بیان موقت و خالص‌سازی پروتئین پروکیموزین در گیاه توتون با استفاده از وکتور ویروسی

نوع مقاله : مقاله پژوهشی

نویسندگان

1 دانشجوی دکتری، بخش علوم و مهندسی صنایع غذایی، دانشکده کشاورزی، دانشگاه شیراز، شیراز، ایران

2 بخش علوم و مهندسی صنایع غذایی، دانشکده کشاورزی، دانشگاه شیراز

3 شیراز شیراز- دانشکده کشاورزی شیراز - پژوهشکده بیوتکنولوژی

4 بخش علوم و صنایع غذایی، دانشکده کشاورزی، دانشگاه شیراز گروه پژوهشی فرآوری آبزیان، دانشکده کشاورزی، دانشگاه شیراز

5 بخش بیوشیمی، دانشکده دامپزشکی، دانشگاه شیراز

چکیده

هدف: هدف از این تحقیق همسانه‌سازی و بیان پروتئین نوترکیب کیموزین و پروکیموزین در گیاه توتون با استفاده از ناقل­ ویروس موزائیک تنباکو و خالص‌سازی پروتئین تولید شده بود. 
مواد و روش‌ها: توالی پروکیموزین بزی از پایگاه داده NCBI دریافت و براساس ترجیح کدونی گیاه توتون بهینه‌سازی گردید. سپس با طراحی آغازگرهای مختلف ژن پروکیموزین و کیموزین تکثیر و در ناقل‌های دوتایی (باینری) و ویروسی همسانه‌سازی و به باکتری آگروباکتریوم تومه‌فاشینس انتقال داده شد. با روش آگرواینفیلتراسیون باکتری حامل ناقل‌های دوتایی و ویروسی به برگ‌های گیاه توتون تزریق گردید. روش وسترن بلاتینگ به منظور بررسی بیان پروتئین مورد استفاده قرار گرفت. فعالیت نسبی پروتئین‌ها در تشکیل لخته مورد بررسی قرار گرفت.
 نتایج: زمانی که ژن پروکیموزین با استفاده از ناقل‌های دوتایی در گیاه توتون بیان گردید، فقط یک باند ضعیف در پروتئین کل استخراج شده مشاهده گردید، ولی زمانی که ژن کیموزین در ناقل دوتایی بیان گردید، در پروتئین محلول نیز باند مشاهده گردید. استفاده از ناقل‌های ویروسی باعث نکروزه شدن برگ‌های گیاه توتون گردید و نتایج مشابهی نیز با ناقل‌های دوتایی بدست آمد به طوری که زمانی که ژن پروکیموزین بیان گردید فقط یک باند در پروتئین کل، ولی زمانی که کیموزین بیان گردید علاوه بر پروتئین کل در پروتئین محلول استخراج شده نیز باند مشاهده گردید. بیشترین میزان بیان با استفاده از سازه ژنی TMVαchymosinhyFC بدست آمد که پروتئین خالص شده دارای فعالیت تشکیل لخته U 8/16 در هر گرم برگ تر بود.
نتیجه گیری: اگرچه استفاده از ناقل‌های ویروسی و بیان موقت می‌تواند روش ارزان، سریع و موثری برای تولید پروتئین‌های نوترکیب باشد ولی در تحقیق حاضر نکروزه شدن و مشکلات احتمالی گیاه توتون با کل یا بخشی از ژن پروکیموزین باعث کاهش سطح بیان کیموزین گردید، که تعیین دلایل احتمالی و راه‌های رفع آن‌ها  نیازمند مطالعات بیشتر می‌باشد.

کلیدواژه‌ها

عنوان مقاله [English]

Transient expression and purification of prochymosin in tobacco (Nicotiana benthamiana) using viral vectors

نویسندگان [English]

  • Esmaeil Ziaee 1
  • Mohammad Hadi Eskandari 2
  • Ali Niazi 3
  • Marzieh Moosavi Nasab 4
  • Mahmmod Aminlari 5
1 PhD Student, Department of Food Science and Technology, College of Agriculture, Shiraz University, Shiraz, Iran.
2 Department of Food Science and Technology, College of Agriculture, Shiraz University
3 Professor, Institute of Biotechnology, College of Agriculture, Shiraz University, Shiraz, Iran
4 Department of Food Science and Technology, College of Agriculture, Shiraz University Seafood Processing Research Group, College of Agriculture, Shiraz University
5 Department of Biochemistry, Shiraz University
چکیده [English]

Objective
The aim of present study was transient expression and purification of recombinant caprine chymosin and prochymosin in N. benthamiana leaves using plant binary vectors and tobacco mosaic virus (TMV) vector. 
Material and Methods
The caprine prochymosin gene sequence was obtained from NCBI gene bank and optimized at codons for preferential expression in tobacco leaves. The chymosin and prochymosin genes were introduced into the plant binary and viral vectors.  Immunoblotting analyses were conducted to demonstrate expression of chymosin and prochymosin, and the expression level was quantified by milk clotting activity test.
Results
Results indicated that N. benthamiana leave cells cannot process prochymosin correctly and only a weak band observed in extracted total proteins (TPs) which showed no milk clotting activity while leaves infiltrated by p20αchymosin showed a band with chymosin molecular weight and slightly showed milk clotting activity. TMV-based recombinant prochymosin and chymosin expression showed necrosis after 3 days post infiltration (dpi) in agro-infiltrated leaves and after 5 days, leaves completely dried and necrotized. Blotting analysis showed only a band with right molecular weight in TSPs extracted N. benthamiana leaves infiltrated by TMVαchymosin.  Moreover, we subcloned chymosin which expanded with a N-terminal barley alpha amylase signal peptide and a C-terminal hybrid Fc tag which labelled as TMVαchymosinhyFc. The expression level increased gradually from 2 to 5 days after infiltration from 3.3 U/g FW to 16.8 U/g FW but after 5-day leaves necrosis started and expression level reduced gradually.
Conclusion
Viral vectors and transient expression can be a cheap, fast and effective method to produce a huge amount of recombinant proteins but it seems chymosin production still needs more research and find the N. benthamiana cells problem with chymosin which leads to necrosis and reduce the expression level for large scale production.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Chymosin
  • Prochymosin
  • Transient expression
  • Viral vector

مراجع

احسنی محمدرضا، محمدآبادی محمدرضا، اسدی فوزی مسعود و همکاران (1398) بیان ژن لپتین در بافت چربی زیرپوستی گاوهای هلشتاین با استفاده از Real Time PCR. مجله بیوتکنولوژی کشاورزی 11(1)، 150-135.
محمدآبادی محمدرضا، کرد محبوبه، نظری محمود (1397) مطالعه بیان ژن لپتین در بافت‌های مختلف گوسفند کرمانی با استفاده از Real Time PCR. مجله بیوتکنولوژی کشاورزی 10 (3)، 122-111.
References
Ahsani MR, Mohammadabadi MR, Asadi Fozi M et al. (2019a) Effect of Roasted Soybean and Canola Seeds on Peroxisome Proliferator‐Activated Receptors Gamma (PPARG) Gene Expression and Cattle Milk Characteristics. Iran J Appl Anim Sci 9, 635-642.
Ahsani MR, Mohammadabadi MR, Asadi Fozi M et al. (2019b) Leptin gene expression in subcutaneous adipose tissue of Holstein dairy cattle using Real Time PCR. Agric Biotechnol J 11, 135-150 (In Persian).
Arima K, Iwasaki S, Tamura G (1967) Milk clotting enzyme from microorganisms: Part I. Screening test and the identification of the potent fungus part II. The enzyme production and the properties of crude enzyme. Agri Biologic Chem 31, 540-551.
Cardoza R, Gutiérrez S, Ortega N et al.  (2003) Expression of a synthetic copy of the bovine chymosin gene in Aspergillus awamori from constitutive and pH-regulated promoters and secretion using two different pre-pro sequences. Biotechnol Bioeng 83, 249-259.
Conley AJ, Zhu H, Le LC et al.  (2011) Recombinant protein production in a variety of Nicotiana hosts: a comparative analysis. Plant Biotechnol J 9, 434-444.
Doran PM (2006) Foreign protein degradation and instability in plants and plant tissue cultures. Trend Biotechnol 24, 426-432.
Dorokhov YL, Sheveleva AA, Frolova OY, et al. (2007) Superexpression of tuberculosis antigens in plant leaves. Tuberculosis 87, 218-224.
Espinoza-Molina JA, Acosta-Muñiz CH, Sepulveda D et al. (2016) Codon Optimization of the “Bos Taurus Chymosin” Gene for the Production of Recombinant Chymosin in Pichia pastoris. Mol Biotechnol 58, 657-664.
Feng Z, Zhang L, Han X,  Zhang Y (2010) Codon optimization of the calf prochymosin gene and its expression in Kluyveromyces lactis. World J Microbiol Biotechnol 26, 895-901.
Fischer R, Stoger E, Schillberg S et al. (2004) Plant-based production of biopharmaceuticals. Curr Opin Plant Biol 7, 152-158.
Gils M, Kandzia R, Marillonnet S et al. (2005) High‐yield production of authentic human growth hormone using a plant virus‐based expression system. Plant Biotecnol J 3, 613-620.
Giritch A, Marillonnet S, Engler C et al.  (2006) Rapid high-yield expression of full-size IgG antibodies in plants coinfected with noncompeting viral vectors. PNAS 103, 14701-14706.
Gleba Y, Klimyuk V, Marillonnet S (2005) Magnifection—a new platform for expressing recombinant vaccines in plants. Vaccine 23, 2042-2048.
Huang Z, LePore K, Elkin G, et al. (2008) High‐yield rapid production of hepatitis B surface antigen in plant leaf by a viral expression system. Plant Biotechnol J 6, 202-209.
Huang Z, Santi L, LePore, K et al. (2006) Rapid, high-level production of hepatitis B core antigen in plant leaf and its immunogenicity in mice. Vaccine 24, 2506-2513.
Jiang X, Yin M, Chen P, Yang Q (2012) Constitutive expression, purification and characterization of bovine prochymosin in Pichia pastoris GS115. World J Microbiol Biotechnol 28, 2087-2093.
Kawaguchi Y, Kosugi S, Sasaki K et al. (1987) Production of chymosin in Escherichia coli cells and its enzymatic properties. Agri Biologic Chem 51, 1871-1877.
Kumar A, Grover S, Sharma J, Batish V (2010) Chymosin and other milk coagulants: sources and biotechnological interventions. Crit Rev Biotechnol 30, 243-258.
Liu WG, Wang YP, Zhang ZJ et al. (2017) Generation and characterization of caprine chymosin in corn seed. Protein Expr Purif 135, 78-82. 
Ma T, Li ZY,  Wang S (2019) Production of Bioactive Recombinant rPA (Reteplase) by Virus-based Transient Expression System in Nicotiana benthamiana. Front Plant Sci 10, 1225-1234.
Matoba N, Husk AS, Barnett BW, et al. (2010) HIV-1 neutralization profile and plant-based recombinant expression of actinohivin, an Env glycan-specific lectin devoid of T-cell mitogenic activity. PloS One 5, 11143-1154.
Menzella HG (2011) Comparison of two codon optimization strategies to enhance recombinant protein production in Escherichia coli. Microb Cell Fact 10, 15-24.
Mohammadabadi MR, Jafari AHD, Bordbar F (2017) Molecular analysis of CIB4 gene and protein in Kermani sheep. Brazil J Med Biol Res 50, e6177.
Mohammadabadi MR, Kord M, Nazari M (2018) Studying expression of leptin gene in different tissues of Kermani Sheep using Real Time PCR. Agric Biotechnol J 10, 111-122 (In Persian).
Mohammadabadi MR, Tohidinejad F (2017) Charachteristics determination of Rheb gene and protein in Raini Cashmere goat. Iran J Appl Anim Sci 7, 289-295.
Nausch H, Mikschofsky H, Koslowski R et al. (2012) High-level transient expression of ER-targeted human interleukin 6 in Nicotiana benthamiana. PloS One 7, 1-16.
Pinkhasov J, Alvarez ML, Rigano MM et al. (2011) Recombinant plant‐expressed tumour‐associated MUC1 peptide is immunogenic and capable of breaking tolerance in MUC1. Tg mice. Plant Biotechnol J 9, 991-1001.
Schneider J, Castilho A, Pabst M et al. (2015) Characterization of plants expressing the human β1, 4-galactosyltrasferase gene. Plant Physiol Biochem 92, 39-47.
Sheen S (1983) Biomass and chemical composition of tobacco plants under high density growth. Beitrage zur Tabakforschung International/Contributions to Tobacco Research 12, 35-42.
Tohidi nezhad F, Mohammadabadi MR, Esmailizadeh AK, Najmi Noori A (2015) Comparison of different levels of Rheb gene expression in different tissues of Raini Cashmir goat. Agric Biotechnol J 6, 35-50 (In Persian).
Tusé D, Tu T, McDonald KA (2014) Manufacturing economics of plant-made biologics: case studies in therapeutic and industrial enzymes. BioMed Res Int 2014, 1-16.
Twyman RM, Stoger E, Schillberg S et al.  (2003) Molecular farming in plants: host systems and expression technology. Trend Biotechnol 21, 570-578.
Tyagi A, Kumar A, Mohanty AK et al. (2017) Expression of buffalo chymosin in Pichia pastoris for application in mozzarella cheese. LWT 84, 733-739.
Ward M, Wilson LJ, Kodama KH et al. (1990) Improved production of chymosin in Aspergillus by expression as a glucoamylase-chymosin fusion. Biotechnol 8, 435-440.
Wei ZY, Zhang YY, Wang YP et al. (2016) Production of bioactive recombinant bovine chymosin in tobacco plants. Int J Mol Sci 17, 624-632.
Zhang W, Song X, He X, Gan B (2011) Optimization of culture media of Bacillus licheniformis with high yield of chymosin. China Brew 2, 24-32.
 
مجله بیوتکنولوژی کشاورزی
دوره 14، شماره 2
تیر 1401
صفحه 45-66

فایل ها

هم رسانی

ارجاع به این مقاله

آمار