دانه در لاین­‌های مورد مطالعه.

Figure 2- The severity of infestation by silk and grain in the studied lines.

 

 

 

 

نتیجه این است که نمودار مقاوم و نیمه­مقاوم در ساعات اولیه آلودگی بیان بالایی دارد و توانایی این را دارند که در ساعات اولیه آلودگی به بیماری پاسخ دهند ولی لاین حساس دیرتر حضور پاتوژن را تشخیص داده و در ساعات دیرتری بیان را افزایش می­دهد. نکته دیگر این است که لاین مقاوم و نیمه­مقاوم توانایی این را دارد که در ساعات پایان آلودگی بیان را دوباره افزایش دهد.

در دانه لاین مقاوم، بعد از آلودگی افزایش تدریجی در بیان ژن PAL مشاهده و حداکثر بیان ژن در 96 ساعت بعد از تزریق قارچ فوزاریوم دیده شد. ولی در دانه لاین نیمه­مقاوم بیشینه بیان در 24 ساعت بعد از آلودگی مشاهده شد ولی بعد از آن افت شدیدی نمود و در ساعات پایان آلودگی بیان مجدداً افزایش یافت. در دانه لاین حساس، همانند نمونه ابریشم نمودار به صورت باینومیال بود و اوج بیان در 48 ساعت بعد از آلودگی مشاهده شد. در ساعات دیگر بیان به پایین­تر از شاهد رسید (شکل 3). نتایج نمونه دانه، همانند نمونه ابریشم بود. هر دو لاین مقاوم و نیمه­مقاوم در ساعات اولیه و اواخر آلودگی بیان ژن را نشان دادند.

نکته قابل توجه در الگوی بیان ژن PAL در ارقام مقاوم و حساس در ساعات اولیه و اواخر آلودگی است. در نمونه ابریشم لاین مقاوم بیان ژن در 96 ساعت افزایش یافت در حالی­که در ارقام نیمه­مقاوم و حساس این افزایش بیان مشاهده نشد (شکل 3). حداکثر بیان ژن در نمونه دانه رقم مقاوم در 96 ساعت بعد از آلودگی مشاهده شد. این داده­ها با نتایج  El Modafar et al. (2001) مشابه بود. بر طبق گزارشEl Modafar et al. (2001) فعالیت ژن  PALدر رقم مقاوم در 96 ساعت به حداکثر فعالیت خود رسید. همچنین آنها اعلام کردند فعالیت ژن PAL در 96 ساعت، 7 برابر بیشتر از نمونه کنترل بود و در 120 ساعت، فعالیت ژن PAL به حدود 4 برابر نمونه کنترل رسید.

نمودار بیان ژن PAL در دو نمونه ابریشم و دانه لاین مقاوم تقریباً روند مشابهی را نشان داد. نقطه مشترک در نمونه ابریشم و دانه لاین مقاوم در 48 ساعت بعد از آلودگی بود که در هر دو نمونه بیان در این ساعت کاهش شدیدی را نشان داد و بعد از آن بیان در 72 ساعت و 96 ساعت افزایش یافت (شکل 3). ولی در ارقام حساس و نیمه­مقاوم وضعیت به صورت متفاوتی مشاهده شد. در این دو لاین در ساعاتی که دانه افزایش بیان ژن PAL را نشان داد، در نمونه ابریشم بیان در همان ساعت کاهش یافت و برعکس.


 

 

 

شکل 3- الگوی بیان ژن PAL در نمونه ابریشم (A) و نمونه دانه (B) لاین‌های مقاوم C7، نیمه­مقاوم B73 و حساس MO17 ذرت (محور عمودی: تغییر نسبی بیان ژن و محور افقی: زمان پس از آلودگی).

Figure 3- PAL gene expression pattern in grain (A)and silk samples (B) of resistant (C7), semi resistant (B73) and sensitive (MO17) corn lines. Bars: Relative changes of gene expression and Horizontal: Time after inoculation.

 

 

در نمونه دانه رقم حساس بیان ژن PAL تا 24 ساعت بعد از آلودگی روند نسبتاً پایداری را نشان داد و در 48 ساعت بیان به شدت افزایش یافت و در 72 ساعت افت شدید بیان رخ داد (شکل3). در پژوهشی El Modafar et al. (2001) گزارش کردند که فعالیت ژن PAL در رقم حساس در 24 ساعت اول کاهش یافت و به حداکثر فعالیت خود در 96 ساعت رسید، اما حدود 3 برابر کمتر از رقم مقاوم بود. فعالیت PAL در رقم حساس پس از 120 ساعت در حدود 2 برابر کمتر از رقم مقاوم بود  2001) El Modafar et al.,). با توجه به نمودار بیان ژن PAL در نمونه دانه رقم حساس، افزایش بیان ژن در 96 ساعت بود. این افزایش بیان در رقم مقاوم نیز مشاهده شد ولی بیان ژن در نمونه دانه رقم مقاوم حدود سه برابر بیشتر از نمونه دانه رقم حساس بود (شکل 4). تفاوت در میزان بیان ژن PAL در دو رقم مقاوم و حساس، می­تواند نشان دهنده تفاوت در سرعت و شدت واکنش­های دفاعی در دو رقم باشد (El Modafar & El Boustani, 2001). با مقایسه لاین مقاوم با حساس مشخص گردید که بیان ژن PAL در لاین مقاوم پایدارتر و بیشتر از لاین حساس است. ضمناً در زمان قبل از آلودگی (شاهد صفر ساعت) بیان ژن PAL در نمونه ابریشم لاین مقاوم 8 برابر لاین حساس مشاهده شد (شکل 4). بعد از آلودگی بیان ژن در هر دو لاین مقاوم و حساس بالا رفت به طوری که در 72 ساعت به کمترین تفاوت رسید ولی در 96 ساعت بیان در  لاین حساس کاهش یافت ولی در لاین مقاوم همچنان رو به افزایش بود (شکل 4). در دانه وضعیت متفاوتی دیده شد. بیان ژن PAL در دانه لاین حساس قبل از آلودگی حدود 3.5 برابر بیشتر از لاین مقاوم بود ولی بعد از آلودگی بیان به شدت در لاین مقاوم افزایش یافت و در 24 ساعت بعد از آلودگی به بیشتر از لاین حساس رسید. همچنین بیان ژن در ساعات پایان آلودگی (72 و 96 ساعت) در دانه لاین مقاوم بیشتر از لاین حساس مشاهده شد (شکل 4). بیشترین تفاوت در لاین مقاوم و حساس در ساعات اولیه و اواخر آلودگی مشاهده گردید.

 

 

 

شکل 4- مقایسه الگوی بیان ژن PAL در لاین مقاوم نسبت به حساس (محور عمودی: میزان بیان ژن در لاین C7 نسبت به MO17، محور افقی: زمان­های مورد مطالعه بعد از آلودگی).

Figure 4- Comparison of the PAL gene expression pattern in resistant to sensitive line. Bars: Amount of gene expression in line C7 compare to line MO17, Horizontal: Studied times after inoculation.

 

با مقایسه الگوی بیان ژن PAL در لاین مقاوم نسبت به نیمه­مقاوم مشخص گردید که بیان ژن در قبل از آلودگی در ابریشم لاین مقاوم حدود 2 برابر لاین نیمه­مقاوم بود. بعد از آلودگی بیان در لاین مقاوم با شدت بیشتری نسبت به لاین نیمه­مقاوم افزایش یافت به طوری که در 24 ساعت به بیشترین تفاوت رسید. در 48 ساعت لاین نیمه­مقاوم بیان را افزایش داد به طوری که در 48 ساعت به بالاتر از مقدار لاین مقاوم رسید. تفاوت اصلی لاین مقاوم و نیمه­مقاوم در ساعات پایان آلودگی مشاهده شد. در 96 ساعت بیان در نمونه ابریشم لاین نیمه­مقاوم به شدت افت پیدا کرد در حالی­که در لاین مقاوم بیان همچنان افزایش یافت (شکل 5).

در  نمونه دانه لاین مقاوم بیان ژن PAL در قبل از آلودگی کمتر از لاین نیمه­مقاوم بود. ولی بعد از آلودگی بیان در لاین مقاوم به سرعت بالا رفته و در 12 ساعت به حدود 2 برابر نسبت به لاین نیمه­مقاوم رسید. همانگونه که در ابریشم مشاهده شد تفاوت این دو لاین در ساعات پایان آلودگی است. لاین مقاوم در ساعات پایان آلودگی (96 ساعت) بیان ژن PAL را افزایش داد در حالی­که در لاین نیمه­مقاوم بیان ژن بعد از 48 ساعت افت پیدا کرد (شکل 5).

 

 

شکل 5- مقایسه الگوی بیان ژن PAL در لاین مقاوم نسبت به نیمه­مقاوم (محور عمودی: میزان بیان ژن در لاین C7 نسبت به B73، محور افقی: زمان­های مورد مطالعه بعد از آلودگی).

Figure 5- Comparison of the PAL gene expression pattern in resistant to semi resistant e line. Bars: Amount of gene expression in line C7 compare to line B73, Horizontal: Studied times after inoculation.

 

 

PAL آنزیم کلیدی در سنتز فیتوالکسین­ها، پیش­سازهای لیگنین و ترکیبات فنولی است (Ebel et al., 1984). فنول­ها محصولات متابولیکی در مسیر فنیل پروپانوئیدی است که در اثر پاسخ سلول­های گیاهی به استرس­های محیطی افزایش می­یابند. افزایش انباشت فنول­ها نشان­دهنده افزایش متابولیسم­های ثانویه در گیاه است . طبق گزارش et al.  Rai (2011) تجمع فنول­ها در گیاه گوجه فرنگی، در 5 روز بعد از آلودگی به حداکثر مقدار رسیده است. در گیاهان گوجه­فرنگی مایه­زنی شده با بیمارگر، انباشت در روز دوم آغاز شد و به طور چشم­گیری 4 روز بعد پس از مایه­زنی کاهش یافت. همچنین طبق گزارشات Lanubile et al. (2010) مقدار کل فنول در گیاه ذرت رقم مقاوم بیشتر از رقم حساس گزارش شد. با توجه به نتایج به­دست آمده، در رقم مقاوم حداکثر فعالیت ژن PAL در زمان­های 24 و 96 ساعت بعد از آلودگی است. یعنی در ساعاتی که بیان ژن PAL افزایش یافته، در همان زمان­ها تجمع فنول افزایش یافت. تجمع فنول­ها نشان می­دهد که القاء آنزیم­های دفاعی درگیر در مسیر فنیل پروپانوئیدی و پروتئین­های PR، ممکن است به محدود کردن حمله F. oxyporum کمک کند (et al., 2011  Rai).

بیان ژن PAL در چندین گیاه دیگر مورد مطالعه قرار گرفته است. بر اساس مطالعاتHahlbrock  & Grisebach   (1979) گزارش کردند در نخود پاسخ به حمله قارچ با فعال شدن متابولیسم فنیل پروپانوئید همراه است. فعالیت PAL در 2 روز پس از تلقیح اسپور قارچ، افزایش چشمگیری پیدا کرده است. همچنین اهمیت PAL در مقاومت به پوسیدگی سیب زمینی توسط تعدادی از متابولیت­های ثانویه مشتق شده از ترنس-سینامیک نشان داده شده است که در واکنش­های غیراختصاصی به حمله بیمارگر­ها، عوامل تنش­زا و واکنش به بهبود زخم درگیر هستندCorsini & Pavek . (1980). در مطالعه et al.  Vanitha (2009) تغییرات فعالیت PAL در تمام گیاهچه­های گوجه­فرنگی بعد از مایه­زنی در مقایسه با گیاهچه­های کنترل دارای تغییرات معنی­داری بود. در گیاهان مقاوم گوجه­فرنگی، فعالیت آنزیم PAL به تدریج افزایش یافت و در 12 ساعت پس از آلودگی به حداکثر مقدار خود رسید. بیشترین سطح آلودگی در گیاهان حساس و کمترین سطح آلودگی در گیاهان مقاوم مشاهده شد. در پژوهشی Chen et al. (2000) نشان دادند که سطح بالایی از ژن PAL در ریشه­های خیار تلقیح شده با بیمارگر ایجاد شده است. بر طبق گزارش Kavitha & Umesha   (2008) فعالیت ژن PAL در رقم مقاوم گوجه­فرنگی بیشتر از ارقام حساس و نیمه­مقاوم پس از تلقیح بیمارگر است. در ارقام مقاوم گوجه­فرنگی، فعالیت PAL بعد از تلقیح بیمارگر افزایش یافت در حالی که در رقم حساس، فعالیت ژن کاهش یافته است Umesha, 2006)). طبق مطالعه(2005) Geetha et al.  ژن PAL در سازگاری مقاومتی ارزن مرواریدی نیز دخیل است. همچنین افزایش زودرس ژن PAL در برنج بعد از آلودگی با بیمارگر Pyricularia oryzae Wang et al.  (2004) و در جو در پاسخ به بیمارگر­های قارچی Kervinen et al. (1998) مشخص شده است.

با توجه به نمودارهای بیان ژن PAL در رقم حساس و مقاوم به نظر می­رسد بیان ژن PAL در رقم مقاوم سریعتر و با شدت بیشتری از رقم حساس فعال می­شود (شکل 3 و 4). همچنین بیان ژن در رقم مقاوم پایدارتر از رقم حساس است. رقم حساس در هر دو نمونه ابریشم و دانه دارای نمودار باینومیال است. یعنی توانایی کمتری در تنظیم بیان ژن بعد از آلودگی دارد. بیان ژن PAL قبل و بعد از آلودگی به طور متوسط در نمونه ابریشم بیشتر از نمونه دانه مشاهده شد. در حالی­که بعد از آلودگی بیان ژن در نمونه دانه به سطح بالاتری از کنترل نسبت به نمونه ابریشم رسید. در نتیجه می­توان چنین برداشت کرد که هر چه سطح بیان ژن قبل از آلودگی بیشتر باشد بعد از آلودگی چون گیاه مقداری بیان ژن دارد به افزایش بیان ادامه می­دهد. ولی زمانی که گیاه بعد از آلودگی از سطح پایه بیان ژن را شروع می­کند به افزایش بیان بیشتری نیاز دارد تا بتواند با بیمارگر مقابله کند و مکانیسم­های دفاعی در برابر آلودگی را فعال کند. ولی هنگامی که گیاه دارای سطحی از بیان قبل از آلودگی باشد توانایی بیشتری دارد تا به حمله بیمارگر پاسخ دهد و به همین علت لزومی به افزایش یکباره سطح بیان ژن ندارد.

در مطالعه­ای  El Modafar et al. (2006) گزارش نمودند القاء مکانیسم­های دفاعی در هر دو رقم مقاوم و حساس خرما، به میزان بیان ژن مربوط نیست بلکه به سرکوب بیان ژن در رقم حساس مربوط است. تولید سرکوب کننده­های زود هنگام توسط بیمارگر، به ویژه اسپورهای تازه جوانه زده، می­تواند گیاهان را به تهاجم بیمارگر قبل از نفوذ مستعد کند. طبق گزارش El Modafar et al.  (2006) بیان ژن PAL در رقم حساس توسط F.oxysporum سرکوب می­شود، در حالی که در رقم مقاوم، سرکوب بیان ژن وجود ندارد و یا به طور قابل ملاحظه­ای کم است. به نظر می­رسد سرکوب PAL یکی از عوامل اصلی تعیین کننده حساسیت گیاه به بیمارگر را تشکیل می­دهد. سرکوب کننده­ها معمولا قندهای محلول Lu & Higgings (1993) گلیکوپروتئین­ها Shiraishi et al. (2001) یا ترکیبات پروتئینی Yamada (1994) هستند که توسط بیمارگرهای قارچی تولید می­شوند. در دیگر تداخل­های انگل-میزبان، سموم می­توانند بیان مکانیسم­های دفاعی میزبان را سرکوب کنند Vurro & Ellis, 1997)). سرکوب تحریک PAL در زمان تعامل بیمارگر-گیاه عامل تعیین کننده رفتار میزبان (حساسیت یا مقاومت) است (Yamada et al., 1996).

حداکثر بیان ژن PR-1 در نمونه ابریشم لاین مقاوم در ساعات اولیه بعد از آلودگی نسبت به شاهد مشاهده شد. بعد از مایه­زنی بیان ژن به تدریج کاهش یافت و در ساعات پایان آلودگی (96 ساعت( به کمترین مقدار و پایین­تر از زمان قبل آلودگی رسید (شکل 6). در نمونه دانه لاین مقاوم شاهد کاهش شدید بیان در 24 ساعت بعد از آلودگی بودیم. بعد از کاهش در یک روز بعد از آلودگی، بیان در 48 ساعت افزایش یافت و در 72 ساعت به حداکثر مقدار بیان ژن نسبت به شاهد رسید (شکل 6).

در نمونه ابریشم و دانه لاین مقاوم، بیان ژن در 24 ساعت بعد از آلودگی کاهش یافت که کاهش بیان در نمونه ابریشم شدیدتر بود. بعد از کاهش بیان ژن در 24 ساعت، در نمونه ابریشم لاین نیمه­مقاوم بیان تا 72 ساعت بعد از آلودگی افزایش یافت (شکل 6). در نمونه ابریشم لاین حساس، بیان ژن PR-1 به صورت نمودار باینومیال مشاهده شد. اوج بیان در ابریشم لاین حساس در 24 و 72 ساعت بعد از آلودگی مشاهده شد و بعد از آن بیان ژن کاهش یافت. در نمونه دانه لاین حساس، اوج شدید بیان ژن PR-1 در 24 ساعت بعد از آلودگی مشاهده شد و بعد از آن بیان کاهش یافت ولی در ساعات پایانی آلودگی بیان دوباره افزایش یافت (شکل 6).

نمونه دانه وضعیت متفاوت بود. در نمونه دانه در ساعات اولیه و قبل از آلودگی بیان در لاین مقاوم نسبت به نیمه­مقاوم و حساس بالاتر بود ولی به اندازه نمونه ابریشم نبود. بعد از آلودگی بیان به تدریج افزایش یافت و در ساعات پایان آلودگی شاهد اوج بیان ژن PR-1 در نمونه دانه بودیم. شاید این امر به دلیل بافت حساس­تر ابریشم نسبت به دانه ذرت بود. اولین اندامی از بلال ذرت که در معرض آلودگی قرار می­گیرد ابریشم است.

با مقایسه بیان ژن PR-1 در دو نمونه دانه و ابریشم ذرت مشخص شد بیان ژن PR-1 در نمونه ابریشم و دانه لاین مقاوم از نمونه دانه و ابریشم لاین حساس و نیمه­مقاوم در قبل از آلودگی بالاتر است. ولی تفاوت بیان ژن PR-1 در دانه لاین مقاوم نسبت به لاین نیمه­مقاوم و حساس بسیار کمتر از نمونه ابریشم است. ولی تفاوتی که در بیان ژن PR-1 در مقایسه نمونه دانه و ابریشم سه لاین مشاهده شد این بود که در ساعات اولیه و قبل از آلودگی بیان در بافت ابریشم به شدت افزایش می­یابد ولی در اواخر آلودگی بیان ژن کاهش می­یابد. در مورد ابریشم بدیهی است زودتر از دانه آلوده شده و بیان ژن­های دفاعی در آن  فعال شود. ولی دانه به دلیل اینکه در اکثر مواقع از طریق ابریشم ذرت آلودگی به آن انتقال داده می­شود دیرتر ژن­های دفاعی آن فعال شده و به همین دلیل تا ساعات پایان آلودگی بیان ژن همچنان ادامه پیدا می­کند. بیان ژن PR-1 قبل از آلودگی در ابریشم و لاین مقاوم به ترتیب 32 و 11 برابر لاین حساس بود. بعد از آلودگی، در نقطه زمانی 12 ساعت، بیان در نمونه ابریشم لاین مقاوم به شدت افزایش یافت و به حدود 131 برابر لاین حساس رسید (شکل 7).


 

 

 

 

شکل 6- الگوی بیان ژن PR-1 در نمونه ابریشم (A) و نمونه دانه (B) لاین‌های مقاوم C7، نیمه­مقاوم B73 و حساس MO17 ذرت (محور عمودی: تغییر نسبی بیان ژن و محور افقی: زمان پس از آلودگی).

Figure 6- PR-1 gene expression pattern in grain (A) and silk samples (B) of resistant (C7), semi resistant (B73) and sensitive (MO17) corn lines. Bars: Relative changes of gene expression and Horizontal: Time after inoculation.

 

 

در 24 ساعت بعد از آلودگی بیان ژن در نمونه دانه لاین حساس به یکباره افزایش یافت و به حدود 76 برابر لاین مقاوم رسید. بیشترین تفاوت نسبت بیان ژن PR-1 در لاین مقاوم و حساس در 12 ساعت (در نمونه ابریشم) و 72 ساعت (در نمونه دانه) مشاهده شد (شکل 7). در کل در نمونه ابریشم لاین مقاوم نسبت به لاین حساس بیان ژن به تدریج تا ساعت پایان آلودگی کاهش یافت ولی در نمونه دانه لاین مقاوم بیان ژن تا ساعات پایان آلودگی نسبت به لاین حساس افزایش داشت.


 

 

 

شکل 7- مقایسه الگوی بیان ژن PR-1 در لاین مقاوم نسبت به حساس (محور عمودی: میزان بیان ژن در لاین C7 نسبت به MO17، محور افقی: زمان­های مورد مطالعه بعد از آلودگی).

Figure 7- Comparison of the PR-1 gene expression pattern in resistant to sensitive line. Bars: Amount of gene expression in line C7 compare to line MO17, Horizontal: Studied times after inoculation.

 

 

با مقایسه نسبت بیان در نمونه ابریشم لاین مقاوم و نیمه­مقاوم مشاهده شد بیان ژن PR-1 در لاین مقاوم حدود 176 برابر لاین نیمه­مقاوم بود. این در حالی است که بیان ژن در دانه لاین مقاوم حدود سه برابر نمونه دانه لاین نیمه­مقاوم مشاهده شد. بعد از مایه­زنی، بیان ژن در نمونه ابریشم لاین مقاوم نسبت به نیمه­مقاوم افزایش یافت و در 24 ساعت به حدود 494 برابر لاین نیمه­مقاوم رسید. بعد از آن بیان ژن PR-1 در لاین مقاوم نسبت به نیمه­مقاوم به تدریج تا ساعات پایان آلودگی کاهش یافت ولی در 96 ساعت بیان دوباره در لاین مقاوم رو به افزایش گذاشت (شکل 8). در نمونه دانه لاین مقاوم و نیمه­مقاوم تقریبا وضعیت متفاوتی مشاهده شد. در نمونه دانه لاین مقاوم، بیان ژن PR-1 قبل از آلودگی بالاتر از لاین نیمه­مقاوم است ولی بعد از مایه­زنی بیان ژن در لاین نیمه­مقاوم افزایش یافت و به بالاتر از لاین مقاوم رسید. این وضعیت تا 48 ساعت بعد از آلودگی مشاهده شد ولی در72 ساعت بیان ژن در لاین مقاوم به شدت افزایش یافت و به 377 برابر لاین نیمه­مقاوم رسید (شکل 8). بر اساس مطالعات Lanubile et al. (2013)  واکنش ژنوتیپ حساس ذرت به بیمارگر در مراحل اولیه پس از تلقیح است.

 

 

شکل 8- مقایسه الگوی بیان ژن PR-1 در لاین مقاوم نسبت به نیمه­مقاوم (محور عمودی: میزان بیان ژن در لاین C7 نسبت به B73، محور افقی: زمان­های مورد مطالعه بعد از آلودگی).

Figure 8- Comparison of the PR-1 gene expression pattern in resistant to semi resistant line. Bars: Amount of gene expression in line C7 compare to line B73, Horizontal: Studied times after inoculation.

 

 

لاین حساس نسبت به لاین مقاوم به آلودگی زودتر پاسخ داد ولی از طرفی لاین مقاوم قبل از ایجاد آلودگی دارای سطح بالایی از ژن­های دفاعی است و همین بالا بودن بیان ژن PR-1 شاید دلیلی بر مقاومت لاین مقاوم در برابر حمله قارچ فوزاریوم باشد و دیرتر از لاین حساس آلوده می­شود. ولی لاین حساس به دلیل نداشتن بیان ژن­های دفاعی قبل از آلودگی، با حمله قارچ، آلودگی خیلی زود گسترش پیدا می­کند و به همین دلیل سیستم دفاعی گیاه حساس بیان را از سطح پایه آغاز می­کند و بیان به یکباره بالا رفته به­طوری که در 24 ساعت نمونه دانه به حدود 53 (در نمونه ابریشم) و 36 برابر (در نمونه دانه) شاهد رسید. لاین مقاوم به دلیل داشتن سطح پایه ژن PR-1 قبل از مایه­زنی، با ایجاد آلودگی احتمالاً دیگر نیازی به افزایش بیان ژن PR-1 نداشته است. با این حال در مقایسه لاین مقاوم و حساس همچنان بیان ژن PR-1 در لاین مقاوم در بیشتر ساعات بالاتر از لاین حساس است.

در نمونه ابریشم و دانه لاین حساس در 48 ساعت بعد از آلودگی شاهد کاهش شدید بیان هستیم. در حالی که در مورد دو لاین مقاوم و نیمه­مقاوم در 48 ساعت کاهش بیان مشاهده نشد. در پژوهشی Lanubile et al. (2010)  گزارش کردند در 48 ساعت پس از آلودگی بیمارگر، حالت نکروتروفیک رخ می­دهد و میزبان آلودگی را شناسایی کرده و با انواع استراتژی­های دفاعی بر علیه آن مبارزه می­کند. در این نقطه زمانی تعداد کل رونوشت­ برای ژن­های دفاعی میزبان ثابت بود.

 

نتیجه گیری

سطح بالایی از تنوع در بیان ژن­­های PAL و PR-1 در نمونه دانه و ابریشم ذرت آلوده در پاسخ به آلودگی Fusarium verticillioides مشاهده شد. همه ژنوتیپ­ها قادر به بیان ژن­های دفاعی بعد از آلودگی به قارچ فوزاریوم هستند و تنها تفاوت آن­ها در سطح بیان ژن­ها است. تغییرات عمده در بیان ژن­های دفاعی در لاین مقاوم و حساس قبل از آلودگی اتفاق افتاد. لاین مقاوم قبل از ایجاد آلودگی دارای سطح بالایی از بیان ژن­های PAL و PR-1 است و شاید همین به­عنوان مانع اولیه در برابر حمله بیمارگر عمل کند ولی لاین حساس از سطح پایه بعد از آلودگی شروع به بیان ژن PAL و PR-1 می­کند. بیان ژن­های دفاعی در رقم مقاوم پایدارتر و بیشتر از رقم نیمه­مقاوم و حساس است.


منابع

Alexander D, Goodman RM, Gut-Rella M, Glascock C, Weymann K, Friedrich L, Maddox D, Ahl-Goy P, Luntz T, Ward E, Ryals J (1993). Increased tolerance to two oomycete pathogens in transgenic tobacco expressing pathogenesis-related protein1a. Proceedings of the National Academy of Sciences 90: 7327-7331.

Bacon CW, Hinton DM, Porter JK, Glenn AE, Kuldau G (2004) Fusaric acid, a Fusarium verticillioides metabolite, antagonistic to the endophytic biocontrol bacterium Bacillus mojavensis. Canadian Journal of Botany 82: 878-885.

Camm EL, Towers GHN (1977). Phenylalanine ammonia lyase. Progress in Phytochemistry 4: 169-188.

Chen C, Belanger RR, Benhamou N, Paulitz T (2000). Defense enzymes induced in cucumber roots by treatment with plant growth promoting rhizobacteria (PGPR) and Pythium aphanidermantum. Physiological and Molecular Plant Pathology 56: 13-23.

Corsini DL, Pavek JJ (1980). Phenylalanine ammonia lyase activity and fungi toxic metabolites produced by potato cultivars in response to Fusarium tuber rot. Physiological Plant Pathology 16: 63-72.

Daayf F, Bel-Rhild R, Belanger RR (1997). Methyl ester of P-coumaric acid: a Phytoalexin-like compound from long English cucumber leaves. Journal Chemical Ecology 23: 1517-1526.

Drepper, WJ, Renfro BL (1990) Comparison of methods for inoculation of ears and stalks of maize with Fusarium moniliforme. Plant Disease 74: 952-956.

Ebel J, Schmidt WE, Loyal R (1984). Phytoalexin synthesis in soybean cells: elicitor induction of phenylalanine ammonia-lyase and chalchone synthesis mRNAs and correlation with phytoalexin accumulation. Archives Biochemistry Biophysics 232: 240-248.

El Modafar C, El Boustani E (2001). Cell wall-bound phenolic acid and lignin contents in date palm as related to its resistance to Fusarium oxysporum. Biologia Plantarum 44: 125-130.

El Modafar C, El Boustani E (2005). The role of phenolics in plant defense mechanisms. Biopesticides of Plant Origin 157-172.

El Modafar C, Tantaoui A, El Boustani E (2001). Differential induction of phenylalanine ammonia-lyase activity in date palm roots in response to inoculation with Fusarium oxysporum f. sp. albedinis and to elicitation with fungal wall elicitor. Journal of Plant Physiology 158: 715-722.

El Modafar C, El Boustani E, Rahioui B, El Meziane A, El Alaoui-talibi Z (2006). Suppression of phenylalanine ammonia-lyase activity elicited in date palm by Fusarium oxysporum f. sp. albedinis hyphal wall elicitor. Biologia Plantarum 50 (4): 697-700.

Fernández C, Szyperski T, Bruyère T, Ramage P, Mösinger E, Wütrich K (1997). NMR solution structure of the pathogenesis-related protein p14a. Journal of Molecular Biology 266: 576-593.

Fukasawa-Akada T, Kung S, Watson JA (1996). Phenyalanine ammonia lyase gene structure, expression, and evolution in Nicotiana. Plant Molecular Biology 30: 711-722.

Geetha NP, Amruthesh KN, Sharathchandra RG, Shetty HS (2005). Resistance to downy mildew in pearl millet is associated with increased phenylalanine ammonia lyase activity. Functional Plant Biology 32: 267-275.

Gelderblom W, Jaskiewicz K, Marasas WF, Thiel PG, Horak RM, Vleggaar R, Kriek NP (1988) Fumonisins--novel mycotoxins with cancer-promoting activity produced by Fusarium moniliforme. Applied and environmental microbiology 54: 1806-1811.

Hahlbrock K, Grisebach H (1979). Enzymic controls in the biosynthesis of lignin and flavonoids. Annual Review of Plant Physiology 30: 105-130.

Hemm MR, Rider SD, Ogas J, Murry DJ, Chapple C (2004). Light induces phenylpropanoid metabolism in Arabidopsis roots. The Plant Journal 38: 765-778.

Kavitha R, Umesha S (2008). Regulation of defense-related enzymes associated with bacterial spot resistance in tomato. Phytoparasitica 36: 144-159.

Kervinen BT, Peltonen S, Teeri TH, Karjalainen R (1998). Differential expression of phenylalanine ammonia-lyase genes in barley induced by fungal infection or elicitors. New Phytologist Journal 139: 293-300.

Lanubile A, Logrieco A, Battilani P, Proctor RH, Marocco A (2013). Transcriptional changes in developing maize kernels in response to fumonisin-producing and nonproducing strains of Fusarium verticillioides. Plant Science 210: 183-192.

Lanubile A, Pasini L, Marocco A (2010). Differential gene expression in kernels and silks of maize lines with contrasting levels of ear rot resistance after Fusarium verticillioides infection. Journal of Plant Physiology 167: 1398-1406.

Lu H, Higgings VJ (1993). Partial characterization of a nonproteinaceous suppressor of non-specific elicitors from Cladosporium fulvum (syn. Fulvia fulva). Plant Pathology 42: 427-439.

Munkvold GP (2003). Epidemiology of Fusarium diseases and their mycotoxins in maize ears. European Journal of Plant Pathology 109: 705-13.

Niranjanraj S, Sarosh BR, Shetty HS (2006). Induction and accumulation of polyphenol oxidase activities as implicated in development of resistance against pearl millet downy mildew disease. Functional Plant Biology 33: 563-571.

Rai GK, Kumar R, Singh J, Rai PK, Rai SK (2011). Peroxidase, polyphenol oxidase activity, protein profile and phenolic content in tomato cultivars tolerant and susceptible to Fusarium oxsyporum f.sp.lycopersici. Pakistan Journal of Botany 43: 2987-2990.

Reid LM, Zhu X (2005). Screening corn for resistance to common diseases in Canada. Agriculture and Agri-Food Canada.

Repka V, Fischerová I, Šilharová K (2004). Methyl jasmonate is a potent elicitor of multiple defense responses in grapevine leaves and cell-suspension cultures. Biologia Plantarum 48: 273-283.

Sekhon RS, Kuldau G, Mansfield M, Chopra S (2006). Characterization of Fusarium-induced expression of flavonoids and PR genes in maize. Physiological and Molecular Plant Pathology 69: 109-117.

Shiraishi T, Toyoda K, Yamada T, Ichinose Y, Kiba A, Sugimoto M (2001). Suppressors of defense-suppressions and plant receptor molecules. Delivery and Perception of Pathogen Signals in Plants 21: 112-121.

Souaze F, Ntodou-Thome A, Tran CY, Rostene W, Forgez P (1996). Quantitative RT-PCR: limits and accuracy. Biotechniques 21: 280-285.

Umesha S (2006). Phenylalanine ammonia lyase activity in tomato seedlings and its relationship to bacterial canker disease resistance. Phytoparasitica 34: 68-71.

Vanitha SC, Niranjana SR, Umesha S (2009). Role of Phenylalanine Ammonia Lyase and Polyphenol Oxidase in host resistance to Bacterial wilt of Tomato. Journal of Phytopathology 157: 552-557.

Vurro M, Ellis BE (1997). Effects of fungal toxins on induction of phenylalanine ammonia-lyase activity in elicited cultures of hybrid popular. Plant Science 126: 29-38.

Wang L, An C, Qian W, Liu J, Chen Z (2004). Detection of the putative cis-region involved in the induction by Pyricularia oryzae elicitor of the promoter of a gene encoding phenylalanine ammonia-lyase in rice. Plant Cell Reports 22: 513-518.

Ward ER, Uknes SJ, Williams SC, Dincher SS, Wiederhold DL, Alexander DC (1991). Coordinate gene activity in response to reagents that induce systemic acquired resistance. Plant Cell 3: 1085-94.

Yamada T, Shiraishi T, Ichinose Y, Kato H, Seki H, Murakami Y (1996). Regulation of genes for phenylpropanoid synthesis in pea by elicitor and suppressor. Molecular Aspects of Pathogenecity and Resistance 43: 151-162.

Yamada T, Sriprasertsak P, Kato H, Hashimoto T, Shimizu H, Shiraishi T (1994). Functional analysis of promoters of phenylalanine ammonia-lyase genes in pea. Plant and Cell Physiology 35: 917-926.

Yuan G, Zhang Z, Xiang K, Shen Y, Du J, Lin H, Liu L, Zhao M, Pan G (2013). Different gene expressions of resistant and susceptible maize inbreds in response to Fusarium verticillioides Infection. Plant Molecular Biology Report 31: 925-935.

 

 

 

 

 

 

 

 


The accumulation of PAL and PR-1 gene transcription before exposure to corn ear rot infection is an effective factor in resistance to Fusarium fungus

 

Mosavat S.A. 1, Mazahery-Laghab H.*2, Soltanloo H. 3

 

1 Graduated PhD, Bu-Ali Sina University, Research Instructor of Agronomy & Horticulture Research Department, Golestan Agricultural and Natural Resources Research and Education Center, Agricultural Research, Education and Extension Organization (AREEO), Gorgan-Iran.

2 Associate Professor, Department of Agronomy and Plant Breeding, Faculty of Agriculture, Bu-Ali Sina University, Hamedan, Iran.

3 Associate Professor, Department of Plant Breeding & Biotechnology, Plant Production College, Gorgan University of Agricultural Sciences and Natural Resources, Gorgan, Iran.

 

Abstract

Fusarium ear rot with Fusarium verticillioides is one of the most important corn diseases around the world. Plants respond to pathogens attack by activating complex defense strategies. Defense response to pathogen infection includes changes in the expression of a large number of plant genes which may be a gene expression increase or decrease. Three lines with different resistance levels to fusarium fungus (C7, B73, MO17) cultivated based on RCBD design. After silking manual pollination was carried out and 15 days after that inoculation with fusarium funus was done by syringe (for seed inoculation) or needle (for silk inoculation). Then, silk and corn grain were sampled at 12, 24, 48, 72 and 96 hours after contamination. Non inoculated ear was used as control. After RNA extraction and cDNA production, synthesis the Real-Time PCR technique, the relative expression pattern of PAL, PR-1 genes were measured and data were analyzed using REST software. All genotypes are able to express PAL and PR-1 genes after infection with Fusarium fungus and their only difference is in the level of gene expression. Major changes in the expression of defense genes in the resistant and susceptible lines occur before infection. Resistant line have a high level of expression of PAL and PR-1 genes before contamination and that may be the primary barrier against a pathogen attack, but susceptible line to resistant line, after infection, the expression of PAL, PR-1 genes begins.

 

Keywords: Corn, Fusarium funus, Gene expression, PAL, PR-1.

 

 


* نویسنده مسئول: حجت الله مظاهری لقب                      تلفن:09183122167                  hojat.mazahery@yahoo.co.uk :Email 

[1] Phenylalanine ammonia lyase

[2] Peroxidase

[3] Poly phenol oxidase

[4] Lipoxygenase

[5] Superoxide dismutase

[6] Pathogenesis-Related Protein

[7] Disease Severity

* Corresponding Author: Mazahery-Laghab H.        Tel:09183122167     Email: hojat.mazahery@yahoo.co.uk : 

مراجع

Alexander D, Goodman RM, Gut-Rella M, Glascock C, Weymann K, Friedrich L, Maddox D, Ahl-Goy P, Luntz T, Ward E, Ryals J (1993). Increased tolerance to two oomycete pathogens in transgenic tobacco expressing pathogenesis-related protein1a. Proceedings of the National Academy of Sciences 90: 7327-7331.
Bacon CW, Hinton DM, Porter JK, Glenn AE, Kuldau G (2004) Fusaric acid, a Fusarium verticillioides metabolite, antagonistic to the endophytic biocontrol bacterium Bacillus mojavensis. Canadian Journal of Botany 82: 878-885.
Camm EL, Towers GHN (1977). Phenylalanine ammonia lyase. Progress in Phytochemistry 4: 169-188.
Chen C, Belanger RR, Benhamou N, Paulitz T (2000). Defense enzymes induced in cucumber roots by treatment with plant growth promoting rhizobacteria (PGPR) and Pythium aphanidermantum. Physiological and Molecular Plant Pathology 56: 13-23.
Corsini DL, Pavek JJ (1980). Phenylalanine ammonia lyase activity and fungi toxic metabolites produced by potato cultivars in response to Fusarium tuber rot. Physiological Plant Pathology 16: 63-72.
Daayf F, Bel-Rhild R, Belanger RR (1997). Methyl ester of P-coumaric acid: a Phytoalexin-like compound from long English cucumber leaves. Journal Chemical Ecology 23: 1517-1526.
Drepper, WJ, Renfro BL (1990) Comparison of methods for inoculation of ears and stalks of maize with Fusarium moniliforme. Plant Disease 74: 952-956.
Ebel J, Schmidt WE, Loyal R (1984). Phytoalexin synthesis in soybean cells: elicitor induction of phenylalanine ammonia-lyase and chalchone synthesis mRNAs and correlation with phytoalexin accumulation. Archives Biochemistry Biophysics 232: 240-248.
El Modafar C, El Boustani E (2001). Cell wall-bound phenolic acid and lignin contents in date palm as related to its resistance to Fusarium oxysporum. Biologia Plantarum 44: 125-130.
El Modafar C, El Boustani E (2005). The role of phenolics in plant defense mechanisms. Biopesticides of Plant Origin 157-172.
El Modafar C, Tantaoui A, El Boustani E (2001). Differential induction of phenylalanine ammonia-lyase activity in date palm roots in response to inoculation with Fusarium oxysporum f. sp. albedinis and to elicitation with fungal wall elicitor. Journal of Plant Physiology 158: 715-722.
El Modafar C, El Boustani E, Rahioui B, El Meziane A, El Alaoui-talibi Z (2006). Suppression of phenylalanine ammonia-lyase activity elicited in date palm by Fusarium oxysporum f. sp. albedinis hyphal wall elicitor. Biologia Plantarum 50 (4): 697-700.
Fernández C, Szyperski T, Bruyère T, Ramage P, Mösinger E, Wütrich K (1997). NMR solution structure of the pathogenesis-related protein p14a. Journal of Molecular Biology 266: 576-593.
Fukasawa-Akada T, Kung S, Watson JA (1996). Phenyalanine ammonia lyase gene structure, expression, and evolution in Nicotiana. Plant Molecular Biology 30: 711-722.
Geetha NP, Amruthesh KN, Sharathchandra RG, Shetty HS (2005). Resistance to downy mildew in pearl millet is associated with increased phenylalanine ammonia lyase activity. Functional Plant Biology 32: 267-275.
Gelderblom W, Jaskiewicz K, Marasas WF, Thiel PG, Horak RM, Vleggaar R, Kriek NP (1988) Fumonisins--novel mycotoxins with cancer-promoting activity produced by Fusarium moniliforme. Applied and environmental microbiology 54: 1806-1811.
Hahlbrock K, Grisebach H (1979). Enzymic controls in the biosynthesis of lignin and flavonoids. Annual Review of Plant Physiology 30: 105-130.
Hemm MR, Rider SD, Ogas J, Murry DJ, Chapple C (2004). Light induces phenylpropanoid metabolism in Arabidopsis roots. The Plant Journal 38: 765-778.
Kavitha R, Umesha S (2008). Regulation of defense-related enzymes associated with bacterial spot resistance in tomato. Phytoparasitica 36: 144-159.
Kervinen BT, Peltonen S, Teeri TH, Karjalainen R (1998). Differential expression of phenylalanine ammonia-lyase genes in barley induced by fungal infection or elicitors. New Phytologist Journal 139: 293-300.
Lanubile A, Logrieco A, Battilani P, Proctor RH, Marocco A (2013). Transcriptional changes in developing maize kernels in response to fumonisin-producing and nonproducing strains of Fusarium verticillioides. Plant Science 210: 183-192.
Lanubile A, Pasini L, Marocco A (2010). Differential gene expression in kernels and silks of maize lines with contrasting levels of ear rot resistance after Fusarium verticillioides infection. Journal of Plant Physiology 167: 1398-1406.
Lu H, Higgings VJ (1993). Partial characterization of a nonproteinaceous suppressor of non-specific elicitors from Cladosporium fulvum (syn. Fulvia fulva). Plant Pathology 42: 427-439.
Munkvold GP (2003). Epidemiology of Fusarium diseases and their mycotoxins in maize ears. European Journal of Plant Pathology 109: 705-13.
Niranjanraj S, Sarosh BR, Shetty HS (2006). Induction and accumulation of polyphenol oxidase activities as implicated in development of resistance against pearl millet downy mildew disease. Functional Plant Biology 33: 563-571.
Rai GK, Kumar R, Singh J, Rai PK, Rai SK (2011). Peroxidase, polyphenol oxidase activity, protein profile and phenolic content in tomato cultivars tolerant and susceptible to Fusarium oxsyporum f.sp.lycopersici. Pakistan Journal of Botany 43: 2987-2990.
Reid LM, Zhu X (2005). Screening corn for resistance to common diseases in Canada. Agriculture and Agri-Food Canada.
Repka V, Fischerová I, Šilharová K (2004). Methyl jasmonate is a potent elicitor of multiple defense responses in grapevine leaves and cell-suspension cultures. Biologia Plantarum 48: 273-283.
Sekhon RS, Kuldau G, Mansfield M, Chopra S (2006). Characterization of Fusarium-induced expression of flavonoids and PR genes in maize. Physiological and Molecular Plant Pathology 69: 109-117.
Shiraishi T, Toyoda K, Yamada T, Ichinose Y, Kiba A, Sugimoto M (2001). Suppressors of defense-suppressions and plant receptor molecules. Delivery and Perception of Pathogen Signals in Plants 21: 112-121.
Souaze F, Ntodou-Thome A, Tran CY, Rostene W, Forgez P (1996). Quantitative RT-PCR: limits and accuracy. Biotechniques 21: 280-285.
Umesha S (2006). Phenylalanine ammonia lyase activity in tomato seedlings and its relationship to bacterial canker disease resistance. Phytoparasitica 34: 68-71.
Vanitha SC, Niranjana SR, Umesha S (2009). Role of Phenylalanine Ammonia Lyase and Polyphenol Oxidase in host resistance to Bacterial wilt of Tomato. Journal of Phytopathology 157: 552-557.
Vurro M, Ellis BE (1997). Effects of fungal toxins on induction of phenylalanine ammonia-lyase activity in elicited cultures of hybrid popular. Plant Science 126: 29-38.
Wang L, An C, Qian W, Liu J, Chen Z (2004). Detection of the putative cis-region involved in the induction by Pyricularia oryzae elicitor of the promoter of a gene encoding phenylalanine ammonia-lyase in rice. Plant Cell Reports 22: 513-518.
Ward ER, Uknes SJ, Williams SC, Dincher SS, Wiederhold DL, Alexander DC (1991). Coordinate gene activity in response to reagents that induce systemic acquired resistance. Plant Cell 3: 1085-94.
Yamada T, Shiraishi T, Ichinose Y, Kato H, Seki H, Murakami Y (1996). Regulation of genes for phenylpropanoid synthesis in pea by elicitor and suppressor. Molecular Aspects of Pathogenecity and Resistance 43: 151-162.
Yamada T, Sriprasertsak P, Kato H, Hashimoto T, Shimizu H, Shiraishi T (1994). Functional analysis of promoters of phenylalanine ammonia-lyase genes in pea. Plant and Cell Physiology 35: 917-926.
Yuan G, Zhang Z, Xiang K, Shen Y, Du J, Lin H, Liu L, Zhao M, Pan G (2013). Different gene expressions of resistant and susceptible maize inbreds in response to Fusarium verticillioides Infection. Plant Molecular Biology Report 31: 925-935.
مجله بیوتکنولوژی کشاورزی
دوره 10، شماره 2 - شماره پیاپی 30
دوره 10 شماره 2
مهر 1397
صفحه 145-164

فایل ها

هم رسانی

ارجاع به این مقاله

آمار