کلونینگ و بیان مولکول های کوتاه شده و دست نخورده استرپتوکیناز در اشریشیا کلی و ارزیابی فعالیت بیولوژیک آن ها

کلونینگ و بیان مولکول های کوتاه شده و دست نخورده استرپتوکیناز در اشریشیا کلی و ارزیابی فعالیت بیولوژیک آن ها

رضا  عربی¹، فرزین روحوند²*، داریوش نوروزیان²، محمدرضا آقا صادقی²، آرش معمار نژادیان²، حسین خان احمد²، سید مهدی سادات³؛ فاطمه متولی³

¹ دانشجوی دکترای فراورده های بیولوژیک، انستیتو پاستور ایران

² عضو هیأت علمی انستیتو پاستور ایران

³ کارشناس ارشد انستیتو پاستور ایران

چکیده

          استرپتوکیناز پرمصرف ترین دارو در درمان ترومبولیتیک عروق خونی به شمار می آید. با وجود این، به علت غیرانسانی بودن منشا آن و فعالیت غیراختصاصی در غیاب فیبرین، کاربرد آن با عوارض آلرژیک و ضایعات هموراژیک همراه می باشد. اثبات شده است که انواع کوتاه شده ای از استرپتوکیناز، درحالی که بیشترین فعالیت خود را حفظ کرده اند اختصاصیت بیشتری نسبت به فیبرین پیدا کرده و فاقد برخی نواحی آنتی ژنیک خود هستند. در این پژوهش استرپتوکینازهای کوتاه شده SKc143-386 و SKc60-386 به همراه استرپتوکیناز کامل در دو وکتور بیانی pQE30 و pET41a کلون شدند. در حالی که، استرپتوکیناز کامل در هر دو نوع وکتور بیان شد، pET41a تنها وکتور موثر در تولید انواع کوتاه شده استرپتوکیناز بود. pET41a دارای سه برچسب قبل از جایگاه آنزیمی خود می باشد که احتمالا" از بروز مشکلاتی همچون بیان ژن های هترولوگ نوترکیب در اشریشیاکلی جلوگیری می کند. بررسی SDS-PAGE و وسترن بلات پروتئین های تخلیص شده، درست بودن اندازه و ماهیت پروتئین های تولید شده را نشان داد. بررسی فعالیت اختصاصی پروتئین های SK143-386، SK60-386 و استرپتوکیناز کامل با استفاده از روش دقیق رنگ سنجی نشان دهنده کاهش 83 تا 91 درصدی در فعالیت انواع کوتاه شده بود. این پژوهش، مطالعه اولیه ای برای مقایسه فعالیت اختصاصی پروتئین های کوتاه شده و دست نخورده استرپتوکیناز تولید شده می باشد. برای بررسی اختصاصیت به فیبرین و همچنین میزان آنتی ژنیسیته نیاز به آزمون های بیشتر می باشد.  

واژه های کلیدی: استرپتوکیناز، پروتئین های کوتاه شده، کلونینگ، فعالیت بیولوژیک

مقدمه

تشکیل لخته خونی در سیستم گردش خون ممکن است باعث بسته شدن رگ های خونی، بروز سکته های قلبی-مغزی و نهایتاً مرگ گردد. در چنین مواردی، عوامل ترومبولیتیک یا فیبرینولیتیک، مانند استرپتوکیناز، فعال کننده پلاسمینوژن بافتی[1] و یوروکیناز، به عنوان دارو های حل کننده لخته خون تجویز می شوند (Banerjee et al., 2004; Baruah et al., 2004). در میان این سه دارو، استرپتوکیناز[2]  که از همه ارزان تر می باشد یک آنزیم خارج سلولی است که به وسیله باکتری استرپتوکوک بتا همولیتیک تولید می شود. این آنزیم یک پلی پپتید تک زنجیره ای است که دارای وزن مولکولی 47 کیلو دالتون بوده، از 414 اسید آمینه تشکیل شده و دارای سه دمین ساختمانی α وβ و γ می باشد که مطالعات زیادی در مورد نقش این سه دمین انجام پذیرفته است (Reed et al., 1999; Sazonova et al., 2004; Wong et al., 1994). متاسفانه، علیرغم قابلیت بالای استرپتوکیناز در حل کردن لخته و نیز صرفه اقتصادی استفاده از این دارو، کاربرد آن با مشکلاتی نیز مواجه است که از آن جمله، ایمنوژن بودن استرپتوکیناز و همچنین مهار عمومی سیستم انعقادی و در نتیجه ایجاد عوارض هموراژیک قابل ذکر اند (Banerjee et al., 2004; Baruah et al., 2004). استرپتوکیناز رشته های فیبرین را به طور ناکامل تجزیه کرده و در عوض فیبرینوژن پلاسما را به صورت کامل تجزیه می کند. این خصوصیت دلیل عمده ایجاد خونریزی های غیر قابل کنترل در درمان با استرپتوکیناز است. مشخص شده است که 59 اسیدآمینه موجود در ابتدای آمینی استرپتوکیناز در تجزیه فیبرینوژن نقش داشته و حذف این ناحیه منجر به عملکرد اختصاصی مولکول استرپتوکیناز تنها در حضور رشته های فیبرین می گردد که به این ترتیب امکان ایجاد هموراژی کاهش می یابد (Panizzi et al., 2006 Reed et al., 1995; ). همچنین استرپتوکیناز در شرایط فیزیولوژیک هنگام حل کردن لخته در مدت کوتاهی توسط پلاسمین در نواحی لیزین 59 و لیزین 386 تجزیه شده و سه قطعه 59 -1، 414-387 و 386-60 ایجاد می شوند، که تاکنون برای قطعه 414-387  فعالیت خاصی مشخص نشده است (Nihalani et al., 1998; Panizzi et al., 2006). همچنین مطالعات نشان داده اند که حذف 142 اسید آمینه اول استرپتوکیناز باعث کاهش فعالیت مولکول به 60 درصد فعالیت ماکزیمم، اما در مدت زمان طولانی تری گشته و به عبارت بهتر سرعت عمل آن نیز کاهش می یابد. این در حالی است که مولکول کامل حداکثر فعالیت را در مدت دو دقیقه دارد. از طرفی، قطعات پپتیدی 59-1، 142-1و 414-387 دارای اپی توپ های متعدد آنتی ژنیک هستند (Nihalani et al ., 1998) که حذف آنها می تواند در کاهش عوارض آلرژیک ناشی از تجویز این پروتئین باکتریایی موثر باشد. هدف از این پژوهش بهینه سازی عملکرد مولکول استرپتوکیناز با  حذف نواحی اسید آمینه ای 59-1، 142-1 و 414-387 مولکول استرپتوکیناز  بود. به این ترتیب، دو مولکول مهندسی شده SK60-386 و SK143-386 که نواحی آنتی ژنیک کمتری را دارا هستند به صورت نوترکیب در باکتری E.coli  بیان و تخلیص شده و  تغییرات فعالیت بیولوژیک پروتئین های حاصل  با پروتئین دست نخورده استرپتوکیناز  مقایسه شد.

مواد و روش ها

تکثیر ژن ها و کلونینگ

 آغازگرها  (جدول1) توسط نرم افزار  GENE RUNNER (Version 3.05) طراحی و به وسیله شرکت سیناژن (ایران، تهران) ساخته شدند. از سازه pUC18SK (که قبلاً ژن skc2 از سویه استاندارد ATCC9542 در آن کلون شده بود) به عنوان الگو برای تکثیر ژن های SKc143-386، SKc60-386 و SKc1-414  استفاده شد. وکتور هایpQE30  (دارای پروموترT5، QIAGEN) و pET41a (دارای پروموترT7، NOVAGEN) (شکل 1) برای کلونینگ انتخاب شده و به روش هضم آنزیمی تایید شدند. از  کیت High pure PCR product purification kit (Roche, Germany) برای تخلیص قطعات ژنی از محلول ها و ژل استفاده گردید. ژن ها و وکتور ها توسط آنزیم های BamHI و PstI (Fermentas, Lithuania) هضم شده و پس از الکتروفورز روی ژل آگارز توسط کیت از ژل استخراج شدند. قطعات ژنی توسط آنزیم T4 DNA Ligase (Fermentas, Lithuania) به درون وکتور ها وارد شده و پلاسمیدهای نوترکیب pQSK1-414، pQSK60-386، pQSk143-386، pETSK1-414، pET60-386 و pETSK143-386 ساخته شدند.

جدول 1- آغازگرهای استفاده شده برای تکثیر ژن های SKc143-386، SKc60-386 و SKc1-414.

Table 1 – primers used for amplification of skc60-386, skc143-386 and skc1-414.

شکل 1- الف) نقشه پلاسمید pQE30 . این پلاسمید تحت کنترل پروموتر T5  بوده و دارای یک برچسب پلی هیستیدین بعد از کدون شروع و قبل از جایگاه ورود ژن می باشد. ب) نقشه پلاسمید pET41a ؛ این پلاسمید تحت کنترل پروموتر  T7 بوده و دارای سه بر چسب پلی هیستیدین، S tag و GST tag بعد از کدون شروع و قبل از جایگاه ورود ژن می باشد.

Figure 1- A) a part of pQE30 plasmid map. This plasmid works under the control of T5 promoter and has a poly His tag in the upstream of  its multiple cloning site, skc1-414 was cloned in the BamHI and PstI site of the vector;  B) a part of  pET41a vector map; this plasmid works under the control of T7 promoter and there are three tags including poly His tag, S-tag and Gst-tag in the upstream of  its multiple cloning site; skc143-386, skc60-386 and skc1-414 were inserted in the BamHI and PstI site of the vector.     

سازه های حاصل به درون سلول های صلاحیت دار E.coli DH5α  ترانسفورم شده و پس از پدیدار شدن کلنی ها روی محیط دارای آنتی بیوتیک (آمپی سیلین برای سلول های حاوی وکتور pQE30 و کانامیسین برای سلول های حاوی وکتور pET41a) تعدادی از آن ها انتخاب شده و از روش Colony PCR برای تایید اولیه وجود پلاسمید نوترکیب استفاده گردید. در نهایت پس از انجام هضم آنزیمی با آنزیم های برشی مختلف و بررسی اندازه قطعات ایجاد شده، برای اطمینان از درستی توالی نوکلوئیدی و عدم وجود موتاسیون در ژن های کلون شده توالی نوکلئوتیدی آنها مورد بررسی قرار گرفته و تعیین شد (Seqlab, Germany). کلون های مورد تایید نهایی برای نگهداری دراز مدت در ویال های حاوی 80% گلیسرول و برای استفاده کوتاه مدت در محیط کشت LB agar نگهداری شدند. پلاسمیدهای تائید شده در مرحله بعد به درون میزبان بیانی E. coli M15 (در مورد پلاسمیدهای ساخته شده در pQE30) و E. coli Bl21 (در مورد پلاسمیدهای ساخته شده در pET41a) ترانسفورم شدند. چند کلنی از میان کلنی های رشد کرده انتخاب شده و پس از تایید مجدد، کلنی های مثبت در گلیسرول80% و  محیط کشت LB agar نگهداری شدند.

بیان و تخلیص پروتئین های نوترکیب

کلون های حاوی سازه های ژنی ابتدا در محیط TY2X (تریپتون، 16 گرم بر لیتر، عصاره مخمر10 گرم بر لیتر و کلرید سدیم 5 گرم بر لیتر) حاوی آنتی بیوتیک مناسب (بر اساس نوع وکتور استفاده شده) تلقیح شده و به مدت 12 تا 16 ساعت در دمای 37 درجه سانتی گراد رشد داده شدند. از سوسپانسیون سلولی حاصل به نسبت 1:50 به درون محیط کشت جدید TY2X تلقیح گردید و در شیکر انکوباتور  با دور  rpm200 و دمای 37 درجه سانتی گراد گرمخانه گذاری شد. وقتی کدورت کشت باکتریایی در طول موج 600 نانومتر به 6/0- 5/0رسید، IPTG با غلظت نهایی 1/0 میلی مولار تلقیح گردید و دوباره به مدت 5 ساعت گرمخانه گذاری با همان شرایط ادامه داده شد. توده سلول توسط سانتریفوژ با دور  rpm10000 رسوب داده شد. رسوب سلولی با 50 میکرولیتر بافر لیز کننده (حاوی اوره 8 مولار، سدیم دی هیدروکلراید 10 میلی مولار) مخلوط شده و وجود پروتئین ها  با استفاده از روش SDS-PAGE بررسی شدند (شکل2). با توجه به اینکه پلاسمیدهای بکار گرفته شده جهت کلونینگ امکان بیان بر چسب هیستیدینی (6xHis) را به صورت متصل به ابتدای آمینی پروتئین نوترکیب فراهم می آورند (شکل 1)، درستی پروتئین های بیان شده با استفاده از تکنیک وسترن بلات با آنتی بادی ضد برچسب هیستیدین به عنوان آنتی بادی اولیه و آنتی بادی ضد آنتی بادی موشی کنژوگه شده با آنزیم پراکسیداز ترب کوهیارزیابی شد. تخلیص پروتئین های تایید شده با استفاده از کروماتوگرافی میل ترکیبی با نیکل به روش دناتوره (با استفاده از اوره 8 مولار) توسط ژل Ni-NTA agarose (Qiagen, Germany) انجام گرفت. حذف اوره و Refolding پروتئین ها با استفاده از کیسه های دیالیز (cut off =2.5 kDa) و بافر (فسفات 1/0 میلی مولار، گلیسین 50 میلی مولار) انجام شد. غلظت پروتئین های تخلیص شده به روش Lowry و با استفاده از کیت BCA (Pierce) و همچنین با روش جذب نوری (با دستگاه پیکودراپ) در طول موج 280 نانومتر اندازه گیری شد.

اندازه گیری فعالیت استرپتوکیناز

برای اندازه گیری فعالیت حیاتی پروتئین های استرپتوکیناز از روش کیفی لیز کازئین (Caseinolysis Assay) (Anonymous.,2003) و همچنین روش کمّی رنگ سنجی (Colorimetric Assay) استفاده گردید (Nihalani et al.,1998؛ Panizzi et al.,2006). در روش لیز کازئین ابتدا مخلوطی از skim milk (5درصد)، آگارز (10 درصد)، کلرید سدیم (10 میلی مولار)، تریس (50 میلی مولار) تهیه شده و پس از انجام اتوکلاو این مخلوط در یک ظرف پتری ریخته شد. پس از سرد شدن با استفاده انتهای یک پی پت پاستور استریل چاهک هایی به قطر تقریبی 5 میلی متر در فواصل مناسب و مساوی ایجاد گردید. ابتدا 50 میکرولیتر از داروی تزریقی استرپتوکیناز (B. Braun, Germany) به عنوان استاندارد با سه رقت (فعالیت) مشخص در سه چاهک مختلف ریخته شده و در چاهک های دیگر استرپتوکیناز های نوترکیب تخلیص شده، که فعالیت آن ها مجهول می باشد ریخته شد. به همه چاهک های مذکور 50 میکرولیتر پلاسمینوژن انسانی (Fluka, Sweden) با غلظت یک میلی گرم بر لیتر اضافه گردید. دو چاهک کنترل منفی نیز، که به ترتیب حاوی 50 میکرولیتر آب به همراه استرپتوکیناز و 50 میکرولیتر آب به همراه پلاسمینوژن انسانی (یک میلی گرم بر لیتر) بودند تهیه شدند. پلیت به مدت 16 ساعت در 37 درجه سانتی گراد گرمخانه گذاری شد. سپس هاله های شفاف که در اطراف چاهک های نمونه و استاندارد در اثر لیز کازئین موجود در شیر ایجاد شده بودند مورد بررسی و تفسیر قرار گرفتند. در روش رنگ سنجی 50 میکرولیتر از غلظت های مختلف استرپتوکیناز استاندارد و نیز نمونه های نوترکیب تخلیص شده به صورت جداگانه با 50 میکرولیتر از پلاسمای تازه انسانی در درون چاهک های میکروپلیت 96 خانه ای مجاور شده و به مدت 10 دقیقه در دمای 37 درجه سانتی گراد گرمخانه گذاری گردید. سپس به همه خانه ها 50 میکرولیتر از غلظت 75/0 میلی مولار سوبسترای کروموژنیک S2251 (H-D-valyl-L-leucyl-L-lysine-ρ-nitroanalide) اضافه شده، دوباره به مدت 20 دقیقه در دمای 37 درجه سانتی گراد گرمخانه گذاری شد. برای توقف واکنش از 25 میکرولیتر اسید استیک 25 در صد استفاده شد. بلافاصله میزان رنگ ایجاد شده به وسیله اسپکتروفوتومتر با طول موج 405 نانومتر خوانده شد و بر اساس منحنی استاندارد به دست آمده نتایج به وسیله برنامه Parallel Line Assay بر حسب واحد بین المللی بر میلی لیتر (IU/mL) به دست آمد و از لحاظ  Regressionو Parallelism بررسی شد. سپس فعالیت اختصاصی پروتئین ها با تقسیم فعالیت زیستی آن ها بر غلظت (میلی گرم بر میلی لیتر و میکرو مول بر میلی لیتر) محاسبه گردید.

نتایج

کلونینگ، بیان و خالص سازی پروتئینهای نوترکیب

قطعات ژنی  skc60-386و skc143-386 پس از انجام PCR  و ایجاد محل برش آنزیم های BamHI و PstI در پلاسمید pQE30 کلون شدند. سازه های حاصل به نام های pQESK60 و pQESK143 به درون سویه بیانی M15 ترانسفورم شده و سپس بیان شدند. باوجود استفاده از غلظت های مختلف IPTG و القا در مراحل مختلف رشد (1-5/0 = OD₆₀₀) هیچ باند پروتئینی در ناحیه مورد انتظار (39 کیلو دالتون برای SK60-386 و30 کیلو دالتون برای SK143-386) در ژل پلی آکریل آمید مشاهده نشد. اما، باند مربوط به SK1-414 (که قبلا ژن آن کلون شده بود) با وزن مولکولی 47 کیلودالتون در ژل ظاهر گردید. وسترن بلاتینگ عصاره های سلولی نیز عدم بیان و یا احتمالا بیان بسیار کم پروتئین های کوتاه شده را تایید کرد. سپس ژن های مذکور و همچنین skc1-414 در وکتور pET41a وارد شدند و به ترتیب پلاسمیدهای pETSK60، pETSK143 و pETSK414 ساخته و تائید شدند. هضم آنزیمی سازه های حاصل درستی کلونینگ و تعیین توالی ژن ها عدم موتاسیون را در آن ها را تایید کردند. سازه های تایید شده در سویه بیانی BL21 (DE3) ترانسفورم و به دنبال القا با  IPTG بیان شدند. باندهای پروتئینی SK143-386، SK60-386 و SK1-414 به ترتیب با وزن های حدود 60 ، 66 و 79 کیلو دالتون بر روی ژل پلی اکریل آمید در جایگاه مورد انتظار مشاهده شدند (شکل-2-الف). همچنین وسترن بلاتینگ عصاره های سلولی بیان پروتئین های  SK143-386، SK60-386 و SK1-414 بصورت فیوژن با 6xHis-tag را تایید کرد (شکل2-ب). پروتئین ها به وسیله ستون های کروماتوگرافی میل ترکیبی خالص شده و Refolding آن ها با استفاده از کیسه دیالیز انجام شد.

مقایسه فعالیت  مولکول های کوتاه شده و کامل استرپتوکیناز نوترکیب

روش کازئینولیز: از روش کازئینولیز برای بررسی اولیه (کیفی) فعالیت استفاده شد. نتایج نشان داد که هاله لیز کازئین در اطراف چاهک مربوط به SK1-414 نسبت به SK60-386 و هاله مربوط به SK60-386 از SK143-386 بیشتر بود (شکل3). روش کروموژنیک: در این روش از سه رقت استاندارد بین المللی استرپتوکیناز (B. Braun, Germany) برای تعیین فعالیت زیستی پروتئین های نوترکیب ساخته شده در این مطالعه استفاده شد. نتایج نشان می دهد که فعالیت پروتئین کامل بدست آمده از سازه pETSK1-414 نسبت به پروتئین کامل بدست آمده از سازه pQESK1-414  بر حسب میزان واحد بین المللی در هر میکروگرم حدود 18 درصد کاهش، اما بر حسب  میزان واحد بین المللی در هر میکرومول حدود 30 درصد افزایش فعالیت دارد (جدول2). از طرف دیگر استرپتوکینازهای کوتاه شده  SK60-386  و SK143-386 در مقایسه با SK1-414 حاصل از سازهpQESK1-414 در هر میکروگرم به ترتیب حدود 85 و 90 درصد کاهش فعالیت داشتند. اما، فعالیت آن ها در مقایسه با SK1-414 حاصل از سازه pETSK1-414 در هر میکرومول به ترتیب حدود 83 و 91 در صد کاهش داشت (جدول2).

شکل2- الف) ژل پلی اکریل آمید مربوط به الکتروفورز عصاره سلولی کلون های بیان کننده ژن های کوتاه شده و کامل استرپتوکیناز؛ ستون1، الگوی وزن پروتئینی؛ ستون2 تا 7 به ترتیب نمونه های القا شده و القا نشده SK1-414 ،SK60-386  و SK143-386؛ ب) باند های پروتئینی استرپتوکیناز تخلیص شده؛ ستون1، الگوی وزن پروتئینی؛ ستون2 تا 4 به ترتیب SK1-414 ،SK60-386  و SK143-386 ؛ ج) وسترن بلات باند های پروتئینی استرپتوکیناز؛ به ترتیب از سمت چپ SK1-414 حاصل از pQE30 ، الگوی وزن پروتئینی، SK143-386، SK60-386 و  SK1-414.

Figure 2- analysis of proteins;  A) SDS-PAGE analysis of crude extracts related to truncated and full-length SK; lane1, protein weight marker; lane2 to 7 induced and uninduced samples of SK1-414, SK60-386 and SK143-386, respectively;  B) purified SK proteins; lane1,  protein weight marker; lane2 to 4, SK1-414, SK60-386 and SK143-386, respectively; C) western blot analysis of SK proteins; lane1, Sk1-414 from pQE30; lane2, unstained protein weigh marker; lane3 to 5, SK143-386, SK60-386 and SK1-414 respectively.

شکل 3- ارزیابی فعالیت پروتئین های استرپتوکیناز نوترکیب به روش کازئینولیز. از پلاسمینوژن (Plg) به عنوان شاهد منفی استفاده شد.

Figure 3- Evaluation of recombinant SK proteins by Caseinolysis method; plasminogen was used as negative control.

جدول2- مقایسه فعالیت اختصاصی استرپتوکیناز های کوتاه شده با استرپتوکینازکامل بیان شده در دو وکتور pQE30 و pET41a.

^* فعالیت (IU/mg) SK1-414 حاصل از سازه pQESK1-414 100 در صد در نظر گرفته شده و میزان فعالیت بقیه نسبت به آن محاسبه شده اند. ^** فعالیت (IU/ μM) SK1-414 حاصل از سازه pETSK1-414 100 در صد در نظر گرفته شده و میزان فعالیت بقیه نسبت به آن محاسبه شده اند.

Table 2– Comparison of specific activity of truncated and full-length SK expressed in pQE30 and pET41a vectors.

^*Activity (IU/mg) of SK1-414 from pQE1-414 considered as 100 percent and the activity of others calculated accordingly. ^** Activity (IU/MOL) of SK1-414 from pQESK1-414 considered as 100 percent and the activity of others calculated accordingly.

بحث

مطالعات فراوانی روی استرپتوکیناز و داروهای ترومبولیتیک دیگر در جهت افزایش اختصاصیت آن ها به فیبرین انجام شده است (Banerjee et al.,2004؛ Reed et al.,1999؛ Sazonova et al.,  (2004)؛ Wong et al.,1994). مطالعات نشان می دهند که حذف 59 اسید آمینه انتهای آمینی باعث می شود که استرپتوکیناز تبدیل به یک پروتئین اختصاصی نسبت به فیبرین شود (Reed et al., 1999؛ Sazonova et al.,  2004). از طرفی همانطور که قبلا اشاره گردید گزارش  شده است که ناحیه 414-387 تاثیری در فعالیت استرپتوکیناز ندارد. به همین منظور در این تحقیق سعی بر تولید پروتئین های کوتاه شده SK60-386 و SK143-386 به صورت نوترکیب گردید تا امکان دستیابی به پروتئین استرپتوکیناز با اثرات آلرژیک و نیز عوارض هموراژیک کمتر فراهم گردد.

نتایج این تحقیق نشان داد که مولکول های کوتاه شده استرپتوکیناز در وکتور pQE30، علی رغم استفاده از غلظت های مختلف IPTG بیان نشده و یا به مقدار بسیار ناچیزی بیان شده به طوری که قابل ردیابی نبودند. به طور کلی، بیان مولکول های کوتاه شده مشکل می باشد (Reed et al., 1999؛ Sazonova et al.,  2004)، در حالی که دلیل این موضوع کاملا مشخص نشده است، احتمال ایجاد ساختار های ثانویه در ناحیه ترجمه و اثر مهاری آنها بر حرکت ریبوزوم ها در این رابطه مطرح می باشد (Anonymous 2003). برای بهبود شرایط بیان از وکتورpET41a استفاده شد که بعد از کدون شروع و قبل از جایگاه چندگانه کلونینگ (MCS) آن سه برچسب GST-tag، His-tag و S-tag قرار دارد (شکل 1). احتمالا بیان این برچسب ها قبل از پروتئین های کوتاه شده از ایجاد ساختار های ثانویه در شروع ترجمه جلوگیری کرده و باعث بیان مناسب آن ها شدند.

در بررسی های اولیه فعالیت زیستی پروتئین های کوتاه شده و کامل با استفاده از روش کازئینولیز مشخص گردید که همه پروتئین ها، با وجود سه برچسب اضافی، که باعث افزایش 32 کیلودالتون در وزن پروتئین ها می شد، فعال بودند. همچنین استفاده از اوره 8 مولار در فرایند تخلیص با ستون جذبی Ni-NTA agarose، که یک دناتوره کننده قوی برای پروتئین ها می باشد، مانع از فعالیت انواع مختلف استرپتوکیناز نگردید، بطوری که پروتئین های کوتاه شده و کامل (حاصل از سازه pQESK414 و pETSK414 ) در روش کازئینولیز، فعالیت قابل توجهی نسبت به استرپتوکیناز استاندارد داشتند (شکل 3).  به این ترتیب این یافته به خوبی نشان داد که استرپتوکیناز یک پروتئین بسیار انعطاف پذیر در برابر تغییرات ساختمانی و همچنین شرایط محیطی می باشد.

ارزیابی فعالیت به روش کمی کروموژنیک نشان داد که استرپتوکیناز کامل دارای سه برچسب (به دست آمده از وکتور pETSK414)، نسبت به استرپتوکیناز دارای یک برچسب (به دست آمده از pQESK414)، به ازای هر میکروگرم فعالیت کمتری دارد. در حالی که، به ازای هر مول فعالیت بیشتری را نشان می دهد (جدول2). این تفاوت احتمالا به دلیل بزرگتر بودن پروتئین GST.His(6).S.SK (79 کیلو دالتون) نسبت به پروتئین (His)6.SK (47 کیلو دالتون) می باشد، یعنی به نسبت افزایش وزن که حاصل از برچسب های اضافی هستند، فعالیت بیشتری مشاهده نشد که این منطقی به نظر می رسد. اما، پروتئین های کوتاه شده SK60-386  و SK143-386  نسبت به SK1-414 حاصل از pQESK414 به ازای هر میکروگرم به ترتیب کاهش فعالیت 85 و 90 درصدی داشتند (جدول 2). همچنین این پروتئین ها به ازای هر میکرومول به ترتیب کاهش 83 و 91 درصدی داشتند (جدول2). این یافته ها در تائید مطالعات قبلی (Reed et al., 1999؛ Sazonova et al.,  2004)نشان می دهد که حذف 59 و 142 اسید آمینه ابتدایی، باعث کاهش شدید فعالیت در روش کروموژنیک می گردد. از طرفی، با مقایسهSK60-414   و  SK1-414 نشان داده شد که در حضور فیبرین کاهش فعالیتی که در روش کرموژنیک دیده می شود وجود نخواهد داشت (Reed et al., 1999؛ Sazonova et al.,  2004). بنابراین، انتظار می رود که فعالیت پروتئین های SK60-386 و SK143-386 حاصل از این تحقیق  نیز در حضور فیبرین افزایش داشته باشد که در مطالعات بعدی به این موضوع و مقایسه خواص آنتی ژنیک پروتئین های کوتاه شده و کامل پرداخته خواهد شد.

نتایج این مطالعه نشان داد که بر اساس طراحی صورت گرفته پروتئین های کوتاه شده استرپتوکیناز (SK60-386 و SK143-386) در پلاسمید pET41a به خوبی کلون و بیان شده و به واسطه اتصال برچسب هیستیدینی به راحتی قابل تخلیص می باشند. همچنین همانطور که انتظار می رفت، در روش کروموژنیک این پروتئین ها نسبت به پروتئین کامل افت فعالیت بیولوژیک را نشان دادند. به دنبال این پژوهش، مطالعات در راستای بررسی فعالیت پروتئین های کوتاه شده مذکور در حضور رشته های فیبرین و نیز تاثیر حذف قطعات 59-1، 142-1 و 414-386 بر کاهش آنتی ژنیسیته پروتئین در دست انجام است.