بررسی میزان کالوس¬زایی و باززایی گلرنگ (Carthamus tinctorius L.) با استفاده از کشت قطعات هیپوکوتیل و کوتیلدون

بررسی میزان کالوس­زایی و باززایی گلرنگ (Carthamus tinctorius L.) با استفاده از کشت قطعات هیپوکوتیل و کوتیلدون

جواد معتمدی^1و2، علیرضا زبرجدی* ^3و4 ، دانیال کهریزی^3و4 ،  علی­هاتف سلمانیان⁵ و ژاله سهیلی­خواه⁶ 

¹دانشجوی کارشناسی ارشد اصلاح نباتات، گروه زراعت و اصلاح نباتات، دانشکده کشاورزی، دانشگاه رازی کرمانشاه

²دانشگاه آزاد اسلامی، واحد کرمانشاه، باشگاه پژوهشگران جوان،  کرمانشاه، ایران

³ استادیار گروه زراعت و اصلاح نباتات، دانشکده کشاورزی، دانشگاه رازی کرمانشاه

⁴ استادیار گروه پژوهشی بیوتکنولوژی مقاومت به خشکی، دانشگاه رازی کرمانشاه

⁵ دانشیار پژوهشگاه ملی تحقیقات مهندسی ژنتیک و زیست فن­آوری، تهران

⁶ کارشناس ارشد زیست شناسی، دانشکده علوم، دانشگاه رازی کرمانشاه

چکیده

گیاهان روغنی بعد از غلات، به عنوان دومین منبع تامین­کننده کالری برای جوامع بشری محسوب می­شوند. گیاه گلرنگ به دلیل داشتن روغنی با کیفیت و محتوای بالای اسید­های چرب، مورد توجه
می­باشد. به منظور بهینه­سازی کشت بافت گلرنگ، آزمایشی به­صورت فاکتوریل در قالب طرح کاملاً تصادفی در سه تکرار، طی سال­های 88-87 انجام گرفت. در این آزمایش، صفات کالوس­زایی و باززایی نوساقه ریزنمونه­های کوتیلدون و هیپوکوتیل ارقام Dincer و سینا در غلظت­های مختلف هورمون­های NAA و BAP روی محیط پایه MS، مورد بررسی قرار گرفت. بررسی اثرات متقابل در خصوص صفات فوق نشان داد که ارقام مورد بررسی در این آزمایش در واکنش به هورمون NAA به طور مستقل عمل کرده­اند. مقایسه میانگین­ها برای صفت کالوس­زایی نشان داد که بهترین محیط­ها برای کالوس­زایی ریزنمونه­ها که بیشترین درصد تولید کالوس را داشته­اند ترکیبات (BAP 5/0 و NAA 5/0) میلی­گرم در لیتر و (BAP 1 و NAA 1) میلی­گرم در لیتر به­ترتیب با میانگین­های 33/94 و 97 درصد بوده است. علاوه بر این، رقم Dincer و ریزنمونه هیپوکوتیل واکنش بهتری را نسبت به کالوس­زایی از خود بروز داده­اند. در خصوص صفت باززایی، بیشترین درصد باززایی در ترکیب (BAP 2 و NAA 1/0) به میزان 07/35 درصد، در رقم Dincer و ریزنمونه کوتیلدون به­دست آمد.

واژه های کلیدی: گلرنگ، کالوس­زایی، باززایی، ریزنمونه، کشت بافت

مقدمه

گلرنگ (Carthamus tinctorius L.) گیاهی روغنی از خانواده Asteracea است. اهمیت گیاه گلرنگ به دلیل روغن استحصال شده از آن است زیرا دارای درصد بالایی از اسید­های چرب غیراشباع تک زنجیره و چند زنجیره مانند اولئیک اسید و لینولئیک اسید همراه با سطوح بالای آلفا توکوفرول[1] (بیش از 400 میلی گرم در هر کیلوگرم بذر) است (Singh and Nimbkar, 2006). گلرنگ به عنوان مهم­ترین نمونه از یک گیاه زراعی با تنوع در اسیدهای چرب شناخته شده است (Knowles, 1989). سطح زیر کشت گلرنگ در سال 2008 در دنیا 735918 هکتار با عملکرد 2/845 کیلوگرم در هکتار گزارش شده است، در حالی­که در ایران سطح زیر کشت در سال 2008 حدود 1000 هکتار با میانگین عملکرد 500 کیلوگرم در هکتار بوده است (FAO, 2008). در این زمینه، گیاه گلرنگ پتانسیل زیادی برای ایجاد تغییرات ژنتیکی و القاء صفات مطلوب از طریق سیستم­های کشت بافت دارد و دستورالعمل­های ابداع شده برای آن ساده، سریع و کارآمد بوده و امکان باززایی از بافت­های رویشی را همانند بافت­های زایشی از طریق اندام­زایی و جنین­زایی سوماتیکی به وجود آورده است (Sujatha, 2002). در گلرنگ، فراوانی تغییرات ایجاد شده در محیط کشت در کشت­های سوماتیکی بسیار بالا است. از این رو،  ارزیابی تنوع آندروکلونال[2] امکان پذیر شده و می­تواند در جداسازی ارقام مفید به­کار رود (Seeta et al., 2000). جداسازی لاین­هایی با برتری عملکرد 30 درصد از طریق روش­های کشت بافت در گیاه گلرنگ گزارش شده است (Sujatha, 2002). اولین گزارش در مورد کشت بافت گیاه گلرنگ توسط George and Rao (1982) منتشر شد. آنها باززایی مستقیم ریز نمونه­های مریستمی را در محیط in vitro مورد مطالعه قرار دادند. در تحقیقی دیگر، باززایی و تکثیر ارقام گلرنگ در محیط in vitro مورد مطالعه قرار گرفت (Orlikowska and Dyer, 1993). آن­ها دریافتند که بیشترین میزان تولید کالوس در غلظت 1 میلی­گرم در لیتر NAA رخ داده است و موثرترین ترکیب هورمونی جهت باززایی مستقیم، ترکیب 1/0 میلی­گرم در لیتر NAA و 1 میلی­گرم در لیتر TDZ بوده است. در مورد کالوس­زایی و باززایی مستقیم نیز، ریز نمونه کوتیلدون بهتر از برگ واکنش نشان می دهد. در سال 1999 کشت in vitro  گیاه گلرنگ به لحاظ جنبه­های مختلف مانند بهینه­سازی شرایط رشد، تکثیر و اندام­زایی از ریزنمونه­های کوتیلدون، هیپوکوتیل، ریشه و برگ رقم "Bhima" مورد مطالعه قرار گرفت (Nikam and Shitole, 1999). آن­ها مشاهده کردند که در ریز نمونه کوتیلدون، فراوانی باززایی در غلظت­های مختلف BAP نسبت به سایر ریزنمونه­ها بیشتر است. در تحقیقی دیگر، اندام­زایی مستقیم ساقه و باززایی گیاه کامل در ژنوتیپ­های مختلف گلرنگ مورد ارزیابی قرار گرفت (Mandal and Gupta, 2001). تاثیر ترکیب هورمونیTDZ  و IBA روی باززایی از ریزنمونه کوتیلدون رقم "Dincer" گلرنگ توسط Basalma et al. (2008) در شرایطin vitro ، مورد مطالعه قرار گرفت. تحقیق حاضر با هدف بهینه­سازی سیستم کشت بافت گلرنگ به منظور افزایش پدیده باززایی و عوامل مختلف تاثیرگذار بر آن جهت مطالعات بعدی در خصوص ریزازدیادی، مهندسی ژنتیک و انتقال ژن­های مطلوب به گلرنگ جهت بهبود ویژگی­های کمی و کیفی انجام شد.

مواد و روش­ها

در این پژوهش از دو رقم گلرنگ،
" Dincer"  با عملکرد بالا و بومی کشور ترکیه و رقم اصلاح شده ایرانی "سینا" استفاده گردید. به­منظور ضدعفونی بذور، ابتدا بذور گلرنگ در  اتانول 70% به­ مدت 1 دقیقه و پس از شستشو با آب مقطر به مدت 7 دقیقه در محلول کلرید جیوه (HgCl₂) 1/0 % قرار گرفتند. پس از ضد عفونی، بذور 3 الی 4 مرتبه با آب مقطر استریل در فواصل زمانی 5 دقیقه­ای، شستشو داده شدند. سپس بذور با کاغذ صافی استریل خشک شدند و روی محیط کشت MS (Murashige and Skoog, 1962) قرار گرفتند. تمامی مراحل ضدعفونی و کشت در زیر هود بیولوژیک و در شرایط استریل انجام شد. محیط کشت را در شیشه­هایی به قطر 10 سانتی­متر ریخته و به مدت 20 دقیقه در دمای 121 درجه سانتی­گراد و فشار 15 پوند بر اینچ مربع، در اتوکلاو استریل نموده که بعد از سرد شدن به صورت محیط جامد قابل استفاده می­باشند. بذور استریل گلرنگ را به تعداد 12-10 عدد در شیشه­های مذکور کشت کرده و به اتاقک رشد تحت شرایط 25 درجه سانتی گراد و شدت نور 35 (μmolm^-2s^-1) و فتوپریود (16ساعت روشنایی و 8 ساعت تاریکی)، منتقل شدند. در فاصله زمانی 10 روز، گیاهچه­هایی به طول 8-5  سانتی­متر به­دست آمدند. پس از جوانه­زنی در شرایط استریل، گیاهچه­های 10 روزه را به زیرلامینار ایرفلو منتقل نموده و ریزنمونه کوتیلدون پس از جدا شدن به روی محیط­ MS پایه حاوی غلظت­های مختلف هورمونی به­همراه ساکارز با غلظت 30 گرم در لیتر به­عنوان منبع هیدرات کربن و آگار 7 گرم در لیتر با 8/5pH  قرار داده شدند. در خصوص ریزنمونه هیپوکوتیل، از قطعات 1-5/0 سانتی­متری استفاده شد و به ­طور متوسط در هر پتری، 10 عدد ریز نمونه کشت داده شد. تمامی تیمارها پس از 14 روز در محیط مشابه واکشت شدند تا بتوانند حداکثر استفاده از مواد مغذی محیط کشت را بنمایند. کالوس­ها (جنین­زا و غیر جنین­زا) پس از 15 روز تشکیل شدند و فراوانی کالوس­زایی با شمارش تعداد ریزنمونه­های کال داده به تعداد کل ریزنمونه­های کشت شده
به­ دست آمد. نمونه­های مورد آزمایش تا زمان تشکیل نوساقه هر دو هفته یکبار به محیط مشابه منتقل و پس از 4-3 هفته نوساقه­ها بتدریج مرحله باززا شدن را از خود نشان دادند. فراوانی باززایی نوساقه با شمارش تعداد نوساقه تولید شده به تعداد ریزنمونه کشت شده در هر پتری دیش محاسبه گردید و به­طور متناوب تحت شرایط استریل به محیط کشت MS عاری از هورمون (محیط طویل شدن ساقه[3]) منتقل شدند، تا در این محیط به حداکثر رشد خود برسند. پس از 35 -45 روز، گیاهچه­هایی با طول حدود 10 سانتی­متر به دست آمدند. گیاهچه­های مذکور به منظور تولید ریشه تحت شرایط استریل به محیط کشت MS حاوی هورمون اندول بوتیریک اسید (IBA) به میزان 2 میلی­گرم در لیتر به­همراه 20 گرم در لیتر ساکارز و 7 گرم در لیتر آگار با 7=pH  منتقل شدند (محیط القاء ریشه­زایی[4]). گیاهچه­های ریشه­دار شده، به گلدان­های کوچک با خاک استریل (ترکیب یکسان پرلیت، ماسه و خاک) منتقل و تحت شرایط آزمایشگاه نگهداری شدند. تحقیق حاضر در قالب دو آزمایش جداگانه انجام شد. به ترتیبی که ابتدا در یک آزمایش، کالوس­زایی و درآزمایش دیگر میزان باززایی نوساقه­های گلرنگ بهینه گردید. برای این منظور، A (فاکتور رقم) در دو سطح (دینسر و سینا)، B (فاکتور ریزنمونه) در دو سطح (هیپوکتیل و کوتیلدون)، C (فاکتور هورمون نفتالین استیک اسید) در سه سطح و D (فاکتور هورمون 6-بنزیل آمینو پورین) در سه سطح در قالب آزمایش فاکتوریل با طرح پایه کاملاً تصادفی در 3 تکرار، بررسی شدند. جهت کالوس­زایی، ترکیب فاکتوریل هورمون­های NAA (0، 5/0 و 1) میلی­گرم در لیتر و BAP (0، 5/0 و 1) میلی­گرم در لیتر و برای باززایی نوساقه­ها ترکیب فاکتوریل هورمون­های NAA (0، 1/0 و 2/0) و BAP (0، 1 و 2) میلی­گرم در لیتر مورد استفاده قرار گرفت و تیمار (0 و 0) به­عنوان شاهد در آزمایش لحاظ گردید. تجزیه و تحلیل داده­های آزمایش با استفاده از نرم افزارهای SPSS و MSTAT-C انجام شد و قبل از انجام تجزیه واریانس نرمال بودن داده­ها مورد بررسی قرار گرفت. برای انجام آزمون مقایسه میانگین­ها از آزمون چند دامنه­ای دانکن استفاده گردید.

نتایج و بحث

نتایج تجزیه واریانس برای صفات کالوس­زایی و باززایی در جدول-1، مشاهده می­شود. این نتایج نشان می­دهد که بین عوامل اصلی یعنی ارقام، ریزنمونه­ها، هورمون NAA و هورمون BAP اختلاف معنی­داری در سطح 1 درصد برای هر دو صفت مشاهده می­شود. همچنین بررسی اثرات متقابل چندگانه حاکی از آن است که ارقام مورد بررسی در این آزمایش در واکنش به هورمون NAA به­طور مستقل عمل کرده­اند امّا تا حدودی تحت تاثیر هورمون BAP قرار گرفته­اند. با توجه به جدول تجزیه واریانس (جدول 1)، ارتباط تنگاتنگی نیز بین رقم و نوع ریزنمونه برای صفت کالوس­زایی وجود داشته است (اثر متقابل AB).

جدول 1- تجزیه واریانس برای صفات کالوس­زایی و باززایی.

          ns عدم وجود اختلاف معنی­دار،  * و ** بترتیب اختلاف معنی دار در سطح 05/0 و 01/0  

ns: Non-significant, * and **: Significant at 0.05 and 0.01 probability levels, respectively.

Table 1- Analysis of variance for callus induction and shoot regeneration of safflower.

به­علاوه، عدم ارتباط بین ارقام و ریزنمونه­ها با هورمون BAP در القاء
کالوس­زایی مشاهده می­گردد (اثر متقابل ABD). از طرفی، عامل رقم در واکنش به باززایی مستقل از هورمون NAA عمل کرده است (اثر متقابل AC). همچنین در این آزمایش اثرات متقابل دوگانه ارقام و ریزنمونه­ها با هورمون BAP برای صفت باززایی، معنی­دار شده است (اثر متقابل AD و BD) که نشان­دهنده واکنش مثبت این دو فاکتور به هورمون BAP است (جدول 1). مقایسات میانگین­ها نشان دادند که در اثرات متقابل رقم با هورمون­های مورد مطالعه، بیشترین میزان کالوس­زایی در رقم Dincer و ترکیب (BAP 1 و  NAA1) به میزان 33/94 درصد و در اثر متقابل ریزنمونه با این دو هورمون، بیشترین کالوس­زایی در ترکیب (BAP 5/0 و  NAA5/0) میلی­گرم در لیتر و ریزنمونه هیپوکوتیل به میزان 97 درصد مشاهده شده است (شکل 1 و 2). میزان تولید کالوس بستگی به ترکیب هورمون­های رشد
به­ کار رفته دارد و تعادل بین هورمون­های اکسین و سیتوکنین یک فاکتور مورفوژنیکی تعیین­کننده و مهّم به­شمار می­رود (Abbasi et al., 2007). همان­طور که مشاهده می­شود، کالوس­زایی از حاشیه­های ریزنمونه کوتیلدون و از دو طرف ریزنمونه هیپوکوتیل (محل برش) شروع گردیده است (شکل 3، الف و ب). با توجه به اینکه اثر متقابل چهار گانه (ABCD) در مورد صفت باززایی معنی دار شده بود (جدول 1)، مقایسه میانگین برای آن نشان داد که بیشترین درصد باززایی به میزان 07/35 درصد در ترکیب هورمونی (BAP 2 و NAA 1/0) میلی­گرم در لیتر، در ریزنمونه کوتیلدون و رقم Dincer رخ داده است. این تیمار اختلاف معنی­داری را با سایر ترکیبات هورمونی نشان داد. بررسی سایر تیمارها نشان داد که بهترین میزان باززایی نوساقه­ها در سطح 2 میلی­گرم در لیتر هورمون BAP و در محدوده 07/35-19/22 درصد بوده است. شکل­گیری جوانه­های اولیه تولید­کننده نوساقه پس از 2 هفته از کشت ریزنمونه­های کوتیلدون و هیپوکوتیل در
محیط­های باززایی  قابل تشخیص بود (شکل 4 الف) و پدیده باززایی کامل نوساقه­ها 4-3 هفته بعد از کشت مشاهده گردید (شکل 4 ب).

شکل 1- مقایسه میانگین اثر متقابل سه­گانه بین رقم و هورمون­های NAA و BAP در پاسخ به میزان کالوس­زایی در گیاه گلرنگ. D و S به ترتیب نشان دهنده ارقام Dincer و سینا هستند. محور افقی سطوح مختلف از غلظت­های هورمون­های NAA (ردیف بالا) و BAP (ردیف پایین) را نشان می­دهد. حروف متفاوت در بالای ستون­های نمودار نشان دهنده تفاوت معنی­دار در سطح احتمال 1٪ با استفاده آزمون چند دامنه دانکن است.

Figure 1- Mean comparison of triple interactions among cultivar, NAA and BAP phytohormones in response to callus induction in safflower. Note: D and S represent Dincer and Sina cultivars, respectively. Horizontal axis is represented different levels of NAA (above) and BAP (below) concentrations. Values within a graph followed by different letters are significantly different (P<0.01), analyzed by Duncan’s multiple range test.

القاء ریشه در ریزنمونه­های باززاشده در محیط حاوی هورمون IBA انجام شد و گیاهچه­های رشد کرده در این محیط پس از 2 هفته به گلدان­های کوچک حاوی خاک استریل منتقل شده و تحت شرایط کنترل شده نگهداری شدند. لازم بذکر است که ریشه­زایی نوساقه­های گلرنگ در محیط in vitro به سختی صورت گرفت و برای این منظور آزمایش القاء ریشه چندین بار تکرار شد اما تنها، انتقال تعداد اندکی از نوساقه­ها به محیط خاک (7-5 نوساقه) با موفقیت انجام گرفت. به­طور کلی، ارقام مورد استفاده در این تحقیق ریشه­زایی مطلوبی در محیط in vitro از خود نشان ندادند. انتخاب یک ریزنمونه در مرحله رشدی مطلوب نقش اساسی در موفقیت آمیز بودن کشت بافت در شرایط in vitro بازی می­کند (Khawar et al., 2005). پیچیدگی مورفولوژیکی یک ریزنمونه به همراه انتخاب تنظیم کننده­های رشد گیاهی مناسب تاثیر چشمگیری بر القاء کالوس و باززایی نوساقه­ها دارد (Khawar et al., 2005). هر چند که سن گیاهچه­ها و نحوه قرارگرفتن آنها روی محیط کشت نیز در برخی از گیاهان حائز اهمیت است (Nikam and Shitole, 1999). با توجه به بررسی منابع انجام شده، در کشت بافت گونه­های گلرنگ ریزنمونه­های کوتیلدون و هیپوکوتیل فراوانی کالوس­زایی و باززایی بیشتری نسبت به سایر ریزنمونه­ها از خود نشان می­دهند که با نتایج تحقیق حاضر مطابقت دارد (Sankara Rao and Rohini, 1999). در خصوص این تحقیق، ریزنمونه کوتیلدون در هر دو رقم واکنش بهتری را به کالوس­زایی و باززایی مستقیم نوساقه ها نسبت به هیپوکوتیل از خود نشان داده است. داده­های بدست آمده برای ریزنمونه­های مختلف در واکنش به کالوس­زایی نشان می­دهد که بسته به نوع ریزنمونه، غلظت تنظیم کننده­های رشد گیاهی تفاوت کرده و این امر تاثیر چشمگیری در روند کالوس­زایی و باززایی نوساقه­ها اعمال می­کند. به عنوان مثال، در ریزنمونه کوتیلدون، فراوانی باززایی در غلظت­های مختلف BAP نسبت به ریز نمونه­ هیپوکوتیل بیشتر است. در این رابطه، مطالعات متعددی وجود دارند که صحت این نتیجه را در سایر ارقام و گونه­های گلرنگ نیز تایید می­کنند (Orlikowska and Dyer, 1993; Sujatha and Suganya, 1996; Rani et al., 1996; Nikam and Shitole, 1999; Mandal and Gupta, 2001; Sujatha and Dinesh Kumar, 2007; Basalma et al., 2008). در این رابطه، Zebarjadi et al. (2006) و Salmanian and Kahrizi (2007) نیز نتایج مشابهی را در مورد گیاه کلزا مشاهده کردند. به­نظر می­رسد که ریزنمونه کوتیلدون گیاه گلرنگ از پتانسیل ارگانوژنیکی بیشتری نسبت به سایر ریزنمونه­ها برخوردار باشد. علت این امر، تا حدودی به  وجود سلول­های مریستمی تولید کننده جوانه ساقه در سطح رویی[5] کوتیلدون برمی­گردد. در واقع، تقسیمات مکرر سلول­های زیرپوستی[6] برگی اولیه منجر به تشکیل سلول­های مریستمی و متعاقب آن جوانه­های ساقه می­شوند (Mandal and Gupta, 2001). از این رو، نحوه قرارگرفتن ریزنمونه کوتیلدون و تماس مستقیم آن با محیط کشت از اهمیت خاصی برخوردار است. به عبارت دیگر، قرارگرفتن سطح پشتی[7] کوتیلدون روی محیط کشت موجب باززایی نوساقه­های اولیه از سلول­های اپیدرم سطح رویی آن
می­گردد (Mandal and Gupta, 2001; Basalma et al., 2008). علاوه بر باززایی مستقیم، پیامد مهم دیگری که با استفاده از ریزنمونه کوتیلدون به دست می­آید، امکان باززایی چندین نوساقه از یک برگ است که این موضوع در ریزازدیادی و مهندسی ژنتیک بسیار حائز اهمیت است. اما نوساقه­هایی که از کشت هیپوکوتیل ایجاد می­شوند، ابتدا مرحله
کالوس­زایی را طی کرده و سپس تولید نوساقه می­کنند (Zebarjadi et al., 2006; Salmanian and Kahrizi, 2007).

شکل 2- مقایسه میانگین اثر متقابل سه­گانه بین ریزنمونه و هورمون­های NAA و BAP در پاسخ به میزان کالوس­زایی در گیاه گلرنگ. H و C به ترتیب نشان دهنده ریزنمونه­های هیپوکوتیل و کوتیلدون هستند. محور افقی سطوح مختلف از غلظت­­های هورمون­های NAA (ردیف بالا) و BAP (ردیف پایین) را نشان می­دهد. حروف متفاوت در بالای ستون­های نمودار نشان دهنده تفاوت معنی­دار در سطح احتمال 1٪ با استفاده آزمون چند دامنه دانکن است.

Figure 2- Mean comparison of triple interactions among explant, NAA and BAP phytohormones in response to callus induction in safflower. Note: D and S represent Dincer and Sina cultivars, respectively. Horizontal axis is represented different levels of NAA (above) and BAP (below) concentrations. Values within a graph followed by different letters are significantly different (P<0.01), analyzed by Duncan’s multiple range test.  

تاثیر رقم و پاسخ آن به کالوس­زایی و باززایی نوساقه­ها در این آزمایش کاملاً مشهود بود. تا کنون، تحقیقات در زمینه کشت بافت و مهندسی ژنتیک گلرنگ تنها روی ارقام خاصی از این گیاه انجام شده است که عمدتاً محدود به ارقامی مانند Bhima، Grina، Manjira، S-144، HUS-305، Dincer، Centennial، A₁ و A₃₀₀  بوده که اکثر آن­ها بومی هندوستان می­باشند. در این تحقیق، یکی از ارقام مورد استفاده رقم Dincer که ژنوتیپی با عملکرد بالا و سازگار به مناطق خشک و بومی ترکیه می­باشد به­دلیل سهولت دسترسی، مورد استفاده قرار گرفت. در زمینه کشت بافت، تنها یک تحقیق در مورد این رقم توسط Basalma et al. (2008) انجام شده است. آن­ها کالوس­زایی این رقم را در محدوده 100-33/93 درصد و بیشترین باززایی نوساقه­ها را در ترکیب هورمونی (TDZ 5/0 و IBA 25/0) به میزان

33/33 درصد گزارش کردند. نتایج تحقیق حاضر به لحاظ صفات فوق تا حدودی موافق با نتایج این محققان بوده است. علاوه بر این، Mandal and Gupta (2001) بیشترین درصد باززایی (4/54%) را در ترکیب هورمونی 2 میلی­گرمBAP  و در رقم S-144 مشاهده کردند. با توجه به مطالب فوق و همچنین معنی­دار شدن اثر رقم در کالوس­زایی و باززایی (جدول 1) مشخص می­­شود که ژنوتیپ در ریزازدیادی و مهندسی ژنتیک دارای اهمیت می­باشد. در این رابطه، همواره بایستی ژنوتیپ­هایی را به­کار برد که دارای درصد باززایی بالایی باشند. به علاوه، برای دستورزی ژنتیکی ژنوتیپ­هایی که دارای خصوصیات زراعی مطلوبی می­باشند امّا فراوانی باززایی آن­ها کم است، بایستی به­وسیله تلاقی با ژنوتیپ­هایی با فراوانی باززایی بالا این خصیصه را به ژنوتیپ­های برتر انتقال داد. در خصوص نوع هورمون و تاثیر آن، در اکثر مطالعات انجام شده از هورمون­های NAA و BAP یا TDZ  استفاده شده و بهترین محدوده برای باززایی مستقیم نوساقه­ها در غلظت 2-5/0 میلی­گرم در لیتر هورمون­های BAP و TDZ در ترکیب با هورمون NAA (5/0-1/0 میلی­گرم در لیتر) گزارش شده است (Orlikowska and Dyer, 1993; Rani et al., 1996; Radhika et al., 2006). در این تحقیقات، بیشترین میزان باززایی نوساقه­ها با کاربرد هورمون­های  NAAو BAP، در محدوده 54-33 درصد گزارش شده است؛ امّا تأثیر هورمون TDZ که یک سیتوکنین مصنوعی با ساختار شیمیایی فنیل اوره است در اندام­زایی و جنین­زایی سوماتیکی مشابه هورمون BAP و در مواردی حتی بیشتر از آن بوده است. حداکثر فراوانی باززایی نوساقه­ها با کاربرد این هورمون 5/98 درصد گزارش شده است. این مسئله حاکی از نقش بسیار معنی دار هورمون TDZ به عنوان یک تنظیم کننده رشد برون­زا در افزایش رقابت مورفوژنیکی در شرایط کشت بافت و نقش مثبت آن در تغییر سطوح هورمون­های داخلی گیاه گلرنگ به منظور القاء نوساقه بوده است (Radhika et al., 2006). از طرف دیگر، غلظت­های بالای هورمون­های BAP و TDZ سمی بوده و در برخی موارد هیچ­گونه واکنشی به لحاظ تولید کالوس و باززایی نوساقه­ها مشاهده نشده یا این که موجب نکروزه شدن کالوس­ها یا نوساقه­های باززا شده گردیده است (Nikam and Shitole, 1999). به­نظر می­رسد که ریشه­دار کردن گیاه گلرنگ در شرایط in vitro به­سختی صورت می­گیرد و این گیاه یکی از گیاهان سر سخت (Recalcitrant) نسبت به این پدیده است؛ چرا که در این تحقیق، ریشه­دارکردن نوساقه­های باززا شده چندان موفقیت­آمیز نبود و تنها تعداد اندکی از آن­ها به محیط خاک منتقل شدند. Ying et al. (1992) نتایج مشابهی را در زمینه ریشه­زایی رقم آمریکایی Centennial مشاهده کردند. همچنین، Sankara Rao and Rohini (1999) مجدداً واکنش ضعیف ارقام هندی A₁ و A₃₀₀ گلرنگ را نسبت به ریشه­زایی در شرایط in vitro گزارش کردند. به ­نظر می­رسد ژنوتیپ مورد استفاده نقش بسیار مهمی در القاء ریشه در محیط in vitro  ایفا می­کند (George and Rao, 1982; Ying et al., 1992).