طراحی، ساخت و انتقال سازه بیانی واجد sgRNA به منظور ایجاد جهش هدفمند در ژن (1،3)-α فوکوزیل ترانسفراز در گیاه عدسک آبی با استفاده سیستم کریسپر

نوع مقاله : مقاله پژوهشی

نویسندگان

1 دانشجو دکتری بیوتکنولوژی کشاورزی، پژوهشکده بیوتکنولوژی کشاورزی، گروه زیست فرآورده‌های گیاهی، پژوهشگاه ملی مهندسی ژنتیک و زیست

2 استاد، پژوهشکده بیوتکنولوژی کشاورزی، گروه زیست فرآورده‌های گیاهی، پژوهشگاه ملی مهندسی ژنتیک و زیست فناوری، تهران، ایران

3 استادیار، پژوهشکده بیوتکنولوژی کشاورزی، گروه زیست فرآورده‌های گیاهی، پژوهشگاه ملی مهندسی ژنتیک و زیست فناوری، تهران، ایران

چکیده

هدف: گیاه عدسک آبی (Lemna minor) به‌دلیل رشد سریع، ساختار ساده و قابلیت کشت آسان، به‌عنوان یک میزبان گیاهی نوظهور برای تولید پروتئین‌های نوترکیب انسانی مورد توجه قرار گرفته است. با این حال، تفاوت‌های موجود در مسیر-N گلیکوزیلاسیون بین گیاهان و انسان، به‌ویژه حضور قندهای گیاهی مانند (1،3)- αفوکوز، محدودیتی اساسی در کاربرد این سیستم برای تولید تجاری پروتئین‌های نوترکیب انسانی در کشاورزی مولکولی ایجاد می‌کند. در این پژوهش، به‌منظور حذف این قند گیاهی، ژن رمز کننده آنزیم (1،3)-α فوکوزیل ترانسفراز (FucT) در گیاه L. minor با استفاده از سامانه ویرایش ژنومی CRISPR/Cas9 هدف قرار گرفت.
مواد و روش: به‌منظور ایجاد جهش هدفمند در ژن FucTدر گیاه L. minor ابتدا توالی ژن هدف از پایگاه‌های داده استخراج و با استفاده از PCR و توالی‌یابی، ناحیه مورد نظر در L. minor بومی ایران شناسایی و تأیید شد. سپس sgRNA با کمک ابزارهای بیوانفورماتیکی طراحی و به صورت الیگونوکلئوتیدهای پیشرو و معکوس مکمل سنتز شد. الیگونوکلئوتیدهای پیش ساز پس از واکنش اتصال و تشکیل سختار دو رشته ای در پلاسمید pRGEB32 همسانه‌سازی و سازه نوترکیب ابتدا به باکتری E. Coli و سپس به Agrobacterium tumefaciens منتقل شد. تراریختی گیاه عدسک آبی با استفاده از آگروباکتریوم انجام گرفت. در نهایت، تأیید انتقال سازه و آنالیز جهش‌های ایجاد شده در ناحیه هدف ژن FucT از طریق PCR و تعیین توالی انجام شد.
نتایج: فرآیند باززایی لاین‌های احتمالی تراریخت عدسک آبی، ۶ تا ۸ هفته پس از انتقال ژن به‌واسطه‌ی A. tumefaciens با موفقیت انجام شد. تجزیه‌ و تحلیل توالی ناحیه هدف ویرایش در گیاهان دست‌ورزی شده ژنتیکی، با استفاده ازPCR ، توالی‌یابی و انجام آنالیزهای بیوانفورماتیکی، وقوع انواع جهش‌های حذف و درج نوکلئوتیدی (INDELs) را در ژنFucT تأیید کرد. آنالیزهای دقیق کروماتوگرام‌ها نشان داد که سامانه CRISPR/Cas9 موجب القای جهش‌های دوآللی (biallelic) و کایمریک در برخی از گیاهان شده است.
نتیجه گیری: نتایج این پژوهش نشان داد که سیستم CRISPR/Cas9 توانسته است در محل مورد نظر از ژن FucT گیاه عدسک آبی، جهش‌ ایجاد کند. لاین‌های ویرایش شده فنوتیپ بارزی را از خود نشان ندادند .اگرچه وقوع جهش‌های ژنومی در ناحیه هدف با توالی‌یابی تأیید گردید، اما اثبات قطعی خاموشی کامل ژنFucT و تغییر در الگوی گلیکوزیلاسیون، مستلزم آنالیزهای تکمیلی در سطح پروتئین و گلیکان در مطالعات آینده است.

کلیدواژه‌ها

عنوان مقاله [English]

Design, Construction, and Delivery of an sgRNA Expression Cassette for Targeted Mutagenesis of α-1,3-fucosyltransferase Gene in Lemna minor Using the CRISPR/Cas9 System

نویسندگان [English]

  • Sadegh Shojaei Baghini 1
  • Ali Hatef Salmanian 2
  • Elham Taghipour 1
  • Nima Rad 1
  • Kasra Esfahani 3
1 PhD candidate of plant biotechnology, Department of Agricultural Biotechnology, Plant Bioproducts Department, National Institute of Genetic Engineering and Biotechnology, Tehran, Iran
2 Professor, Department of Agricultural Biotechnology, Plant Bioproducts Department, National Institute of Genetic Engineering and Biotechnology, Tehran, Iran
3 Assistant Professor, Department of Agricultural Biotechnology, Plant Bioproducts Department, National Institute of Genetic Engineering and Biotechnology, Tehran, Iran
چکیده [English]

Objective
Lemna minor has attracted attention as a promising plant platform for the production of recombinant human proteins due to its rapid growth, simple morphology and easy cultivation. However, the inherent differences in N-glycosylation pathways between plants and humans, particularly the presence of plant-specific sugar residues such as α-(1,3)-fucose, pose a major limitation to the commercial use of this system for the production of human recombinant proteins. In this study, to eliminate this plant-specific sugar, the gene encoding the α-(1,3)-fucosyltransferase (FucT) in L. minor was targeted for knock out using the CRISPR/Cas9 genome editing system.
Materials and methods
To induce targeted mutations in the FucT gene in L. minor, the sequence of the target gene was retrieved from databases and validated in Iranian native L. minor using PCR and sequencing. The sgRNA was designed using bioinformatics tools and synthesized as complementary forward and reverse oligonucleotides. After annealing and formation of the double-stranded structure, the sgRNA was cloned into the pRGEB32 plasmid. The recombinant construct was transferred into Agrobacterium tumefaciens. Transgenic L. minor lines were generated by Agrobacterium-mediated transformation. The successful transfer of the construct and the induction of mutations at the target site in the FucT gene were confirmed by PCR amplification and validated by DNA sequencing analysis.
Results
Putative transgenic lines of L. minor were successfully regenerated 6 to 8 weeks after transformation mediated by A. tumefaciens. Sequence analysis of the edited target regions in the genetically modified plants was analyzed by PCR amplification, Sanger sequencing and bioinformatic tools to detect and characterize nucleotide insertions and deletions (INDELs). Analysis of the sequence chromatograms showed that biallelic and chimeric mutations were induced in some of the plants.
Conclusions
The CRISPR/Cas9 system induced mutations in the FucT gene of L. minor. The edited lines showed no obvious phenotype. Although genomic mutations at the target site were confirmed by sequencing, conclusive proof of complete knockout of the FucT gene and changes in the glycosylation pattern requires further analyses at the protein and glycan levels in future studies.

کلیدواژه‌ها [English]

  • CRISPR/Cas9
  • N-glycosylation
  • α-1
  • 3-fucosyltransferase

مراجع

Asmamaw, M., & Zawdie, B. (2021). Mechanism and applications of CRISPR/Cas-9-mediated genome editing. Biologics: targets and therapy, 353–361. https://doi.org/10.2147/BTT.S326422
Bae, S., Park, J., & Kim, J.-S. (2014). Cas-OFFinder: a fast and versatile algorithm that searches for potential off-target sites of Cas9 RNA-guided endonucleases. Bioinformatics, 30(10), 1473–1475. https://doi.org/10.1093/bioinformatics/btu048
Bosch, D., Castilho, A., Loos, A., Schots, A., & Steinkellner, H. (2013). N-glycosylation of plant-produced recombinant proteins. Current pharmaceutical design, 19(31), 5503–5512. https://doi.org/10.2174/1381612811319310006
Concordet, J.-P., & Haeussler, M. (2018). CRISPOR: intuitive guide selection for CRISPR/Cas9 genome editing experiments and screens. Nucleic acids research, 46(W1), W242–W245. https://doi.org/10.1093/nar/gky354
 Dicker, M., & Strasser, R. (2015). Using glyco-engineering to produce therapeutic proteins. Expert opinion on biological therapy, 15(10), 1501–1516. https://doi.org/10.1517/14712598.2015.1069271
Fu, Y., Foden, J. A., Khayter, C., Maeder, M. L., Reyon, D., Joung, J. K., & Sander, J. D. (2013). High-frequency off-target mutagenesis induced by CRISPR-Cas nucleases in human cells. Nature biotechnology, 31(9), 822–826. https://doi.org/10.1038/nbt.2623
Göritzer, K., Grandits, M., Grünwald-Gruber, C., Figl, R., Mercx, S., Navarre, C., Ma, J. K., & Teh, A. Y. (2022). Engineering the N-glycosylation pathway of Nicotiana tabacum for molecular pharming using CRISPR/Cas9. Frontiers in Plant Science, 13, 1003065.  https://doi.org/10.3389/fpls.2022.1003065
Green, M. R., & Sambrook, J. (2020). Polyacrylamide Gel Electrophoresis. Cold Spring Harb Protoc, 2020(12). https://doi.org/10.1101/pdb.prot100412
 Hanania, U., Ariel, T., Tekoah, Y., Fux, L., Sheva, M., Gubbay, Y., Weiss, M., Oz, D., Azulay, Y., & Turbovski, A. (2017). Establishment of a tobacco BY2 cell line devoid of plant‐specific xylose and fucose as a platform for the production of biotherapeutic proteins. Plant biotechnology journal, 15(9), 1120–1129. https://doi.org/10.1111/pbi.12702
Harmoko, R., Yoo, J. Y., Ko, K. S., Ramasamy, N. K., Hwang, B. Y., Lee, E. J., Kim, H. S., Lee, K. J., Oh, D. B., & Kim, D. Y. (2016). N‐glycan containing a core α1, 3‐fucose residue is required for basipetal auxin transport and gravitropic response in rice (Oryza sativa). New Phytologist, 212(1), 108–122. https://doi.org/10.1111/nph.14031
Heenatigala, P., & Hou, H. (2024). Duckweed, an Efficient Green Bio-Factory for the Production of Recombinant Proteins. Applications of Plant Molecular Farming, 613–630. https://doi.org/10.1007/978-981-97-0176-6_22
Holsters, M., De Waele, D., Depicker, A., Messens, E., Van Montagu, M., & Schell, J. (1978). Transfection and transformation of Agrobacterium tumefaciens. Molecular and General Genetics MGG, 163(2), 181–187. https://doi.org/10.1007/BF00267408
Kazemipour, E., Sasan, H., Mohammadabadi, M. (2025). The effect of the intrinsic resistance of Shigella flexneri 2a to spectinomycin on the efficiency of the CRISPR/Cas9 system. Agricultural Biotechnology Journal, 17(3), 177-200. https://doi.org/10.22103/jab.2025.25382.1717
Liu, Y., Wang, Y., Xu, S., Tang, X., Zhao, J., Yu, C., He, G., Xu, H., Wang, S., & Tang, Y. (2019). Efficient genetic transformation and CRISPR/Cas9‐mediated genome editing in Lemna aequinoctialis. Plant biotechnology journal, 17(11), 2143–2152. https://doi.org/10.1111/pbi.13128
Lodhi, M. A., Ye, G.-N., Weeden, N. F., & Reisch, B. I. (1994). A simple and efficient method for DNA extraction from grapevine cultivars and Vitis species. Plant molecular biology Reporter, 12(1), 6–13. https://doi.org/10.1007/BF02668658
Mammedov, T., & Gun, N. (2022). Post-translational modifications of recombinant proteins produced in plants: review. MedScience, 5, 154–161. https://doi.org/10.5455/medscience.2021.07.242
Mercx, S., Smargiasso, N., Chaumont, F., De Pauw, E., Boutry, M., & Navarre, C. (2017). Inactivation of the β (1, 2)-xylosyltransferase and the α (1, 3)-fucosyltransferase genes in Nicotiana tabacum BY-2 cells by a multiplex CRISPR/Cas9 strategy results in glycoproteins without plant-specific glycans. Frontiers in Plant Science, 8, 403. https://doi.org/10.3389/fpls.2017.00403
Park, J., Bae, S., & Kim, J.-S. (2015). Cas-Designer: a web-based tool for choice of CRISPR-Cas9 target sites. Bioinformatics, 31(24), 4014–4016. https://doi.org/10.1093/bioinformatics/btv537
Pasos-Panqueva, J., Baker, A., & Camargo-Valero, M. A. (2024). Unravelling the impact of light, temperature and nutrient dynamics on duckweed growth: A meta-analysis study. Journal of environmental management, 366, 121721. https://doi.org/10.1016/j.jenvman.2024.121721
Paysan-Lafosse, T., Blum, M., Chuguransky, S., Grego, T., Pinto, B. L., Salazar, G. A., Bileschi, M. L., Bork, P., Bridge, A., & Colwell, L. (2023). InterPro in 2022. Nucleic acids research, 51(D1), D418–D427. https://doi.org/10.1093/nar/gkac993
Rausch, T., Fritz, M. H.-Y., Untergasser, A., & Benes, V. (2020). Tracy: basecalling, alignment, assembly and deconvolution of sanger chromatogram trace files. BMC genomics, 21(1), 230. https://doi.org/10.1186/s12864-020-6635-8
Reuter, J. S., & Mathews, D. H. (2010). RNAstructure: software for RNA secondary structure prediction and analysis. BMC bioinformatics, 11(1), 129. https://doi.org/10.1186/1471-2105-11-129
Sambrook, J., & Russell, D. W. (2001). Detection of DNA in agarose gels. Molecular cloning, a laboratory manual, 5–14.
Sim, J.-S., Kesawat, M. S., Kumar, M., Kim, S.-Y., Mani, V., Subramanian, P., Park, S., Lee, C.-M., Kim, S.-R., & Hahn, B.-S. (2018). Lack of the α1, 3-Fucosyltransferase gene (Osfuct) affects anther development and pollen viability in rice. International Journal of Molecular Sciences, 19(4), 1225. https://doi.org/10.3390/ijms19041225
Sosa, D., Alves, F. M., Prieto, M. A., Pedrosa, M. C., Heleno, S. A., Barros, L., Feliciano, M., & Carocho, M. (2024). Lemna minor: Unlocking the value of this duckweed for the food and feed industry. Foods, 13(10), 1435. https://doi.org/10.3390/foods13101435
Sree, K. S., Bog, M., & Appenroth, K.-J. (2016). Taxonomy of duckweeds (Lemnaceae), potential new crop plants. Emirates Journal of Food & Agriculture (EJFA), 28(5). https://doi.org/10.9755/ejfa.2016-01-038
 Strasser, R. (2022). Recent developments in deciphering the biological role of plant complex N-glycans. Frontiers in Plant Science, 13, 897549. https://doi.org/10.3389/fpls.2022.897549
Strasser, R., Stadlmann, J., Schähs, M., Stiegler, G., Quendler, H., Mach, L., Glössl, J., Weterings, K., Pabst, M., & Steinkellner, H. (2008). Generation of glyco‐engineered Nicotiana benthamiana for the production of monoclonal antibodies with a homogeneous human‐like N‐glycan structure. Plant biotechnology journal, 6(4), 392–402. https://doi.org/10.1111/j.1467-7652.2008.00330.x
Taghipour, E., Bog, M., Frootan, F., Shojaei, S., Rad, N., Arezoumandi, M., Jafari, M., & Salmanian, A. H. (2022). DNA barcoding and biomass accumulation rates of native Iranian duckweed species for biotechnological applications. Frontiers in Plant Science, 13, 1034238. https://doi.org/10.3389/fpls.2022.1034238
Taghipour, E., Rad, N., Shojaei, S., Arezoumandi, M., Frootan, F., Yaghoubi, S., Jafari, M., & Salmanian, A. H. (2025). The Effect of culture conditions and medium on the in-vitro cultivation of three species of duckweed native to Iran as a plant with biotechnological applications. Journal of Plant Research (Iranian Journal of Biology), 38(4), 405–420. https:// doi: 10.22034/jpr.2024.8458.3356
Xie, K., & Yang, Y. (2013). RNA-guided genome editing in plants using a CRISPR–Cas system. Molecular plant, 6(6), 1975–1983. https://doi.org/10.1093/mp/sst119
Yang, G.-L., Feng, D., Liu, Y.-T., Lv, S.-M., Zheng, M.-M., & Tan, A.-J. (2021). Research progress of a potential bioreactor: duckweed. Biomolecules, 11(1), 93. https://doi.org/10.3390/biom11010093
Zhang, X.-H., Tee, L. Y., Wang, X.-G., Huang, Q.-S., & Yang, S.-H. (2015). Off-target effects in CRISPR/Cas9-mediated genome engineering. Molecular therapy Nucleic acids, 4. https://doi.org/10.1038/mtna.2015.37
مجله بیوتکنولوژی کشاورزی
دوره 18، شماره 2
خرداد 1405
صفحه 135-156

فایل ها

هم رسانی

ارجاع به این مقاله

آمار