بهینه‌سازی تولید پروتئین نوترکیب کریپتوکروم DASH1 جلبک سبز Volvox carteri در باکتری Escherichia coli: بررسی حلالیت و اتصال به DNA

The Production Optimization of Recombinant Cryptochrome DASH1 of Green Algae Volvoxcarteri in Escherichia coli: Investigation of Solubility and Binding to DNA

Saeed Mahdavi

PhD student, Department of Plant Biology, Faculty of Natural Sciences, University of Tabriz, Tabriz, Iran. Email: smahdavi007@gmail.com

Jafar Razeghi

*Assistant Professor, Department of Plant Biology, Faculty of Natural Sciences, University of Tabriz, Tabriz, Iran. Tel: +989144033450, Email: Jafar_Razeghi@Tabrizu.ac.ir

Maghsoud Pazhouhandeh

Associate Professor, Department of Biotechnology, Faculty of Agriculture, Azarbijan Shahid Madani University, Km 35 Tabriz-Azarshahr Road, Tabriz, Iran. Email: pazhohandeh@yahoo.com

Arash Kianianmomeni

Associate Professor, Department of Cellular and Developmental Biology of Plants, University of Bielefeld, Bielefeld, Germany. Email: kianiana@googlemail.com

Ali Movafeghi

Professor, Department of Plant Biology, Faculty of Natural Sciences, University of Tabriz, Tabriz, Iran. Email: amovafe@hotmail.com

Abstract

Objective

Optogenetics, as a new scientific branch, uses the photoreceptors to conduct basic and applied research. Identification of the novel photoreceptors and their characteristics is a way to develop the optogenetics. Cryptochrome/Photolyase protein family DASH crypthochromes have DNA repair ability and play role in signaling pathways. Current research goal was the adequate production of the Volvox predicted DASH1 cryptochrome protein (VcCryDASH1) to use in spectroscopy studies as well as DNA repair assay.

Materials and methods

First, the coding sequence of VcCryDASH1 was isolated from Volvox carteri cDNA library using the specific primers and cloned into pGEX-2TK expression vector. The recombinant protein production was analyzed using two different strains of E. coli under different incubation times, using IPTG to induce the protein expression and then its solubility was investigated by SDS-PAGE. DNA binding ability of the protein was studied by alignment method.

Results

The appropriate production of the protein obtained in Rosetta strain at 32°C under more than 3 hours incubation. Approximately, 50 percent of the protein was insoluble under 1 and 3 hours incubations. VcCryDASH1 alignment analysis showed that there is high percentage of amino acids in this protein with DNA binding ability.

Conclusion

These results revealed that under optimum conditions, VcCryDASH1 has dual solubility but our approach can produce the adequate quantity of the protein in the Rosetta. Also, because of having conserved amino acids, the protein can bind to DNA, nominating it as a possible resource to design the DNA- light mediator molecules in optogenetics.

Keywords:DASH1 cryptochrome, Expression vector, Rosetta strain, Volvox carteri.

Citation: Mahdavi S, Razeghi J, Pazhouhandeh M, Kianianmomeni A (2019) The Production Optimization of Recombinant Cryptochrome DASH1 of Green Algae Volvox carteri in Escherichia coli: Investigation of Solubility and Binding to DNA. Agricultural Biotechnology Journal 10 (4), 147-170. 

DOI: 10.22103/jab.2018.2211

Received: September 16, 2018; Accepted: December 7, 2018

© Faculty of Agriculture, Shahid Bahonar University of Kerman-Iranian Biotechnology Society

بهینه‌سازی تولید پروتئین نوترکیب کریپتوکروم DASH1 جلبک سبز Volvox carteri در باکتری Escherichia coli: بررسی حلالیت و اتصال به DNA

سعید مهدوی

دانشجوی دکتری تخصصی فیزیولوژی گیاهی، گروه زیست شناسی گیاهی، دانشکده علوم طبیعی، دانشگاه تبریز، تبریز، ایران. ایمیل:smahdavi007@gmail.com

جعفر رازقی

*نویسنده مسئول، استادیار، گروه زیست شناسی گیاهی، دانشکده علوم طبیعی، دانشگاه تبریز، تبریز، ایران. تلفن: 09144033450، ایمیل:  Jafar_Razeghi@Tabrizu.ac.ir

مقصود پژوهنده

دانشیار، گروه بیوتکنولوژی دانشکده کشاورزی، دانشگاه شهید مدنی آذربایجان، کیلومتر 35 جاده تبریز- آذر شهر، ایران. ایمیل: pazhohandeh@yahoo.com

 آرش کیانیان مومنی

دانشیار، گروه زیست شناسی سلولی و تکوینی گیاهی، دانشگاه بیله فلد،  بیله فلد، آلمان. ایمیل: kianiana@googlemail.com

علی موافقی

استاد، گروه زیست شناسی گیاهی، دانشکده علوم طبیعی، دانشگاه تبریز، تبریز، ایران. ایمیل: amovafe@hotmail.com

تاریخ دریافت: 25/06/1397، تاریخ پذیرش: 16/09/1397

چکیده

هدف: اپتوژنتیک به عنوان یک شاخه علمی جدید، از فتورسپتورها به‌منظور اجرای تحقیقات پایه‌ای و کاربردی استفاده می‌کند. یکی از راه‌های توسعه اپتوژنتیک، شناسایی فتورسپتورهای جدید و تعیین خصوصیات آن‌هاست. کریپتوکروم‌های DASH متعلق به خانواده پروتئینی کریپتوکروم/فتولیاز، فتورسپتورهای دارای قابلیت ترمیم DNA بوده و در مسیرهای پیام‌رسانی علامت نقش دارند. هدف این تحقیق، تولید کافی پروتئین پیش‌گویی‌شده کریپتوکروم DASH1 ولوکس (VcCryDASH1)، برای استفاده در مطالعات طیف جذبی و نیز بررسی قابلیت ترمیم DNA می‌باشد.

مواد و روش­ها: ابتدا توالی کدکننده پروتئین VcCryDASH1 با استفاده از آغازگرهای اختصاصی، از کتابخانه cDNA جلبک Volvox carteri جداسازی و در پلاسمید بیانی pGEX-2TK همسانه‌سازی شد. تولید پروتئین نوترکیب در دو سویه متفاوت باکتری E. coli و همچنین تحت تاثیر زمان‌های مختلف القاء با IPTG و همچنین میزان انحلال‌پذیری آن توسط روش SDS-PAGE مورد ارزیابی قرار گرفت. بررسی قابلیت اتصال به DNA در این پروتئین، با روش همردیف‌سازی انجام شد.

نتایج: تولید کافی پروتئین، در سویه Rosetta، در °C32، و زمان القاء بیش از 3 ساعت بدست آمد. در زمان القاء 1 و 3 ساعت، نیمی از پروتئین به‌صورت نامحلول بود. همردیف‌سازی پروتئین VcCryDASH1 مشخص نمود که درصد بالایی از آمینواسیدهای متصل‌شونده به DNA، در این پروتئین حضور دارند.

نتیجه‌گیری: این نتایج نشان می‌دهند که پروتئین VcCryDASH1 تحت شرایط بهینه‌، دارای قابلیت انحلال‌پذیری دوگانه بوده اما روش ما می‌تواند مقدار کافی آن را در باکتری E. coli سویه Rosetta تولید کند. همچنین بدلیل داشتن آمینواسیدهای حفاظت‌شده‌، این پروتئین دارای قابلت اتصال به DNA می‌باشد که آن را به‌عنوان یک منبع احتمالی جهت طراحی مولکول‌های میانجی نور-DNA در اپتوژنتیک معرفی می‌نماید.

کلمات کلیدی: سویه Rosetta ، کریپتوکروم DASH1، وکتوربیانی،  Volvox carteri.

مقدمه

اپتوژنتیک یک شاخه علمی جدید برای استفاده از فتورسپتورها به‌منظور اجرای تحقیقات پایه‌ای و کاربردی است که در ابتدا به‌عنوان روش بکارگیری نور برای کنترل فعالیت نورون‌ها و کنترل عملکرد ارگانیسم، در علم عصب‌شناسی[1] مورد استفاده قرار گرفته‌است (Crick 1979; Crick 1999; Deisseroth et al. 2006). استفاده موفقیت‌آمیز اپتوژنتیک در علوم اعصاب، توجه بیوتکنولوژیست‌ها را به خود جلب نمود. بدین‌ترتیب زمینه‌ای از زیست‌فناوری بوجود آمد که برای ایجاد ابزارهای جدید (مانند ابرازهای انجام آزمایشات ژنتیکی قابل کنترل توسط نور) مهندسی ژنتیک را با علم اپتیک ترکیب کرد (Miesenbock 2009; Deisseroth 2011). شناسایی کانال‌رودوپسین‌ها باعث شروع استفاده از فتورسپتورهای جلبکی در زیست‌شناسی سنتزی[2]  شد. این کانال‌های کنترل‌شونده توسط نور، به‌منظور کنترل غیرتهاجمی پتانسیل الکتریکی غشاءسلولی، مورد استفاده قرار گرفته‌اند. امروزه از [3]CrChR2 به‌عنوان ابزار مولکولی در اپتوژنتیک استفاده می‌شود. کیانیان‌مومنی و همکاران (2009) پروتئینی به‌نام [4]VChR1 (همولوگ CrChR2 می‌باشد) را در جلبک ولوکس شناسایی کردند. از آن‎جایی‌که برای تحریک‌ CrChR2 در مقایسه با VChR1، به طول موج کوتاهتری از نور نیاز است (Nagel et al. 2002; Nagel et al. 2003; Kianianmomeni et al. 2009 ) و این طول موج دارای اثرات مضر بر حیوانات و انسان می‌باشند، استفاده آن در پزشکی خطرناک بوده، بنابراین با بکارگیری VChR1 می‌توان جلوی آسیب‌های احتمالی تابش مضر را گرفت. بدین ترتیب، توصیف یک فتورسپتور جدید دارای ویژگی مشترک با فتورسپتورهایی که قبلا استفاده شده‌اند، می‌تواند به محققان کمک کند تا ابزارهای مولکولی خود را به‌روز نمایند.  [5]LITEs و سویچ های نوری[6] پاسخگو به تابش UV، از دیگر ابزارهای اپتوژنتیکی می‌باشند که با استفاده از فتورسپتورهای گیاهی ایجاد شده‌اند. LITEs با استفاده از الحاق پروتئین‌های [7]AtCry2، [8]AtCIB1 و [9]XaTALEs، ایجاد شده و برای فعال‌سازی برگشت‌پذیر رونویسی از ژن‌ها، بکار می‌روند. این سیستم مولکولی محققان را قادر می‌سازد تا نقش تنظیمات ژنتیکی و اپی‌ژنتیکی را در بروز بیماری‌ها به‌خوبی مطالعه نمایند (Konermann et al. 2013). سوئیچ‌های نوری پاسخگو به تابش UV از فتورسپتور [10]AtUVR8 و پروتئین [11]AtCOP1 تولید و به‌منظور کنترل دقیق برهمکنش‌های پروتئین-پروتئین برای بررسی مسیر ترشحی در سلول‌های عصبی، ورود پروتئین به هسته، انجام Chromatin targeting و کنترل بیان ژن مورد استفاده قرار گرفته است (Kianianmomeni 2015). با شناسایی و توصیف یک فتورسپتور (از نظر ویژگی‌های بیوفیزیکی و بیوشیمیایی مانند طیف جذبی، فعالیت آنزیمی و عملکرد بیولوژیکی) و پروتئین برهمکنش‌دهنده با آن، می‌توان به طراحی ابزارهای اپتوژنتیک جدید برای تنطیم فرایندهای سلولی پرداخت. یکی دیگر از گروه‌های فتورسپتوری که می‌توانند در اپتوژنتیک مورد استفاده قرار گیرند، کریپتوکروم‌های DASH هستند. اصطلاح کریپتوکروم DASH برای نامیدن زیرشاخه جدیدی از خانواده‌ی CPF[12]، پیشنهاد شده‌است (Brudler et al. 2003). این گروه پروتئینی، در طیف وسیعی از موجودات تک‌سلولی و پرسلولی، شناسایی شده‌اند (Lin & Todo 2005) که از نظر ساختاری، همانند دیگر گروه‌های خانواده CPF دارای دمین [13]PHR بوده و قادرند نور را در محدوده UV-B تا آبی (290-495 nm) جذب نمایند. وجود این ویژگی، ناشی از حضور کروموفورهای فلاوین آدنین دی‌نوکلئوتید[14] به‌عنوان کروموفور کاتالیتیک و به احتمال فراوان متیل‌تترا‌هیدروفولات[15]، به‌عنوان کروموفور ثانویه است. طی مطالعات انجام شده، فعالیت‌های مختلفی برای کریپتوکروم‌های DASH پیشنهاد شده است که از جمله آن‌ها می‌توان به ترمیم آسیب‌های [16]CPD موجود در DNA تک‌رشته‌ای[17]  و CPD درون لوپ‌های DNA دورشته‌ای[18]، داشتن نقش احتمالی در ترمیم  CPDموجود در RNA، تنظیم بیان ژن‌ها در مرحله پس از رونویسی، نقش احتمالی در مسیرهای پیام‌رسانی نور آبی و تنظیم ساعت شبانه‌روزی (سیرکادینی) اشاره‌ کرد (Chaves et al. 2011). کریپتوکروم‌های DASH بدلیل جذب نور، اتصال به DNA و ترمیم آن، در آینده می‌توانند برای ایجاد ابزارهای ترمیم‌‎کننده‌ی DNA القا‌شونده با نور[19] مورد استفاده قرار گیرند (Kianianmomeni & Hallmann 2016). پیش‌نیاز ضروری برای مطالعه و یا استفاده‌ی کاربردی از هر نوع پروتئینی، شناسایی و یافتن منبع مناسب تولیدکننده پروتئین است. استخراج پروتئین از منابع طبیعی و استفاده از تکنولوژی DNA نوترکیب، دو روش رایج برای تهیه پروتئین می‌باشد (Walsh 2014). بدین‌ترتیب هدف از این پژوهش بررسی شرایط مناسب پروتئین نوترکیب GST-VcCryDASH1 به‌صورت محلول، در باکتریE. coliبوده تا بتوان از پروتئین تخلیص‌شده به‌منظور تعیین ویژگی‌های بیوفیزیکی، ساختاری و عملکردی فتورسپتور VcCryDASH1 استفاده نمود.

مواد و روش

انجام واکنش زنجیره‌ای پلیمراز [20] و ایجاد پلاسمید نوترکیب

استخراج RNA با روش ترایزول از جلبک Volvox carteri f. nagariensis مطابق دستورالعمل شرکت سیگما (USA) با کمی تغییرات انجام شد. سپس توسط کیت RevertAid First Strand cDNA synthesis (Thermo scientific, USA) سنتز cDNA انجام و به‌عنوان الگو برای واکنش PCR مورد استفاده قرار گرفت. برای تکثیر توالی نوکلوتیدی مربوط به پروتئین پیش‌گویی‌شده VcCryDASH1، از آغازگر رفت ((d1FpBamHI و آغازگر برگشت (d1RpEcoRI) (جدول 1) در واکنش PCR به حجم µl 25 دارایViBufferA  با غلظت X1، MgCl₂ با غلظت mM 5/1،dNTP Mix  با غلظت mM 3/0، DMSO با غلطت %3 و Pfu DNA Polymerase به مقدار U 5/1 Vivantis, Malaysia)) استفاده شد. برنامه دمایی PCR به‌صورت دمای واسرشت‌سازی اولیه در °C95 به‌مدت min 2 که به‌دنبال آن چرخه دمایی 45 تایی دارای دمای واسرشت‌سازی °C94 به‌مدت s 20، دمای اتصال °C58 به‌مدت s 30 و دمای سنتز °C72 به‌مدت min 4 و پس از پایان چرخه‌ها دمای سنتز نهایی °C72 به‌مدت min 7 اعمال شد. تخلیص محصول PCR موردنظر از ژل آگارز با استفاده از کیت PureLinkTM Quick (Thermo Scientific) مطابق دستورالعمل شرکت سازنده انجام شد. برای ایجاد پلاسمید نوترکیب بیانی (تحت نام pGCD1) از وکتور pGEX2TK و قطعه تخلیص‌شده فوق استفاده شد. بدین‌منظور از آنزیم‌های برشی BamHI، EcoRI و آنزیم T4 لیگاز (شرکت Thermo Scientific، ,USA) مطابق دستورالعمل شرکت سازنده با کمی تغییرات استفاده گردید. پلاسمید pGCD1 توسط روشTSS  (Chung et al. 1989) به باکتریE. coli  سویه Top10 تراریزش شد و باکتری تراریخت‌شده در محیط کشت انتخابگر LB-Agar (Luria-Bertani) حاوی µg.ml⁻¹ 100 آمپی‌سیلین کشت داده شد. کلون‌های مثبت با استفاده از Colony PCR و همچنین برش پلاسمید استخراج‌شده (Birnboim 1983) از کلون‌ها، مشخص شدند. تعیین‌توالی پلاسمید مربوط به 3 کلون مثبت توسط شرکت توپاز ژن کاوش (ایران، کرج) برای تایید نهایی توالی انجام شد. از پلاسمید نوترکیب pGCD1 مربوط به کلون شماره‌ 16 (pGCD1co16 ) در مراحل بعدی پژوهش استفاده گردید.

جدول 1. توالی آغازگرهای مخصوص تکثیر توالی کدکننده پروتئین VcCryDASH1. نواحی‌ خط‌کشیده‌شده، جایگاه برش آنزیم‌ه BamHI و EcoRI را نشان می‌دهد.

Table 1. The specific primers to amplify VcCryDASH1 coding sequence. The underlined sequences show the BamHI and EcoRI digestion sites.

تراریزش باکتری‌هایE. coli  سویه Top10 و Rosetta با پلاسمید pGCD1co16

پلاسمید pGEX-2TK به‌عنوان کنترل منفی و pGCD1co16 برای تراریخت‌نمودن باکتری‌هایE. coli  سویه Top10 و Rosetta با استفاده از روش TSS مورد استفاده قرار گرفتند. برای انتخاب باکتری‌های تراریخت‌شده Top10 و Rosetta از محیط LB Agar به‌ترتیب حاوی  µg.ml^-1100 آمپی‌سیلین؛ و حاوی µg.ml^-1 100 آمپی‌سیلین و µg.ml^-1 30 کلرامفنیکل و نگهداری در دمای °C37 استفاده شد.

بررسی بیان پروتئین نوترکیب در باکتریE. coli  سویه Rosetta و Top10

جهت بررسی بیان ژن تولیدکننده پروتئین VcCryDASH1co16 متعلق به ولوکس در میزبان باکتریایی، پارامترهای pH (5/5(، دما (°C32) و غلظت IPTG (mM 3) ثابت در نظر گرفته شد و بررسی بیان در دو سویه مختلف (سویه‌های Top10 و Rosetta) و در زمان‌های القاء متفاوت (1، 3 و 9 ساعت) مورد مطالعه قرار گرفت. بدین‌منظور ابتدا از کلنی‌های باکتری E. coli سویه Top10 یا Rosetta که دارای پلاسمیدهای pGEX-2TK یا pGCD1co16 بودند، به حجم  ml5 پیش‌کشت تهیه شد و به‌مدت 12 ساعت در دمای °C32 با دور rpm 100 در انکوباتور قرار داده شد. ml 1 از پیش‌کشت به ml 6 از LB مایع حاوی آنتی‌بیوتیک‌ مناسب تلقیح شد و در °C32 تا رسیدن به جذب نوری (nm 600OD ) حدود 6/0 با دور rpm 150 در انکوباتور قرار گرفت. پس از رسیدن به غلظت مورد نظر، نمونه‌برداری (به حجم ml 1) انجام شد. به باقیمانده‌ی کشت باکتری مقداری IPTG اضافه شد تا غلظت نهایی آن mM 3 شود و همانند بالا در دمای °C32 با دور rpm 150 انکوبه شد. بر روی نمونه‌ای که قبل از اعمال القاء بیان (نمونه‌ی قبل از اعمال القاء بیان) برداشته‌شد، به‌منظور آماده‌سازی برای انجام SDS-PAGE مراحل زیر انجام گردید:

ابتدا نمونه به مدت min 1 در rpm 13300 سانتریفیوژ شد. روشناور دور ریخته‌شد و رسوب باکتری در µl 100 از بافر بارگذاری (X5) ژل SDS-PAGE معلق شد. سپس در °C100 به‌مدت min 5 حرارت داده‌شد. در نهایت به‌مدت min 1 در rpm  13300 سانتریفیوژ شد و تا آماده‌شدن بقیه نمونه‌ها، درون یخ قرار داده‌شد. سپس در زمان‌های 1، 3 و 9 ساعت بعد از القاء بیان پروتئین نمونه‌برداری همانند آنچه در بالا گفته‌شد، انجام گردید. پس از آماده‌سازی نمونه‌ها ژلSDS-PAGE  %10 مطابق روش Laemmli (1970) انجام شد. میزان بارگذاری در هر چاهک برابر %15 از جذب نوری در nm 550 برای هر نمونه بود. الکتروفورز در °C4 و با ولتاژ 180-100 ولت به‌مدت 5 ساعت انجام شد. رنگ‌آمیزی ژل مطابق روش کوماسی بلو انجام شد (Ahmed 2004).

بررسی حلالیت و تخلیص پروتئین نوترکیب GST-VcCryDASH1co16 در باکتریE. coli  سویه Rosetta

ابتدا حلالیت پروتئین VcCryDASH1 متصل به GST توسط سرور PROSOII پیش‌گویی شد. به‌منظور بررسی میزان انحلال‌پذیری و خالص‌سازی این پروتئین، باکتریE. coli  سویه Rosetta به‌ترتیب دارای پلاسمید pGCD1co16، با mM 3 از IPTG به‌مدت 1 و 3  ساعت (در آزمایش مربوط به انحلال‌پذیری) و دارای پلاسمید pGCD1co16  یا pGEX-2TK با  mM3 از IPTG به‌مدت 12 (در آزمایش مربوط به تخلیص پروتئین) ساعت در دمای °C32 تحت القاء قرار گرفتند. پس از پایان زمان القاء بیان، سانتریفیوژ در g5000 در دمای °C4 به‌مدت min 15 انجام و محلول‌رویی دور ریخته شد. به رسوب باکتری بدست‌آمده از ml 1 کشت باکتری، µl 30 از محلول PBS سرد (حاوی mM 140 از NaCl، mM 7/2 از KCl، mM 10 از Na2HPO4، mM 8/1 از KH2PO4؛ با pH برابر با 3/7) اضافه و معلق‌سازی رسوب باکتری انجام شد. تخریب دیواره باکتری توسط امواج فراصوت و در روی یخ انجام گردید. سپس سانتریفیوژ درg 15000 به‌مدت min 50 در °C4 انجام شد. محلول‌رویی به تیوب جدید انتقال داده شد. بخشی از روشناور برای بررسی حلالیت مورد استفاده قرار گرفت و بقیه به‌منظور تخلیص پروتئین در دمای°C 80- قرار داده‌شد. جهت تخلیص پروتئین  GST-VcCryDASH1از روشناور‌، کروماتوگرافی تمایلی با استفاده از سوسپانسیون گلوتاتیون سفاروزبید (GE Healthcare, USA) مطابق دستورالعمل شرکت سازنده انجام‌شد. همچنین به رسوب حاصل از تخریب دیواره سلولی به ازای ml 1 از کشت، µl 20 از محلول PBS سرد اضافه و معلق‌سازی انجام شد. سپس به‌منظور بررسی میزان انحلال‌پذیری پروتئین‌ GST-VcCryDASH1co16 و تایید خالص‌شدن آن توسط کروماتوگرافی‌تمایلی، الکتروفورز SDS-PAGE انجام شد. برای رنگ‌آمیزی ژل از روش کوماسی بلو استفاده شد.

مطالعه قابلیت اتصال پروتئین VcCryDASH1co16 به DNA با استفاده از ابزارهای بیوانفورماتیک

از خانواده پروتئینی DNA فتولیاز، پروتئین‌های Deoxyribodipyrimidine photo-lyase  (که قابلیت اتصال به DNA آسیب‌دیده در آن‌ها اثبات شده‌است) متعلق به E. coli، Thermus thermophilus، Synechocystis sp. و Synechococcus sp. به ترتیب با اعداد دسترسی P00914، P61497، Q55081 و P05327 و همچنین پروتئین کریپتوکروم 1 متعلق به Arabidopsis thaliana (پروتئینی که عدم اتصال آن به DNA اثبات شده‌است) با عدد دسترسی Q43125 از پایگاه داده‌ای Uniprot بازیابی شدند. همردیف‌سازی این پروتئین‌ها با توالی آمینواسیدی VcCryDASH1، توسط سرور Clustal omega انجام شد (Sievers & Higgins 2018). سپس مکان آمینواسیدهای شاخص دارای قابلیت اتصال به DNA در خروجی همردیف‌سازی مشخص و میزان شباهت با این آمینواسیدها در پروتئین VcCryDASH1co16 محاسبه گردید.

بحث

با استفاده از واکنش PCR که توسط آنزیم Pfu DNA polymerase (دارای قابلیت تصحیح‌کنندگی) و آغازگرهای d1FpBamHI و d1RpEcoRI انجام شد، سه محصول PCR ایجاد گردید. طول صحیح محصول PCR مربوط به قطعه کدکننده کریپتوکروم DASH1 برابر با bp 1627 می‌باشد. به‌همین دلیل محصول فوق از ژل استخراج شد (شکل 1).

شکل 1. تکثیر توالی کدکننده VcCryDASH1 با استفاده از واکنش PCR و مشاهده آن بر روی ژل آگارز %1. چاهک 1: اندازه‌نمای (مارکر)DNA (اعداد سمت چپ، طول باندهای مارکر را نشان می‌دهند. برخی از اندازه‌ها نشان داده نشده‌اند)؛ چاهک 2: محصول PCR توالی کدکننده VcCryDASH1. ستاره‌های قرمزرنگ  محصول غیراختصاصی را نشان می‌دهند.

Figure 1. Amplification of VcCryDASH1 coding sequence, by PCR reaction and its checking on 1% (w/v) agarose gel. Lane 1: DNA Ladder (The left numbers show the length of Ladder bonds. Some sizes haven't been shown.); Lane 2: the PCR product of VcCryDASH1 coding sequence. Red stars show non-specific products.

واکنش هضم آنزیمی توسط آنزیم‌های BamHI و EcoRI بر روی قطعه تخلیص‌شده از ژل و همچنین پلاسمید بیانی pGEX-2TK انجام شد. به‌منظور پاکسازی محصول برش مجددا الکتروفورز انجام و تخلیص باندها از ژل صورت گرفت. با استفاده از آنزیمT4  لیگاز، پلاسمید و محصول PCR برش‌خورده، به‌یکدیگر متصل شدند (پلاسمید نوترکیب به نام pGCD1 ایجاد شد). پس از تراریزش آن به باکتریE. coli سویه Top10، باکتری تراریخت‌شده در محیط کشت انتخابی گسترده شد. پس از رشد کلنی‌ها در محیط کشت انتخابی، برای تعیین کلنی‌های دارای پلاسمید نوترکیب، کلنیPCR  انجام شد (شکل 2).

شکل 2. بررسی اولیه نتیجه همسانه‌سازی ژن VcCryDASH1، با استفاده از انجام غربالگری کلنی- PCR بر روی سویه Top10 تراریخت‌شده‌. چاهک 1: اندازه‌نمای (مارکر)  DNA (اعداد سمت چپ، طول باندهای مارکر را نشان می‌دهند. برخی از اندازه‌ها نشان داده نشده‌اند)؛ چاهک‌های 2 و 4: محصول PCR دو کلنی‌ دارای پلاسمید pGCD1 (کلون‌های مثبت)؛ چاهک 3: محصول PCR یک کلنی دارای پلاسمید pGEX-2TK (کلون منفی).

Figure 2. The rudimentary study of VcCryDASH1 cloning result, by doing the Colony PCR screening on transgenic Top10 strain. Lane 1: DNA Ladder (The left numbers show the length of Ladder bonds. Some sizes haven't been shown.); Lane 2 and 4: the PCR products for two colonies with pGCD1 (Positive colonies); Lane 3: the PCR product for a colony with pGEX-2TK (Negative colony).

سپس از کلون‌های مثبت، استخراج پلاسمید انجام و توسط واکنش PCR و همچنین هضم دوگانه آنزیمی با استفاده از آنزیم‌های BamHI و EcoRI، از حضور و استقرار صحیح قطعه درج‌شده در پلاسمید pGEX-2TK، اطمینان حاصل شد (شکل 3). برای بررسی نهایی سه کلون تاییدشده، تعیین‌ترادف شدند (شرکت توپاز ژن، کرج). توالی بدست‌آمده از تعیین‌ترادف، با توالی کدکننده این ژن که از پایگاه داده‌ای Phytozome بازیابی‌شده‌بود (دارای عدد دسترسی Vocar.0004s0450.1)، توسط الگوریتم ClustalW همردیف‌سازی شد (شکل 4).

شکل 3. بررسی نتیجه همسانه‌سازی ژن VcCryDASH1 توسط انجام برش آنزیمی(A) و  PCR (B)، بر روی پلاسمیدهای استخراج شده. A- چاهک 1: برش آنزیمی pGEX-2TK؛ چاهک 2: اندازه‌نمای (مارکر)DNA (اعداد سمت چپ، طول باندهای مارکر مربوط به ستون 2 را نشان می‌دهند. برخی از اندازه‌ها نشان داده نشده‌اند)؛ چاهک 3: برش آنزیمی pGCD1. B- چاهک 1: اندازه‌نمای (مارکر)DNA (اعداد سمت چپ، طول باندهای مارکر را نشان می‌دهند. برخی از اندازه‌ها نشان داده نشده‌اند)؛ چاهک 2: محصول PCR، در حالتی که pGEX-2TK الگوی واکنش باشد؛ چاهک 3: محصول PCR، در حالتی که pGCD1 الگوی واکنش باشد.

Figure 3. The study of VcCryDASH1 cloning results by doing enzymatic digestion (A) and PCR (B), on extracted plasmids. A- Lane 1: the enzymatic digestion of pGEX-2TK; Lane 2: DNA Ladder (The left numbers show the length of Ladder bonds in lane 2. Some sizes haven't been shown.); Lane 3: the enzymatic digestion of pGCD1. B- Lane 1: DNA Ladder (The left numbers show the length of Ladder bonds. Some sizes haven't been shown.); Lane 2: The PCR product, while using pGEX-2TK as the reaction template; Lane 3: The PCR product, while using pGCD1 as the reaction template.

این بررسی عدم حضور جهش در توالی کدکننده‌ کریپتوکروم DASH1 را تایید کرد. در ادامه پلاسمید pGCD1co16 که مربوط به کلون شماره‌ 16 بود، برای انجام بیان پروتئین مورد استفاده قرارگرفت. با استفاده از پلاسمیدهای pGEX-2TK و pGCD1co16 دو سویه‌ Top10 و Rosetta تراریخت شدند.

شکل 4. بررسی شباهت توالی کدکننده ژن کریپتوکروم DASH1 ولوکس، حاصل از تعیین‌ترادف (VcCryDASH1co16) و بازیابی‌شده از پایگاه داده‌ای فیتوزوم (VcCryDASH1Phyto)، ‌با استفاده از همردیف‌سازی. در پایین هر توالی‌، اسیدهای‌آمینه‌ی به‌رمز در آمده، نشان داده شده است. همچنین شباهت نوکلوتئیدی در ردیف ""Clustal Concens توسط علامت "*" تعیین شده است. علامت "*" قرمزرنگ، محل کدون نادر AGG را در توالی ژن VcCryDASH1 نشان می‌دهند.

Figure 4. Similarity study of the Volvox cryptochrome DASH1 coding sequence by using the sequences obtained by sequencing (VcCryDASH1co16) and retrieved from the Phytozome database (VcCryDASH1Phyto), through alignment method. The coded amino acids have been shown at the below of each sequence. Also, the nucleotide identity has been determined by "*" symbol, in the "Clustal Concens" Line. The red stars symbols show the position of "AGG" rare codon in the VcCryDASH1.

ادامه شکل 4.

Figure 4. continiued

القاء بیان پروتئین با کشت‌دادن باکتری در LB مایع دارای pH برابر 5/5 که حاوی آنتی‌بیوتیک آمپی‌سیلین برای باکتری Top10، و آمپی‌سیلین به‌همراه کلرامفنیکل برای باکتری Rosetta بود، در دمای °C32 با غلظت mM 3 از IPTG انجام‌شد. با استفاده از روش الکتروفورز SDS-PAGE، وضعیت بیان‌پذیری پروتئین‌هایGlutathione S-Transferase (GST)  (که در باکتری‌های دارای پلاسمید pGEX-2TK بیان می‌شود) و GST-VcCryDASH1co16 (که در باکتری‌های دارای پلاسمید pGCD1co16 بیان می‌شود) در پروتئوم باکتری‌ها بررسی شد (شکل 5 و 6). همان‌طور که مشخص است سویه Rosetta قادر به تولید هر دو پروتئین GST و GST-VcCryDASH1co16 می‌باشد درصورتی‌که سویه Top10 فقط می‌تواند پروتئین GST را تولید نماید. توالی کدکننده پروتئین GST که در پلاسمید pGEX-2TK وجود دارد، تنها دارای 2 کدون نادر AGA برای آمینواسید آرژنین (R) در موقعیت 103 و 108 می‌باشد، درحالی‌که توالی کدکننده پروتئین GST-VcCryDASH1co16 علاوه بر دو کدون فوق دارای 7 کدون دیگر (متشکل از AGA و AGG) مربوطه به آرژنین است. باتوجه به بیان‌شدن GST در سویه Top10 و عدم بیان‌ GST-VcCryDASH1co16 در این سویه، می‌توان نتیجه گرفت که دلیل عدم بیان‌پذیری این پروتئین در Top10، وجود کدون نادر AGG می‌باشد (شکل 4). این کدون نسبت به کدون‌های دیگر آمینواسید آرژنین در E. coli، دارای کمترین فراوانی tRNA می‌باشد. در سویه Rosetta پلاسمیدی به نام pRARE قرار داده‌شده‌است که با پلاسمید pGEX-2TK (همچنین با پلاسمیدهای نوترکیب حاصل از آن) سازگاربوده و دارای توالی‌های کدکننده مربوط به tRNA آمینواسیدهای کمیاب در باکتری E. coli (مانند tRNA دارای آنتی‌کدون مکمل با AGG) می‌باشد. حضور این پلاسمید در سویه Rosetta باعث افزایش این tRNAها در باکتری شده و آن‌را قادر به تولید پروتئین‌های یوکاریوتی می‌نماید. بدست‌آوردن مقدار کافی از یک پروتئین‌ محلول، عاملی محدودکننده در مطالعه بر روی آن است. بدین‌ترتیب پیش‌گویی دقیق حلالیت پروتئین‌های ناشناخته قبل از کار در آزمایشگاه، می‌تواند در طراحی آزمایشات و اتخاذ استراتژی مناسب در تولید پروتئین خالص مفید باشد. یکی از ویژگی‌های تعیین‌کننده در حلالیت پروتئین، ساختار اولیه پروتئین می‌باشد (Mahajan et al. 2014). الگوریتم‌های زیادی برای پیش‌گویی انحلال‌پذیری پروتئین‌ها در باکتری E. coli نوشته شده‌است که از جمله آن‌ها می‌توان به الگوریتم PROSO اشاره کرد. امتیاز داده شده به پروتئین GST-VcCryDASH1co16 در سرور PROSO برابر با 611/0 بود که نشان‌دهنده‌ی حلالیت متوسط این پروتئین می‌باشد. هرگاه امتیاز پروتئین عددی بین 5/0 و 745/0 باشد بدین‌معنی است که پروتئین مورد نظر جزء پروتئین‌های دارای حلالیت متوسط (Medium soluble proteins) می‌باشد. به‌منظور بررسی این پیش‌گویی، پروفایل پروتئین موجود در محلول حاصل از تخریب دیواره باکتری (توسط امواج اولتراسونیک) و رسوب مربوط به لاشه باکتری توسط SDS-PAGE مورد بررسی قرار گرفت (شکل 7).

شکل 5. بررسی بیان پروتئین GST و GST-VcCryDASH1co16 به‌ترتیب در سویه‌ Top10 دارای پلاسمید pGEX-2TK(A) و سویه‌ Top10 دارای پلاسمید pGCD1co16 (B)، در زمان‌های متفاوت و القاء با  mM3 از IPTG، با استفاده از روش SDS-PAGE. چاهک 1: پروفایل پروتئین قبل از القاء بیان؛ چاهک 2: پروفایل پروتئین 1 ساعت بعد از القاء بیان؛ چاهک 3: پروفایل پروتئین 3 ساعت بعد از القاء بیان؛ چاهک 4: پروفایل پروتئین 9 ساعت بعد از القاء بیان. علامت "*"موقعیت پروتئین GST را نشان می‌دهند. باکتری دارای پلاسمید pGCD1co16 پروتئین GST-VcCryDASH1co16 را بیان نکرده است.

Figure 5. Expression analysis of the GST and GST-VcCryDASH1co16 in Top10 strain having the pGEX-2TK (A) and pGCD1co16 plasmids (B) respectively, under the different incubation times and induction by 3 mM IPTG, through SDS-PAGE method. Lane 1: the protein profile before expression induction; Lane 2: the protein profile after 1-hour expression induction; Lane 3: the protein profile after 3 hours expression induction; Lane 4: the protein profile after 9 hours expression induction. The "*" symbols show the GST position. The bacterium having the pGCD1co16 didn't express GST-VcCryDASH1co16.

همان‌طور که در تصویر مشخص است میزان حضور پروتئین نوترکیب GST-VcCryDASH1co16 در روشناور و همچنین لاشه سلولی (پس از تخریب دیواره با امواج صوتی) بعد از 3 ساعت القاء بیان پروتئین نسبت به 1 ساعت القاء بیان، شدت بیشتری را نشان می‌دهد. همچنین مشخص است که پروتئین نوترکیب، در باکتری به هر دو حالت محلول و نامحلول دیده می‌شود. این مشاهده با پیش‌گویی انجام‌گرفته توسط الگوریتم PROSO مطابقت دارد. به‌منظور تخلیص پروتئین‌های GST و GST-VcCryDASH1co16، رسوب باکتری‌های E. coli سویه Rosetta که به‌ترتیب حاوی پلاسمیدهای pGEX-2TK و pGCD1co16 بودند و به‌مدت 12 ساعت در دمای °C32 توسط  mM3 از IPTG بیان پروتئین‌ در آن‌ها القاء شده بود، در حجم مناسبی از PBS سرد معلق‌سازی و تخریب دیواره سلولی با استفاده از امواج اولتراسونیک انجام شد. سپس با روش کروماتوگرافی تمایلی، تخلیص پروتئین‌ها صورت گرفت. به‌منظور بررسی صحت تخلیص، محلول پروتئینی با استفاده از SDS-PAGE مورد بررسی گردید (شکل 8).

شکل 6. بررسی بیان پروتئین GST و GST-VcCryDASH1co16 به‌ترتیب در سویه‌ Rosetta دارای پلاسمید pGEX-2TK(A) و سویه‌ Rosetta دارای پلاسمید pGCD1co16 (B)، در زمان‌های متفاوت و القاء با  mM3 از IPTG، با استفاده از روش SDS-PAGE. چاهک 1: پروفایل پروتئین قبل از القاء بیان؛ چاهک 2: پروفایل پروتئین 1 ساعت بعد از القاء بیان؛ چاهک 3: پروفایل پروتئین 3 ساعت بعد از القاء بیان؛ چاهک 4: پروفایل پروتئین 9 ساعت بعد از القاء بیان. علامت "*"موقعیت پروتئین GST و GST-VcCryDASH1co16 را نشان می‌دهد.

Figure 6. Expression analysis of the GST and GST-VcCryDASH1co16 in Rosetta strain having the pGEX-2TK (A) and pGCD1co16 plasmids (B) respectively, under the different incubation times and induction by 3 mM IPTG, through SDS-PAGE method. Lane 1: the protein profile before expression induction; Lane 2: the protein profile after 1-hour expression induction; Lane 3: the protein profile after 3 hours expression induction; Lane 4: the protein profile after 9 hours expression induction. The "*" symbols show the GST and GST-VcCryDASH1co16 position.

شکل 7. بررسی انحلال‌پذیری پروتئین GST-VcCryDASH1co16، در سویه Rosetta دارای پلاسمید pGCD1co16 با استفاده از روش SDS-PAGE. چاهک 1: اندازه‌نمای (مارکر) Prestained Protein Ladder شرکت سیناکلون (اعداد سمت چپ، وزن مولکولی پروتئین‌های مارکر را برحسب واحد kDa نشان می‌دهند) ؛ چاهک 2: پروفایل پروتئینی مربوط به لاشه باکتریایی (پس از تخریب دیواره)، بعد از 3 ساعت القای بیان پروتئین در باکتری‌ها ؛ چاهک 3: پروفایل پروتئینی مربوط به روشناور (پس از تخریب دیواره)، بعد از 3 ساعت القای بیان پروتئین در باکتری‌ها ؛ چاهک 4: پروفایل پروتئینی مربوط به لاشه باکتریایی، (پس از تخریب دیواره)، بعد از 1 ساعت القای بیان پروتئین در باکتری‌ها؛ چاهک 5: پروفایل پروتئینی مربوط به روشناور (پس از تخریب دیواره)، بعد از 1 ساعت القای بیان پروتئین در باکتری‌ها.  علامت  "*"محل GST-VcCryDASH1co16 را نشان می‌دهد.

Figure 7. The investigation of GST-VcCryDASH1co16 solubility, in Rosetta strain having the pGCD1co16, by SDS-PAGE method. Lane 1: Prestained Protein Ladder, Sinaclon Co (the numbers of the left- side show the molecular weights of the protein ladder bonds in kDa unit); Lane 2: the protein profile of the bacterial corpse (after cell wall disruption) after 3 hours induction of protein expression in bacteria; Lane 3: the protein profile of the supernatant (after cell wall disruption), after 3 hours induction of protein expression in bacteria; Lane 4: the protein profile of the bacterial corpse (after cell wall disruption), after 1 hour induction of protein expression in bacteria; Lane 5: the protein profile of the supernatant (after cell wall disruption), after 1 hour induction of protein expression in bacteria. The "*" symbols show the position of the GST-VcCryDASH1co16.

وزن مولکولی بدست‌آمده از ساختار اولیه پروتئین‌های GST و GST-VcCryDASH1co16 به‌ترتیب برابر با kDa 7/27 و  kDa6/86 می‌باشد اما پروتئین‌های GST و GST-VcCryDASH1co16 تخلیص‌شده‌ در ژل SDS-PAGE، به‌ترتیب در مقابل باندهای 17 و 63 کیلودالتون قرار گرفتند. دلیل این تفاوت، نوع بافر بارگذاری ژل SDS-PAGE، pH مربوط به سیستم بافری الکتروفورز (مشاهده‌ی انجام شده که در این مقاله آورده نشده است) و نحوه‌ی ایجادشدن میسل بین SDS موجود در بافر نمونه و پروتئین مورد مطالعه می‌باشد. مطالعه‌ی انجام‌شده توسط Rath و همکاران (2009) نشان داد پروتئین‌های آماده برای بارگذاری در ژل SDS-PAGE، با SDS موجود در بافر بارگذاری، پیکربندی جدیدی تشکیل را می‌دهند که در پروتئین‌های مختلف بسته به ماهیت آمینواسیدهای سازنده آن‌ها متفاوت خواهد بود. ایجاد ساختارهای میسلی متفاوت (بین پروتئین و SDS)، میزان مهاجرت پروتئین‌های دارای اندازه متناظر را در ژل پلی‌آکریل‌آمید، متفاوت می‌کند. به‌منظور مطالعه قابلیت اتصال پروتئین VcCryDASH1co16 به DNA، همردیف‌سازی آن با 4 پروتئین که قابلیت اتصال به DNA در آن‌ها اثبات‌ شده و یک پروتئین ناتوان در اتصال به DNA انجام و محل آمینواسیدهای کلیدی مشخص شد (شکل 9). در پژوهشی Li and Sancar (1990) نشان دادند که موتاسیون تریپتوفان 278 در توالی DNA فتولیاز E. coli باعث کاهش تمایل این پروتئین به DNA می‌شود. Torizawa و همکاران (2004) مشاهده کردند، موتاسیون‌های آرژنین 311، تریپتوفان 353 و آرژنین 366 (هر کدام به‌طور جداگانه) باعث کاهش توانایی DNA فتولیاز Thermus thermophilus در اتصال به DNA می‌شود. با توجه به بررسی حفاظت‌شدگی این آمینواسیدها و آمینواسیدهای مهم دیگر در اتصال به DNA می‌توان به دید مناسبی در مورد قابلیت اتصال احتمالی پروتئین VcCryDASH1co16 دست یافت.

شکل 8. بررسی SDS-PAGE پروتئین‌های GST و GST-VcCryDASH1co16 تخلیص‌شده. چاهک 1: روشناور حاوی GST-VcCryDASH1co16 قبل از اعمال تخلیص؛ چاهک 2: اندازه‌نمای (مارکر) پروتئینی Prestained Protein Ladder شرکت سیناکلون (اعداد سمت چپ، وزن مولکولی پروتئین‌های مارکر را برحسب واحد kDa نشان می‌دهند)؛ چاهک 3: پروتئین GST-VcCryDASH1co16 در ایلوشن 3 (Elution 3)؛ چاهک 4: پروتئین GST-VcCryDASH1co16 در ایلوشن 2؛ چاهک 5: پروتئین GST-VcCryDASH1co16 در ایلوشن 1؛ چاهک 6: روشناور پروتئینی حاوی GST قبل از اعمال تخلیص؛ چاهک 7: GST در ایلوشن 3؛ چاهک 8: GST در ایلوشن 2؛ چاهک 9: GST در ایلوشن 1. علامت‌های "*" و "**"به‌ترتیب پروتئین GST و GST-VcCryDASH1co16 را نشان می‌دهند.

Figure 8. SDS-PAGE analysis of the purified GST and GST-VcCryDASH1co16. Lane 1: unpurified supernatant with GST-VcCryDASH1co16; Lane 2: Prestained Protein Ladder Sinaclon Co (the numbers of the left- side show the molecular weights of the protein ladder bonds in kDa unit.); Lane 3: the GST-VcCryDASH1co16 in elution 3; Lane 4: the GST-VcCryDASH1co16 in elution 2; Lane 5: the GST-VcCryDASH1co16 in elution 1; Lane 6: unpurified supernatant with GST; Lane 7: the GST in elution 3; Lane 8: the GST in elution 2; Lane 9: the GST in elution 1; The "*" and "**" symbols show GST and GST-VcCryDASH1co16, respectively.

در جدول 2، آمینواسیدهای دخیل در اتصال به DNA (در 4 پروتئین متصل‌شونده به DNA) مشخص شده‌اند. با توجه به این بررسی‌ها مشخص گردید که از بین 13 آمینواسید برهمکنش‌کننده با DNA، 9 عدد عینا در VcCryDASH1co16 وجود دارد، اما در AtCry1 (به‌عنوان پروتئینی که با DNA بر همکنش ندارد) فقط 4 عدد دیده می‌شود که به‌ترتیب معادل 69 و 7/30 درصد یکسانی[21] می‌باشند. این مشاهده مشخص می‌کند که کریپتوکروم DASH1 ولوکس از نظر قابلیت اتصال به DNA حدواسط فتولیازهای ترمیم‌کننده DNA و کریپتوکروم‌ دخیل در مسیر پیام‌رسانی علامت (AtCry1) می‌باشد. بدین‌ترتیب می‌توان این فرضیه‌ را مطرح کرد که این پروتئین، دارای عملکرد دوگانه‌‌ی قابلیت اتصال به DNA (به‌عنوان ترمیم‌کننده DNA آسیب‌دیده یا تنظیم‌کننده بیان ژن) و دخیل در تنظیم فرآیندهای نموی وابسته به نور می‌باشد.

شکل 9.  همردیف‌سازی پروتئین‌های شاخص درون خانواده پروتئینی کریپتوکروم/فتولیاز که قابلیت اتصال به DNA را دارند (پروتئین های TThPHR، EcPHRB، SynPHRA وSyncoPHR) و پروتئین شاخص درون این خانواده که قابلیت اتصال به DNA را ندارد (AtCry1)، با VcCryDASH1co16 به‌کمک  الگوریتم Clustal omega. پروتئین‌های استفاده‌شده و ارگانیسم حاوی پروتیئن در ادامه آورده شده است:  TThPHR (Deoxyribodipyrimidine photo-lyase مربوط به Thermus thermophilus)؛ EcPHRB (Deoxyribodipyrimidine photo-lyase مربوط به E. coli)؛ SynPHRA (Deoxyribodipyrimidine photo-lyase مربوط به Synechocystis sp.)؛ و SyncoPHR (Deoxyribodipyrimidine photo-lyase مربوط Synechococcus sp.)؛ AtCry1 (Cryptochrome-1 مربوط به Arabidopsis thaliana)؛ VcCryd1co16 (Cryptochrome DASH1 مربوط به Volvox carteri). علامت‌های "*" قرمز، محل آمینواسیدهای کلیدی برای اتصال پروتئین‌های متصل شونده به DNA را نشان می‌دهند.

Figure 9. The alignment of the specific proteins in Cryptochrome/DNA photolyase protein family, with DNA binding ability (TThPHR, EcPHRB, SynPHRA and SyncoPHR proteins) and without DNA binding ability (AtCry1 protein), compare to VcCryDASH1 by using Clustal omega algorithm. The proteins and their origin organisms are as follows: TThPHR (Deoxyribodipyrimidine photo-lyase from Thermus thermophilus); EcPHRB (Deoxyribodipyrimidine photo-lyase from E. coli); SynPHRA (Deoxyribodipyrimidine photo-lyase from Synechocystis sp.); SyncoPHR (Deoxyribodipyrimidine photo-lyase from Synechococcus sp.); AtCry1 (Cryptochrome-1 from Arabidopsis thaliana); VcCryd1co16 (Cryptochrome DASH1 from Volvox carteri). The red "*" symbols demonstrate the positions of the key amino acids that bind to DNA.

جدول 2. بررسی آمینواسیدهای متصل شونده به DNA آسیب‌دیده، در چند عضو شاخص خانواده پروتئینی کریپتوکروم/فتولیاز و پروتئین VcCryDASH1co16

Table 2. Study of the damaged DNA- binding amino acids, in some specific members of the Cryptochrome/photolyases protein family and VcCryDASH1co16 protein

نتیجه‌گیری

تولید و خالص‌سازی پروتئین‌های پیش‌گویی شده، اولین قدم در مطالعه‌ ویژگی‌های بیوفیزیکی و  بیوشیمیایی آن‌ها می‌باشد. فتورسپتورها به دلیل جایگاه ویژه‎ای که در زیست‌شناسی‌سنتزی برای ساخت ابزارهای مولکولی پیدا کرده‌اند، گزینه‌های جذاب برای تحقیقات شده‌اند. در این پژوهش شرایط تولید فتورسپتور جلبکی VcCryDASH1 در دو سویه باکتری E. coli در زمان‌های مختلف القاء بیان، و همچنین میزان انحلال‌پذیری آن مورد ارزیابی قرار گرفت. نتایج حاصل از این پژوهش نشان داد که تولید این پروتئین در سویه‌ بیانی Rosetta قابل اجراست و هر چند تقریبا نیمی از پروتئین‌تولیدی وارد کده‌ نامحلول باکتری می‌شود اما با افزایش زمان القاء می‎توان مقدار کافی از آن را برای آزمایشات پایین‌دستی توصیف این پروتئین بدست آورد. نتایج همردیف‌سازی، حفاظت‌شدگی آمینواسیدهای متصل شونده به DNA را در VcCryDASH1 مشخص کرد. به‌نظرمی‌رسد بتوان از این پروتئین برای ایجاد ابزارهای مولکولی پاسخگو به نور دارای قابلیت اصلاح DNA آسیب‌دیده، استفاده کرد. پروتئین تولیدی در این پژوهش برای بررسی‌های بیشتر جهت ارزیابی خصوصیات دینامیک مولکولی، طیف‌سنجی و ترمیم DNA مورد استفاده قرار خواهد گرفت و درصورت مشاهده‌ ویژگی‌های خاص، می‌تواند به‌صورت ماده‌ اولیه تولید ابزارهای مولکولی مفید در علوم پایه و کاربردی مورد استفاده قرار گیرد.

سپاسگزاری

هزینه‌های این پروژه با حمایت مالی مرکز مطالعات و همکاری‌های علمی بین‌المللی انجام شده است و از این طریق از مسئولین مربوطه تشکر و قدردانی می‌شود.

References

Ahmed H (2004) Principles and reactions of protein extraction, purification, and characterization. CRC Press, USA, pp. 71-131.  

Birnboim HC (1983) A rapid alkaline extraction method for the isolation of plasmid DNA. Methods Enzymol 100, 243–255.

Brudler R, Hitomi K, Daiyasu H et al. (2003) Identification of a new cryptochrome class. Structure, function, and evolution. Mol Cell 11, 59-67.

Chaves I, Pokorny R, Byrdin M et al. (2011) The cryptochromes: blue light photoreceptors in plants and animals. Annu. Rev. Plant Biol 62, 335-364.

Crick F (1999) The impact of molecular biology on neuroscience. Philos. Trans. Royal Soc. B 354, 2021–2025.

Crick FH (1979) Thinking about the brain. Sci Am 241, 219–232.

Deisseroth K (2011) Optogenetics. Nat Methods 8, 26–29.

Deisseroth K, Feng G, Majewska AK et al. (2006) Next-generation optical technologies for illuminating genetically targeted brain circuits. J Neurosci 26, 10380–10386.

Kianianmomeni A (2015) UVB-based optogenetic tools. Trends Biotechnol 33, 59–61.

Kianianmomeni A, Hallmann A (2016) Algal Photobiology: A Rich Source of Unusual Light Sensitive Proteins for Synthetic Biology and Optogenetics. In: Kianianmomeni A. (Eds.), Optogenetics. Methods in Molecular Biology. Humana Press., New York, pp. 37-54.

Kianianmomeni A, Stehfest K, Nematollahi G et al. (2009) A Channelrhodopsins of Volvox carteri are pho­tochromic proteins that are specifically expressed in somatic cells under control of light, temperature, and the sex inducer. Plant Physiol 151, 347–366.

Konermann S, Brigham MD, Trevino A et al. (2013) Optical control of mammalian endogenous transcription and epigenetic states. Nature 500, 472–476.

Laemmli UK (1970) Cleavage of Structural Proteins during the Assembly of the Head of Bacteriophage T4. Nature 227, 680–685.

Li YF, Sancar A (1990) Active site of Escherichia coli DNA photolyase: mutations at Trp277 alter the selectivity of the enzyme without affecting the quantum yield of photorepair. Biochemistry 29, 5698-706.

Lin C, Todo T (2005) The cryptochromes. Genome Biol 6, 2201-2209.

Mahajan P, Strain-Damerell C, Gileadi O, Burgess-Brown NA (2014) Medium-throughput production of recombinant human proteins: protein production in insect cells. Methods Mol Biol 1091, 95–121.

Miesenbock G (2009) The optogenetic catechism. Science 326, 395–399.

Nagel G, Ollig D, Fuhrmann M et al. (2002) Channelrhodopsin-1: a light-gated proton channel in green algae. Science 296, 2395–2398.

Nagel G, Szellas T, Huhn W et al. (2003) Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel. PNAS USA 100, 13940-13945.

Rath A, Glibowicka M, Nadeau VG et al. (2009) Detergent binding explains anomalous SDS-PAGE migration of membrane proteins. PNAS USA 106, 1760-1765.

Sievers F, Higgins DG (2018) Clustal Omega for making accurate alignments of many protein sequences. Protein Sci 27, 135-145.

Torizawa T , Ueda T, Kuramitsu S et al. (2004) Investigation of the cyclobutane pyrimidine dimer (CPD) photolyase DNA recognition mechanism by NMR analyses. J Biol Chem 279, 32950-32956.

Walsh G (2014) Proteins: biochemistry and biotechnology (2^nd edn), Wiley Blackwell, UK, pp. 65-89.