مقایسه فعالیت احیایی سه ایزوفرم‌ تیوردوکسین گیاه برنج (Oryza sativa) در واکنش با انسولین

نوع مقاله : مقاله پژوهشی

نویسندگان

1 کارشناس ارشد بیوتکنولوژی کشاورزی، گروه بیوتکنولوژی کشاورزی، دانشکده کشاورزی، دانشگاه صنعتی اصفهان

2 استادیار گروه بیوتکنولوژی کشاورزی، دانشکده کشاورزی، دانشگاه صنعتی اصفهان

چکیده

تیوردوکسین‌ها (Trxs) پروتئین‌هایی با وزن مولکولی 14-12 کیلودالتون هستند که با داشتن یک گروه تیول-دی سولفید در جایگاه فعالشان (WCG/PPC)، در احیاء برگشت‌پذیر پیوندهای دی‌سولفیدی نقش دارند. ایزوفرم‌های مختلفی از Trx در گیاهان وجود دارند. ایزوفرم‌های f، m، x و y در کلروپلاست، ایزوفرم o در میتوکندری و ایزوفرم h در سیتوزول یافت می شوند. Trx h دارای اهمیت اساسی در رشد و نمو گیاه است. در پژوهش حاضر، توالی ژن های کد کننده‌ی سه ایزوفرم Trx h از گیاه برنج، با نام های OsTrx1، OsTrx20 و OsTrx23 جداسازی و همسانه سازی شدند. جهت تولید پروتئین نوترکیب، ژن ها در پلاسمید بیانی pET-15b، همسانه سازی و سپس به سویه‌ی مناسبی از باکتری  اشریشیا کلی به نام Rosetta (DE3) منتقل شدند. با تحریک پروموتر T7 به وسیله­ی IPTG، میزان مناسبی از پروتئین‌های نوترکیب تولید و با استفاده از روش کروماتوگرافی جذبی خالص‌سازی شدند. فعالیت احیایی سه ایزوفرم نوترکیب تولید شده با استفاده از انسولین به عنوان سوبسترای الکترون گیرنده و DTT به عنوان عامل احیا کننده اولیه مورد مقایسه قرار گرفت. هر سه ایزوفرم نوترکیب تولید شده فعال و قادر به احیای انسولین بودند. با این حال سرعت احیای انسولین در واکنش ها کاملا متفاوت بود که می تواند منعکس کننده تفاوت در فعالیت این ایزوفرم‌ها در گیاه و در نتیجه احتمال تفاوت در نقش آن ها  نیز باشد

کلیدواژه‌ها


عنوان مقاله [English]

Comparison of Reduction Activity of three Rice (Oryza sativa) Thioredoxin Isoforms in Reaction with Insulin

نویسندگان [English]

  • zahra popzan 1
  • Azar SHahpiri 2
1
2
چکیده [English]

Thioredoxins (Trxs) are ubiquitous, low-molecular-mass proteins with two cysteins in their active site WC(G/P)PC which are involved in reversible reduction of disulfide bonds. Plants contain several forms of Trxs. Thioredoxin f, m, x and y are found in the chloroplast, Trxo is localized in mitochondria and Trxh is typically cytosolic. Trxh isoforms play important roles in plants development. In this study, we describe isolation and cloning of three cDNAs encoding different Trx h isoforms, stated OsTrx1, OsTrx20 and OsTrx23. Three Trx h were heterologously expressed in Rosetta (DE3) - a strain of Escherichia coli. After inducing T7 promoter with IPTG, proper amount of recombinant proteins were produced. The recombinant proteins were purified by affinity chromatography. The recombinant Trxh isoforms were analyzed for their ability to reduce Insulin – an electron receptor substrate for Trxs- and DTT, as a primary reducing agent. All three isoforms were active, but the rate of reduction varied among different reactions. The existence of observed variations can reveal different functions for thioredoxins in plant system.
 

کلیدواژه‌ها [English]

  • : Rice
  • Thioredoxin
  • cloning
  • Heterologous protein expression
  • Insulin
  • Reduction activity

: Rice, Thioredoxin, Cloning, Heterologous protein expression, Insulin, Reduction activity.  

Alkhalfioui F, Renard M, William HV, Wong J, Charlene KT, William JH, Buchanan BB, Montrichard F (2007). Thioredoxin-linked proteins are reduced during germination of medicago truncatula seeds. Plant Physiology 144: 1559–1579.
Besse I, Wong JH, Kobrehel K, Buchanan BB (1996). Thiocalsin: a thioredoxin-linked, substrate-specific protease dependent on calcium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 93: 3169-3175.
Bréhélin C, Laloi C, Setterdahl AT, Knaff DB, Meyer Y (2004). Cytosolic, mitochondrial thioredoxins and thioredoxin reductases in Arabidopsis thaliana. Photosynthesis Research 79: 295-304.
Buchanan BB, Balmer Y (2005). Redox regulation: A broadening horizon. Annual Review of Plant Biology 56: 187-220.
Cazalis R, Pulido P, Aussenac T, Pérez-Ruiz JM, Cejudo FJ (2006). Cloning and characterization of three thioredoxin h isoforms from wheat showing differential expression in seeds. Journal of Experimental Botany 57: 2165-2172.
Gelhaye E, Rouhier N, Vlamis-Gardikas A, Girardet JM, Sautie`re PE, Sayzet M, Martin F, Jacquot JP (2003). Identification and characterization of a third thioredoxin h in poplar. Plant Physiology and Biochemistry 41: 629–635.
Gelhaye E, Rouhier N, Jacquot JP (2004). The thioredoxin h system of higher plants.  Plant Physiology and Biochemistry 42: 265-271.
Hirasawa M, Schürmann P, Jacquot JP, Manieri W, Jacquot P, Keryer E, Hartman FC, Knaff DB (1999). Oxidation-reduction properties of chloroplast thioredoxins, ferredoxin:thioredoxin reductase, and thioredoxin f-regulated enzymes. Biochemistry 38: 5200-5205.
Holmgren A (1979). Thioredoxin catalyzes the reduction of insulin disulfides by dithiothreitol and dihydrolipoamide The Journal of Biological Chemistry 254: 9627-9632.
Ishiwatari Y, Honda C, Kawashima I, Nakamura S, Hirano H, Mori S, Fujiwara T, Hayashi H, Chino M (1995). Thioredoxin h is one of the major proteins in rice phloem sap. Planta 195: 456-463.
Kobrehel K, Yee BC, Buchanan BB (1991). Role of the NADP/thioredoxin system in the reduction of alpha-amylase and trypsin inhibitor proteins. The Journal of Biological Chemistry 266: 16135-16140.
Kobrehel K, Wong JH, Balogh A, Kiss F, Yee BC, Buchanan BB (1992). Specific reduction of wheat storage proteins by thioredoxin h. Plant Physiology 99: 919-924.
Lozano RM, Wong JH, Yee BC, Peters A, Kobrehel K, Buchanan BB (1996). New evidence for a role for thioredoxin h in germination and seedling development. Planta 200: 100-106.
Maeda K, Finnie C, Østergaard O, Svensson B (2003). Identification, cloning and characterization of two  thioredoxin h isoforms, HvTrxh1 and HvTrxh2, from the barley seed proteome. . European Journal of Biochemistry 270: 2633-2643.
Meyer Y, Vignols F, Reichheld JP (2002). Classification of plant thioredoxins by sequence similarity and intron position. Methods in Enzymology 347: 394-402.
Meyer Y, Reichheld JP, Vignols F (2005). Thioredoxins in Arabidopsis and other plants. Photosynthesis Research 86: 419-433.
Montrichard F, Alkhalfioui F, Yano H, Vensel WH, Hurkman WJ, Buchanan BB (2009). Thioredoxin targets in plants: the first 30 years. Journal of proteomics 72: 452-474.
Mouaheb N, Thomas D, Verdoucq L, Monfort P, Meyer Y (1998). In vivo functional discrimination between plant thioredoxins by heterologous expression in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 95: 3312-3317.
Nuruzzaman M, Gupta M, Zhang Ch, Wang L, Xie L, Xiong L, Zhang Q, Lian X (2008). Sequence and expression analysis of the thioredoxin protein gene family in rice. Molecular Genetics & Genomics 280: 139-151.
Renard M, Alkhalfioui F, Schmitt-Keichinger C, Ritzenthaler C, Montrichard F (2011). Identification and characterization of thioredoxin h isoforms differentially expressed in germinating seeds of the model legume Medicago truncatula. Plant Physiology 155: 1113-1126.
Schürmann P, Jacquot JP (2000). Plant thioredoxin system revisited. Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology 51: 371-400.
Shahpiri A, Svensson B, Finnie Ch (2009). From proteomics to structural studies of cytosolic/mitochondrial-type thioredoxin systems in barley seeds. Molecular Plant 1-12.
Shahpiri A, Svensson B, Finnie Ch (2008). TheNADPH-Dependent Thioredoxin Reductase/Thioredoxin System in Germinating Barley Seeds: Gene Expression, Protein Profiles, and Interactions between Isoforms of Thioredoxin h and Thioredoxin Reductase. Plant  Physiology 146: 789–799.
Xie G, Kato H, Sasaki K, Ryozo I (2009). A cold-induced thioredoxin h of rice, OsTrx23, negatively regulates kinase activities of OsMPK3 and OsMPK6 in vitro. FEBS letter 583: 2734–2738.