Cloning and Phylogenetic Relationships Analysis of an Oxidoreductase Gene in Product Pathway of Ethylene Hormone

همسانه سازی و بررسی روابط تکاملی یک آنزیم اکسیدو ردوکتاز در مسیر تولید هورمون اتیلن

زهره جعفری¹، رحیم حداد*²، رامین حسینی²، قاسمعلی گروسی²

¹دانشجوی کارشناسی ارشد رشته بیوتکنولوژی کشاورزی، گروه بیوتکنولوژی کشاورزی، دانشکده فنی مهندسی، دانشگاه بین المللی امام خمینی (ره) قزوین.

²اعضاء هیات علمی گروه بیوتکنولوژی کشاورزی، دانشکده فنی مهندسی، دانشگاه بین المللی امام خمینی (ره) قزوین.

تاریخ دریافت: 13/09/1391، تاریخ پذیرش: 22/02/1393

چکیده

آنزیم 1- آمینوسیکلوپروپان-1-کربوسیلکیک اسید اکسیداز (ACO) عضوی از خانواده اکسیدو ردوکتازهای وابسته به آهن II بوده و برای فعالیت خود به Fe²⁺ به عنوان کوفاکتور و آسکوربات به عنوان سوبسترای همراه نیاز دارد. این آنزیم، تنها آنزیم اکسیدو ردوکتاز مسیر تولید هورمون اتیلن بوده و مرحله نهایی بیوسنتز این هورمون را کاتالیز می کند. در این تحقیق، RNA کل از بافت میوه گوجه فرنگی، رقم Memory I استخراج شده و سپس cDNA کد کننده ژن LeACO1 با استفاده از واکنش زنجیره ای پلی­مراز نسخه برداری معکوس (RT-PCR) ساخته شد. این ژن در ناقل پلاسمیدی pUC19 همسانه سازی شده و خصوصیات بیوشیمی، ساختاری و روند تکامل ژنتیکی آن مورد بررسی قرار گرفت. بررسی توالی پروتئینی LeACO1 و دیگر پروتئین های این خانواده آنزیمی نشان داد که در جایگاه فعال آن ها سه اسید آمینه His177، His234 و Asp179 تشکیل یک مثلث کاتالیزور کننده را داده و به اتصال Fe²⁺ در این جایگاه کمک می کنند. بررسی روابط فیلوژنتیکی و همردیف سازی چندگانه نشان داد که این ژن شباهت زیادی با ژن ACO1 در دیگر گیاهان دارد. همچنین بررسی روابط تکاملی میان اعضای خانواده دی اکسیژنازهای وابسته به یون آهن نشان داد که از نظر تکاملی پروتئین های ACO از سایر اعضای خانواده دی اکسیژنازها متمایز هستند.

واژه های کلیدی: ACO1، اکسیدو ردوکتاز، جایگاه فعال، گوجه فرنگی، همسانه سازی.

مقدمه

اتیلن یکی از هورمون های مهم گیاهی است که در بسیاری از جنبه های رشد، توسعه و تمایز سلولی، جوانه زنی دانه، رسیدگی میوه، پیری گل و برگ شرکت می کند (Abeles et al., 1992; Ahmadi et al., 2011; Bleecker & Kende, 2000; Lasserre et al., 1996). این هورمون همچنین در پاسخ گیاه به محدوده وسیعی از تنش های زنده و غیر زنده مانند حمله پاتوژن، آسیب های مکانیکی (Bleecker & Kende, 2000)، غرقابی (Olson et al., 1995) و سرما (Leliever et al., 1997) نقش دارد. آخرین مرحله در مسیر بیوسنتزی اتیلن اکسیداسیون دو الکترون 1- آمینو سیکلو پروپان-1- کربوکسیلیک اسید (ACC) و سپس تبدیل آن به اتیلن، دی اکسید کربن، سیانید و آب است که این عمل توسط آنزیم 1- آمینوسیکلوپروپان-1-کربوسیلکیک اسید اکسیداز (ACO) انجام می گیرد (Adams & Yang, 1979; Costas et al., 2004). فعالیت ACO با کاهش پیوسته اکسیژن به آب و اکسیداسیون آسکوربات به دی هیدرو آسکوربات همراه است. در این واکنش بی کربنات به عنوان فعال کننده واکنش عمل می کند.

ACO متعلق به خانواده دی اکسیژنازهای آهنی غیر هِم (Hem) است که از یون آهن به عنوان کوفاکتور و 2 اکسو گلوتارات به عنوان سوبسترای همراه استفاده می کند. با وجود اینکه میزان تشابه توالی در میان این خانواده آنزیمی کم است (Ahmadi et al., 2011)، اما در همه آن ها جایگاه فعال دارای یون آهن بوده که در یک آرایش لیگاند سه شاخه ای تحت عنوان آرایش سه وجهی «2-His-1-carboxylate» قرار می گیرد (Costas et al., 2004). بر خلاف سایر اعضای خانواده دی اکسیژنازهای آهنی غیر هِم، که از آلفا کتو گلوتارات به عنوان سوبسترای همراه برای احیا اکسیژن به آب استفاده می نمایند. آنزیم ACO از آسکوربات دو الکترون جهت احیا اکسیژن دریافت می کند. بررسی مکانیسم عمل آنزیم ACO نشان می­دهد که ACC از طریق گروه های آمینو و کربوکسیل خود به آهن مرکزی متصل می شود. در این اتصال گروه آمین ACC در مقابل اسید آمینه His234 و گروه کربوکسیل آن در مقابل Asp179 قرار می گیرد (Rocklin et al., 2004). Arg175 و Arg244 در اتصال بی کربنات نقش داشته و دو اکسیژن به حالت ترانس با اسید آمینه His177 قرار می گیرند. کمپلکس ACCO-Fe-ACC-bicarbonate-dioxygen واکنش پذیری کمی جهت اکسیداسیون ACC دارد. اولین انتقال الکترون به آهن متصل به دی اکسیژن از آسکوربات یا مولکول ACC دیگری صورت می گیرد. متعاقبا تجزیه O-O توسط بی کربنات، اکسو آهنی تولید می کند که با اکسیداسیون ACC باعث تولید اتیلن، آب، سیانید و ACO-Fe(III) می شود. ACO-Fe(III) توسط آسکوربات احیا می شود تا ACO-Fe(II) برای چرخه کاتالیزی مجدد فراهم شود (Tierney et al., 2005).

آنزیم ACO توسط خانواده ژنی کوچکی کد می شود. مثلا پنج ژن در گوجه فرنگی (Sell & Hehl, 2005)، و لاله (Momonoi et al., 2007)، چهار ژن در اطلسی (Tang et al., 1993) و ذرت (Gallie & Yong, 2004) و سه ژن در خربزه (Lasserre et al., 1996) گزارش شده است. خانواده ژنی ACO در طول رشد و نمو گیاه به صورت های مختلفی بیان می گردند. در گل لاله TgACO1، TgACO3 و TgACO5 به ترتیب در گلبرگ های پژمرده، برگ ها و ساقه بیان می شوند، در حالیکه TgACO2 و TgACO4 فقط درسطح پایه در این بافت ها بیان می گردند (Momonoi et al., 2007). پیر شدن گلبرگ اطلسی با افزایش تولید اتیلن شروع می شود و اتیلن نقش اساسی در تنظیم مرگ سلول بازی می کند (Hoekstra & Weges, 1986). بررسی مسیر بیوسنتزی اتیلن در میوه موز نشان داد که MA-ACS1 و MA-ACO1 دو ژن اصلی رسیدگی در میوه موز بوده و نقش مهمی در تنظیم تولید اتیلن در طی رسیدگی ایفا می کنند (Choudhury et al., 2008). دانه گرده اطلسی دارای مقدار زیادی ACC است که پس از گرده افشانی از طریق کلاله به اتیلن تبدیل می شود. اتیلن تولید شده در رشد و نمو پس از گرده افشانی نقش مهمی به عهده دارد (Singh et al., 1992). جداسازی و کلون ایزوفرم جدید ژن ACO ازspp.  Dendrobium رقم Anna (عضوی از بزرگترین گونه ارکیده) نشان داد که توالی آمینو اسیدی ACO این رقم با ACO های موجود در دیگر ارقام ثبت شده در پایگاه های اطلاعاتی 98% مشابهت دارد. همچنین با همسانه سازی ژن DenACS از گیاه ارکیده (Dendrobium hybrid) نشان داده شد که این ژن در باز شدن گل، پیری گل و رشد و توسعه سلول های رویشی نقش دارد (Nagtong et al., 2009; Nagtong et al., 2010). تراریختی خربزه با سازه آنتی سنس cDNA ژن ACO سیب نشان داد که نقش ACO در بیوسنتز اتیلن کلیدی است، در این روش با ممانعت از تولید آنزیم ACO مقدار اتیلن در این گیاه به طور معنی داری کاهش می یابد (Rombaldi et al., 2002).

 با توجه به نقش مهم اتیلن در رسیدگی میوه و پیری و ضایعاتی که توسط این هورمون ایجاد می شود، با کاهش میزان آن می توان بخش عمده ای از ضایعات مربوط به انبارداری محصولات کشاورزی را تقلیل داد. به همین منظور نخست همسانه سازی ژن ACO1 که ایزوفرم غالب رسیدگی است صورت گرفت تا بتوان در قدم های بعدی به منظور تغییر بیان آن و کاهش میزان اتیلن، از این ژن جهت انتقال به گیاه استفاده کرد. در این مطالعه پس از شناسایی و همسانه سازی ژن LeACO1، با استفاده از بررسی های همولوژی و فیلوژنتیکی با سایر اکسیژنازها نشان می دهیم که از نظر تکاملی پروتئین های ACO از سایر اعضای خانواده اکسیژنازها متمایز هستند. به علاوه این ژن شباهت زیادی با ژن ACO در دیگر گیاهان دارد.

مواد و روش ها

مواد گیاهی و نمونه برداری

میوه گوجه فرنگی (Lycopersicon esculentum L. cv, Memory I) از گلخانه ای واقع در مینودر قزوین جمع آوری و پس از توزین به مقدار 3 گرم درون ورقه های آلومینیومی بسته بندی شده و بلافاصله درون ازت مایع تثبیت گردید. نمونه سریعا به آزمایشگاه انتقال داده شده و تا زمان استفاده در دمای 80- درجه سانتی گراد نگهداری شدند.

استخراج RNA کل

جهت استخراج RNA کل از یک روش بهینه شده مبتنی بر CTAB، که تغییر یافته روش Reid et al.  (2006) می باشد، استفاده شد. در این روش کلرید سدیم جهت حذف پلی ساکاریدها، پلی وینیل پیرولیدون به منظور حذف ترکیبات فنولی و کلروفرم جهت حذف پروتئین ها مورد استفاده قرار گرفتند. در نهایت RNA با استفاده از استات سدیم و ایزوپروپانول و لیتیوم کلراید رسوب داده شد. بافت مورد نظر به صورت پودر در آمده و به میزان 3 گرم از بافت پودر شده به یک تیوب فالکون ml 50 حاوی بافر استخراج (CTAB (w/v) 2%، PVP (w/v) 2%، (8pH= ) mM EDTA 25، (8pH= ) mM Tris-HCl 300، NaCl M 2،β-mercaptoethanol  (v/v) 2% اضافه گردید. تیوب ها به مدت 30 دقیقه در حمام آب گرم (Techne انگلستان مدل FTE10AE ) با دمای 65 درجه سانتیگراد قرار داده شده و هر 5 دقیقه به آرامی ورتکس (Techne انگلستان مدل FVORTECE) گردیدند. سپس پروتئین ها دو مرتبه با یک حجم برابر از کلروفرم: ایزوآمیل الکل (v/v 1:24) استخراج گردیده و لایه بالایی به یک تیوب فالکون جدید منتقل و 1/0 حجم سدیم استات M 3 و 6/0 حجم ایزوپروپانول به آن افزوده و سپس به مدت 30 دقیقه در دمای 80- درجه سانتیگراد نگهداری گردید. رسوب اسید نوکلئیک به وسیله سانتریفیوژ (Hermel آلمان مدل Z36HK) با سرعت rpm 14000 در دمای 4 درجه سانتیگراد جمع آوری و در آب حاوی DEPC حل گردید. در مرحله بعد 3/0 حجم لیتیوم کلراید M 8 به نمونه ها اضافه شده و تیوب ها به مدت 6-8 ساعت در دمای 4 درجه سانتیگراد نگهداری شدند. سپس RNA کل به وسیله سانتریفیوژ با سرعت rpm 14000 در دمای 4 درجه سانتیگراد رسوب و با استفاده از الکل اتانول 70% شستشو و در lµ 200 آب حاوی DEPC حل گردید. در نهایت، کمیت و کیفیت RNA کل استخراج شده با استفاده از دستگاه اسپکتروفتومتر (Labomed انگلستان، UVD3200) در طول موج های 230، 260 و 280 نانومتر و الکتروفورز ژل آگارز 2/1% مورد بررسی قرار گرفت.

سنتز cDNA و واکنش RT-PCR

واکنش نسخه برداری معکوس با استفاده از gµ 5 محلول RNA کل تیمار شده با آنزیم DNase (Fermentas)، آنزیم نسخه بردار معکوس RevertAidTMM-MuiV (Fermentase) و آغازگرهای Oligo dT (QIAGEN) در دمای 42 درجه سانتی گراد به مدت یک ساعت انجام شده و پس از آن، عمل غیر فعال سازی آنزیم نسخه بردار معکوس (RT) در دمای 70 درجه سانتی گراد به مدت 10 دقیقه صورت گرفت. برای تکثیر ژن LeACO1، مخلوط واکنش در حجم نهایی µl50 حاوی Mm dNTP Mix10، mM MgCl₂ 50، PCR buffer ×10،U/µl Taq DNA polymerase 5 و محلول 20 پیکو مولار آغازگرهای رفت و برگشت به میزان 1 میکرولیتر مورد استفاده قرار گرفت. جهت طراحی آغازگر مورد نیاز از توالی آنزیم 1- آمینو سیکلوپروپان-1- کربوکسیلیک اسید اکسیداز موجود در بانک اطلاعاتی NCBI با شماره شناسایی X58273.1 استفاده گردید.

آغازگر رفت با توالی (5' TTA GGA TCC ATG GAG AAC TTC CCA AT 3') و آغازگر برگشت با توالی (5' TAA GGA TCC CTA AGC ACT TGC AAT TG 3') که شامل سه نوکلئوتید اضافی و جایگاه برشی BamHI در انتهای '5 بودند سنتز شدند. واکنش PCR در 35 سیکل چرخه دمایی انجام شد که شرایط دمایی و زمانی هر چرخه شامل: مرحله واسرشتگی در دمای 94 درجه سانتی گراد به مدت 45 ثانیه، مرحله اتصال در دمای 60 درجه سانتی گراد به مدت یک دقیقه و مرحله تکثیر در دمای 70 درجه سانتی گراد به مدت یک دقیقه بود.

همسانه سازی و توالی یابی cDNA کد کننده LeACO1

پس از خالص سازی محصول PCR از روی ژل با استفاده از کیت استخراج اسید نوکلئیک (Fermentase، K0513) ژن مورد نظر و ناقل پلاسمیدی pUC19 (Fermentase) توسط آنزیم برشی BamHI (Fermentase) هضم گردیده و مجددا خالص سازی شدند. سپس واکنش اتصال با استفاده از آنزیم DNA لیگاز T4 (Fermentase) انجام گرفت ( Russell, 2001& Sambrook). پس از تهیه سلول­های مستعد E. coli سویه DH5α، انتقال پلاسمید حاوی ژن با استفاده از روش شوک حرارتی انجام گرفته (Cohen et al., 1972) و باکتری روی محیط کشت جامد SOB حاوی آنتی بیوتیک آمپی سیلین و پروتئین LacZ به منظور انجام گزینش سفید-آبی کشت شدند. در مرحله بعد تعدادی کلونی سفید و آبی کم رنگ به عنوان کلونی های نوترکیب، انتخاب و مورد بررسی قرار گرفتند. در نهایت، استخراج پلاسمید های نوترکیب با استفاده از روش تحلیل قلیایی با SDS انجام شده (Birnboim & Doly, 1979) و کلونی­های نوترکیب با استفاده از دو روش PCR و هضم آنزیمی با 3 آنزیم BamHI، EcoRI و SacI مورد بررسی قرار گرفتند. توالی یابی پلاسمیدهای نوترکیب با استفاده از آغازگر های اختصاصی ژن LeACO1 در دو جهت رفت و برگشت توسط شرکت Seqlab (Sequence Laboratories Gottingen) آلمان انجام شد.

پس از انتخاب پروتئین های مورد نظر ضمن استفاده از برنامه Blast (http://www.blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)، همردیف سازی توالی ها با استفاده از برنامه ClustalW (http://www.clustalw.Genome.ad.Jp) و Boxshade (http://www.bioweb.pasteur.fr/seqanal/interfaces/boxshade.html) انجام شد. جهت آنالیز فیلوژنی آنزیم های خانواده دی اکسیژناز گیاهی شامل سیب، آرابیدوپسیس، اطلسی، گوجه فرنگی، از اطلاعات ثبت شده در سایت NCBI استفاده شد (جدول 1). همچنین شماره دستیابی توالی های پروتئینی موجود در NCBI، مورد استفاده در بررسی های همردیف سازی چندگانه و روابط فیلوژنتیکی در جدول 2 نشان داده شده است.

جدول 1- آنزیم های خانواده دی اکسیژناز گیاهی.

Table1: Enzymes of plant dioxygenase family.

نام گیاه (Plant name)

نتایج و بحث

هضم آنزیمی و توالی یابی

نتایج هضم آنزیمی پلاسمید نوترکیب با 3 آنزیم BamHI، EcoRI و SacI در شکل (A1) نشان داده شده است. از آنجا که انتقال این ژن به داخل pUC19 با استفاده از آنزیم BamHI صورت گرفته بود، انتظار می­رفت که هضم پلاسمید نوترکیب توسط این آنزیم قطعاتی به طول bp 948 و bp 2686 را تولید کند. آنزیم SacI یک ناحیه برش بر روی پلاسمید داشته و فاقد ناحیه برشی بر روی قطعه ژن LeACO1 است، بنابراین انتظار می رود که با هضم پلاسمید نوترکیب با این آنزیم تنها یک قطعه با طول bp 3634 تشکیل شود. در شکل (B1) جایگاه برشی آنزیم های به کار برده شده برای تائید پلاسمید نوترکیب نشان داده شده است.

جدول 2- توالی های پروتئینی مورد استفاده در بررسی های همردیف سازی چندگانه و روابط فیلوژنتیکی.

Table 2: Protein sequences used in the multiple Alignment and phylogenetic relationships.

همچنین دو جایگاه برشی SacI و XbaI جهت جداسازی و انتقال این ژن به داخل pBI121 استفاده می شوند. برای تعیین جهت ژن LeACO1 در داخل پلاسمید، از آنزیم EcoRI استفاده شد. این آنزیم پلاسمید را در ناحیه bp 396 و ژن را در ناحیه bp 119 برش می دهد (شکل C1) بنابراین انتظار می رود در صورتی که ژن درون پلاسمید، در خلاف جهت LacZ قرار گرفته باشد، دو قطعه به اندازه های bp 140 و bp 3494 تشکیل شود و در صورت موافق بودن جهت آن با LacZ، دو باند به طول bp 850 و bp 2784 مشاهده گردد. با هضم توسط آنزیم EcoRI دو باند به طول bp 140 و bp 3494 روی ژل آگارز دیده شد که گویای آنتی سنس بودن قطعه ژن در پلاسمید نوترکیب است. همچنین نتایج توالی یابی DNA نشان داد که قطعه همسانه سازی شده در خلاف جهت LacZ قرار گرفته است که با نتایج هضم آنزیمی مطابقت دارد (شکل 2). چارچوب باز خواندنی cDNA کد کننده LeACO1 ثبت شده در پایگاه توالی نوکلئوتیدی GeneBank با شماره دستیابی HQ322499، به طول 948 باز بوده است.

بررسی توالی اسید آمینه ای و موتیف های ساختاری پروتئین LeACO1

ترسیم درخت فیلوژنتیکی برای چهار پروتئین FS (flavonol synthases)، ANS (anthocyanidin synthases)، F3H (flavonone 3-hydroxylases) و ACO در گوجه فرنگی و تعدادی از گیاهان با استفاده از الگوریتم الحاق به نزدیکترین همسایه[1] رسم شد و نشان داد که پروتئین های ACO از نظر تکاملی از سایر اعضای خانواده دی اکسیژنازها متمایز هستند (Hudgins et al., 2006). شناسایی اکسیدو ردوکتازهای همولوگ با ژن LeACO1 با استفاده از برنامه GenTHREADER (http://www.bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred) نشان داد که همه پروتئین های این بانک اطلاعاتی، تشابه توالی کمتر از 30% را با LeACO1 دارند. بنابراین پروتئین های آنتوسیانین سینتاز و ایزو پنی سیلین N سینتاز که بیشترین تشابه توالی پروتئینی را با ژن مورد نظر داشتند، مورد انتخاب واقع شدند. لازم به ذکر است که آنتوسیانین سینتاز (ANS،PDB code 1gp6) و ایزوپنی سیلین N سینتاز (IPNS، 1odm PDB code) به ترتیب تشابه توالی 3/27% و 8/17% را نشان دادند. این دو پروتئین عضوی از خانواده پروتئین های غیر هِم (Hem) هستند که برای فعالیت خود به Fe²⁺ و سوبسترای همراه نیاز دارند. به جز ACO و IPNS که دارای سوبسترای همراه آسکوربات هستند، سایر اعضای این خانواده از آلفا کتو گلوتارات استفاده می کنند، موتیف های متصل به آهن (His-X-Asp-X-His) و اسیدهای آمینه متصل به هیدروژن سوبسترای همراه (Arg-X-Ser) در تمام اعضای این خانواده حضور دارند (شکل 3).

شکل1- A: الکتروفورز ژل آگاروز کلونی های نوترکیب با استفاده از هضم آنزیمی. M- نشانگر مولکولی  Kb1 (Fermentas)، 1- DNA پلاسمیدی شاهد هضم نشده، 2- DNA پلاسمیدی شاهد هضم شده بوسیله BamHI، 3- پلاسمید نوترکیب هضم نشده، 4، 5 و 6- پلاسمید نوترکیب هضم شده بوسیله BamHI، SacI و EcoRI. به ترتیب. B: نقشه پلاسمید نوترکیب pUC19-LeACO1 و جایگاه برشی آنزیم های BamHI، SacI و XbaI (از دو آنزیم SacI و XbaI جهت انتقال این ژن به ناقل دوتایی pBI121 استفاده می شود). C: نقشه تعیین جهت ژن ACO1 داخل پلاسمید pUC19 به وسیله آنزیم EcoRI.

Figure 1- A: Agarose gel electrophoresis of recombinant vectors using enzymatic digestion, M: 1 Kb molecular marker (Fermentase), 1: Non-digested control DNA plasmid, 2: Digested control DNA plasmid by BamHI, 3: Non-digested recombinant plasmid, 4, 5, and 6: Digested recombinant plasmid by BamHI, SacI, and EcoRI, respectively. B: Recombinant plasmid mape of pUC19-LeACO1and restriction sites of BamHI, SacI, and XbaI (Both restriction enzymes of SacI and XbaI are used to transfer forementioned gene into binary vector of pBI121). C: Restriction mape to illustrate direction of cloned ACO1 gene into the pUC19 vector plasmid using EcoRI.

شکل 2- ساختار ناقل نوترکیب pUC19-LeACO1. موقیت ژن کلون شده LeACO1 در جهت معکوس روی جایگاه چند گانه همسانه سازی (MCS) نشان داده شده است. ناحیه رونوشت برداری (pMB1)، ژن های LacZ و مقاومت به آمپی سیلین (Ap^R)، و جایگاه چند گانه برای همسانه سازی روی نقشه ناقل نوترکیب نشان داده شده اند.

Figure 2- Structure of recombinant vector pUC19-LeACO1. Location of cloned LeACO1 are exhibited in the reverse direction on the multiple cloning sites (MCS). Transcription region (pMB1), LacZ and recombinant sites (Ap^R), and multiple regions for replication have been shown on the map of recombinant vector plasmid.

شکل 4 موتیف های ساختاری و مناطق حفاظت شده پروتئین های LeACO1، ANS (1gp6 PDB) و IPNS (1odm PDB) را پس از همردیف سازی و ترتیب توالی آن ها نشان می­دهد. بررسی توالی دی اکسیژنازها نمایانگر این است که آنزیم هایی با تشابه توالی کمتر از 32%، عملکردهای مختلفی دارند (Prescott & John, 1996).

جداسازی ژن کد کننده دی اکسیژنازی که در مراحل ابتدایی تشکیل ریشه های نا به جا در میوه سیب بیان می شود (ARRO-1) و همردیف سازی این ژن با سایر دی اکسیژنازها نشان می دهد که 31% تشابه با ACO گیاه رمکس (Y10034) و 30% تشابه توالی با G3H (gibberellin 3β-hydroxylase) آرابیدوپسیس (L37126) دارد و بنابراین بر اساس نتایج قبلی این ژن دی اکسیژناز جدیدی را کد می کند و علی رغم تفاوت عملکرد این دی اکسیژنازها، در توالی همه آن ها موتیف های اتصال به آهن و سوبسترا به صورت کاملا حفاظت شده می باشد (Butler & Gallagher, 1999).

مطالعات موتاژنی و کریستالوگرافی ساختار ACO اطلسی (PxhACO1) و ACO سیب (MDACO1) و دو پروتئین همولوگ آن (ANS و IPNS)، به حضور موتیف های (His-X-Asp-X-His) و (Arg-X-Ser) در این توالی ها اشاره دارد و دو اسید آمینه هیستیدین و آسپارتات را به عنوان لیگاندهای Fe²⁺ معرفی می کند (Zhang et al., 1997; Zhang et al., 2004; Seo et al., 2004).

بررسی های همولوژی و فیلوژنتیکی ژن LeACO1

رابطه تکاملی تعدادی از توالی های پروتئینی منابع مختلف که بیشترین شباهت را با توالی LeACO1 داشتند، در شکل 5 و 6 نشان داده شده است. بررسی ترتیب توالی پروتئینی ژن LeACO1 با سایر توالی های پروتئینی نشان می­دهد که این ژن بیشترین تشابه را با گیاهان سیب زمینی، اطلسی، فلفل و تنباکو به ترتیب به میزان 98%، 93%، 91% و 90% و کمترین تشابه را با گیاهان ماش و صنوبر به میزان 70% دارد.

درخت فیلوژنی به دو گروه اصلی A و B تقسیم گردید به گونه ای که ایزوفرم های 1، 2 و 3 ژن ACO که تشابه بیشتری را در توالی با یکدیگر نشان دادند، در گروه اصلی A و ایزوفرم 4 در گروه B قرار گرفت. ایزوفرم های 1 و 3 گوجه فرنگی با ژن ACO سیب زمینی و تنباکو که اعضای خانواده سولاناسه هستند در یک گروه و ایزوفرم 2 گوجه فرنگی با ایزوفرم 1 این ژن در اطلسی در گروه دیگری قرار گرفته اند.

ایزوفرم 4 گوجه فرنگی که تشابه توالی پروتئینی کمتری با سایر ایزوفرم ها در گوجه فرنگی داشت با ایزوفرم های دیگر این ژن در گیاهان دیگری چون هویا، صنوبر و شمعدانی در یک گروه قرار گرفت.

بررسی فیلوژنی آنزیم ACO در گیاه اطلسی نشان می دهد که پروتئین کد شده توسط ایزوفرم های 1، 3 و 4 بیش از 90% تشابه توالی دارند و با ACO سایر گیاهان بیش از 70% تشابه توالی نشان می دهند، پروتئین­های ACO تشابه توالی قابل توجه ای با آنزیم هایی دارند که برای فعالیت کاتالیزوری خود از آسکوربات و یون آهن استفاده می کنند (Tang et al., 1993).

جداسازی cDNA ژن ST-ACO3 و بررسی روابط فیلوژنی این ژن نشان می دهد که بیشترین تشابه توالی را با ژن ACO آرابیدوپسیس و کمترین تشابه را با ACO برنج، خربزه، کیوی و اطلسی دارد (Zanetti et al., 2002).

ایزوفرم یک و دو ST-ACO بیش از 70% تشابه توالی با یکدیگر داشته و ایزوفرم سه با دو ایزوفرم قبلی تنها 42% تشابه دارد و لذا مبین آن است که ایزوفرم 3 یک عضو منشعب از این خانواده ژنی می باشد.

شکل 3- آنالیز فیلوژنی تعدادی از آنزیم های دی اکسیژناز گیاهی برای نشان دادن زیر گروه و کلاس های ژن هم خانواده. شماره دستیابی ژن ها در جداول 1 و 2 آورده شده است.

Figure 3- The phylogenetic tree analysis for number of plant dioxygenases to demonstrate the subgroup and subclass of the homogene families. Accession numbers have been given in Tables 1 and 2.

شکل 4- همردیف سازی پروتئین و تجزیه توالی سه آنزیم اکسیدو ردوکتاز (LeACO1، ANS و IPNS). اسیدهای آمینه یکسان و مشابه به ترتیب با رنگ سیاه و خاکستری نشان داده شده اند. علامت * نشان دهنده اسیدهای آمینه حفاظت شده در توالی ها می باشد. موتیف های متصل به Fe²⁺ با بیضی ممتد (—) و موتیف متصل به سوبسترای همراه با بیضی غیر ممتد (---) نمایش داده شده است.

Figure 4- Protein alignment and sequence analysis of three oxidoreductases (LeACO1, ANS and IPNS). Unique and similar deduced amino acids are illustrated by black and gray colors, respectively. Protected amino acid residues are shown by * symbol in the sequence structure. Conjugated motifs to Fe²⁺ and associated substrate are exhibited by extended (–) and non-extended (---) ovals, respectively.

شکل 5- همردیف­سازی چندگانه پروتئینی ژن LeACO1 با سایر ایزوفرم­هایی که بیش از 90 درصد با ACO1 گوجه فرنگی تشابه دارند. ستاره های رنگی اسیدهای آمینه ای که در اتصال سوبسترا و یون آهن نقش دارند را نشان می دهد. شماره های دستیابی اسیدهای آمینه در جدول 2 آورده شده است.

Figure 5- Multiple protein sequence alignment of LeACO1 gene with other isoforms that illustrated more than %90 similarities with tomato ACO1 gene. Color stars are exhibited amino acid residues involving to bind relevant substrate with hem ion. Amino acid accession numbers have been given in Table 2.

شکل 6- درخت فیلوژنتیکی رسم شده با استفاده از نرم افزار ClustalW. ژن همسانه سازی شده LeACO1 با بیضی نشان داده شده است. اعداد (به درصد)، تشابه توالی پروتئینی ژن همسانه سازی شده با توالی پروتئینی سایر گیاهان را نشان می دهد. شماره های دستیابی اسیدهای آمینه در جدول 2 درج شده است.

Figure 6. Drown phylogenetic tree employing ClustalW software. Cloned LeACO1gene are shown with circular. Percentage numbers are shown the protein sequence similarity of coned gene with those of other plants. Amino acid accession numbers have been given in Table 2.

در مجموع این بررسی، علاوه بر همسانه سازی ژن LeACO1، اطلاعات مولکولی پایه و مفیدی برای تحقیقات بعدی در اختیار قرار می دهد. به نظر می رسد که در مطالعات تکمیلی، تحقیقاتی نظیر شناسایی، همسانه­سازی، بررسی ساختار ژن و نیز فعالیت کاتالیتیکی در گیاهان خانواده سولاناسه، سایر ارقام گوجه فرنگی و همچنین گیاهان کلیماکتریک، ایزوفرم های دیگر این ژن میتوانند اطلاعات بیشتری در اختیار محققین قرار دهد. همچنین همسانه سازی این ژن در جهت آنتی سنس و معرفی آن به داخل ژنوم گیاه گوجه فرنگی می تواند سرعت رسیدن میوه این گیاه را کُند نماید. در صورت همولوژی بالای ژن ایزوفرم، میتوان برای سایر گیاهان از همین شیوه استفاده نمود.