Document Type : Research Paper
Authors
Abstract
Keywords
بررسی الگوی بیان ژن رمزکننده پمپ پروتونی غشای پلاسمایی در شاخساره ارقام گندم حساس و مقاوم و خویشاوند وحشی Aegilops crassa تحت تنش شوری
زهرا زینتی1، عباس عالمزاده*2، اسماعیل ابراهیمی3، علی نیازی3
1استادیار بخش اگرواکولوژی، دانشکده کشاورزی و منابع طبیعی داراب
2دانشیار بخش زراعت و اصلاح نباتات، دانشکده کشاورزی، دانشگاه شیراز
3دانشیار مرکز بیوتکنولوژی کشاورزی، دانشکده کشاورزی، دانشگاه شیراز
تاریخ دریافت: 22/02/1393، تاریخ پذیرش: 13/05/1393
چکیده
با توجه به اهمیت نقش پمپ پروتونی غشای پلاسمایی (H+-ATPase) در فرآیندهای مختلف فیزیولوژیک گیاه، الگوی بیانی این پمپ در شاخساره ارقام گندم مقاوم ارگ و حساس الموت و خویشاوند وحشی آن، Aegilops crassa، تحت تنش شوری مورد بررسی قرار گرفت. تنش شوری با افزودن mM 150 کلرید سدیم اعمال و نمونهبرداری از شاخساره گیاهان مذکور در ٣ زمان صفر، ١٢ ساعت و ٣ هفته پس از اعمال تنش انجام شد. برای نرمال کردن مقدار cDNA نمونههای مختلف از ژن رمزکننده اکتین به عنوان ژن مرجع استفاده شد و میزان بیان نسبی ژن با استفاده از Real-time PCR در نمونههای مختلف مورد بررسی قرار گرفت. نتایج نشان دادند که در سه هفته پس از اعمال تنش شوری میزان بیان نسبی ژن رمزکننده پمپ پروتونی غشای پلاسمایی بیشتر از 12 ساعت پس از تنش بود. همچنین بیان ژن مذکور سه هفته پس از تنش در رقم مقاوم تفاوت معنیداری با خویشاوند وحشی و رقم حساس داشت. نکته قابل توجه عدم تغییر معنیدار بیان این ژن در زمانهای مختلف پس از اعمال شوری در رقم حساس بود. همچنین بررسی بیوانفورماتیکی پیشبرنده ژن رمزکننده پمپ پروتونی غشای پلاسمایی، مشخص کرد که چندین موتیف مربوط به پاسخ به تنشهای مختلف غیرزیستی و پاسخ به نور در پیشبرنده این ژن وجود دارد. در مجموع مطالعات بیوانفورماتیک و آزمایشگاهی نقش ژن رمزکننده پمپ پروتونی غشای پلاسمایی را در القای مقاومت به شوری نشان داد.
واژههای کلیدی: بیان ژن، پمپ پروتونی، تنش شوری، گندم.
مقدمه
گندم از عمدهترین محصولات کشاورزی ایران و تامین کننده بیشترین نیاز غذایی کشور میباشد. با توجه به حساسیت گندم به تنشهای محیطی، با افزایش تحمل این گیاه نسبت به این تنشها میتوان قدمهای اساسی برای افزایش عملکرد گندم و پایداری آن در سالهای مختلف برداشت. تنش شوری یکی از مهمترین عوامل کاهش عملکرد گیاهان زراعی میباشد (Flowers, 2004). حداقل 20% زمینهای تحت آبیاری دنیا تحت تاثیر شوری هستند (Sahi et al., 2006). انتظار میرود که افزایش شوری تا نیمه قرن حاضر منجر به از بین رفتن 50% از زمینهای زراعی دنیا شود (Tuteja, 2007). در هنگام تنش شوری، گیاه با دو تنش اسمزی و یونی روبرو میشود (Alvarez et al., 2003) که ایجاد تعادل اسمزی و یونی در گیاه، از مهمترین عوامل ایجادکننده تحمل میباشند (Niu et al., 1993). تحت تنش شوری، سدیم از طریق کانالهای کاتیونی غیرانتخابی و انتقالدهندههای سدیمی با تمایل کم[1] (HKT1)، وارد ریشه گیاه میشوند (Maser et al., 2002). انتقال فعال سدیم به خارج از سلول یا انباشت کردن آن در واکوئل، میتواند مانع اثرات مخرب سدیم در سلول گیاهی شود (Zhu, 2003). در گیاهان، آنتیپورترهای ثانویه سدیم/پروتون برای انتقال سدیم در خلاف جهت شیب پروتونی در غشاهای سلولی و واکوئلی وجود دارند (Apse and Blumwald, 2007). نتایج حاصل از پژوهش Saeedpour et al. (2014) نیز بیانگر نقش ژن رمز کننده آنتیپورتر غشای واکوئلی (NHX) در پاسخ به شوری میباشد. آنتیپورترها از نیروی محرکه پروتون که توسط پمپهای پروتونی ایجاد میشوند، استفاده میکنند. در گیاهان، تنها پمپی که شیب پروتونی در غشای پلاسمایی ایجاد میکند، پمپ پروتونی یا همان پمپ H+-ATPase است (Palmgren, 2001) که بعداً سایر انتقالدهندهها مثل آنتیپورترهای سدیمی/هیدروژنی از این نیروی محرکه استفاده کرده و انتقال ثانویه را انجام میدهند. به همین دلیل تصور میشود که پمپ پروتونی غشای پلاسمایی نقش مهمی در تحمل به شوری داشته باشد (Michelet and Boutry, 1995). حدود 25 تا 50 درصد از ATP سلولی توسط این پمپ مصرف میشود که بیانگر اهمیت این پمپ یونی میباشد (Felle, 1982). پمپ پروتونی غشای پلاسمایی در بسیاری از کارکردهای فیزیولوژیک نظیر وقایع مرتبط با تورژسانس مانند رشد سلول و گیاه، باز و بسته شدن روزنه و تحمل به شوری نقش اساسی دارد (Michelet and Boutry, 1995). تنظیم این پمپ در دو سطح رونویسی و پس از ترجمه صورت میگیرد (Janicka-Russak, 2011). تنظیم پس از ترجمه بواسطه فسفریلاسیون این آنزیم (Kanczewska et al., 2005) و همچنین تغییرات محیط لیپیدی غشای سلولی انجام میشود (Kasamo, 2003). شواهد نشان میدهند که پروتئین کینازهای وابسته به کلسیم/کالمودولین به عنوان یک تنظیمکننده مثبت (van der Hoeven et al. 1996) و پروتئینکینازهای سرین/ترئونین به عنوان یک تنظیمکننده منفی (Fuglsang et al., 2007) مسئول فسفریلاسیون پمپ پروتونی غشای پلاسمایی میباشند. محققین نشان دادهاند که پیامهای ناشی از شرایط محیطی مانند شوری در گوجهفرنگی و توتون (Niu et al., 1993; Binzel, 1995)، دمای پایین در خیار (Ahn et al., 2000)، فلزات سنگین در خیار (Janicka-Russak and Klobus, 2007)، خشکی در سویا (Surowy and Boyer, 1991)، نور طبیعی در سیبزمینی (Harms et al., 1994)، تنش مکانیکی در توتون (Oufattole et al., 2000) و هورمونها در ذرت (Frias et al., 1996) منجر به تغییر بیان ژنهای رمزکننده این پمپ میشوند. گزارش شده است که تنش شوری باعث افزایش فعالیت پمپ پروتونی غشای پلاسمایی هم در هالوفیتها و هم در گلایکوفیتها میشود (Sahu and Shaw, 2009; Lopez-Perez et al., 2009; Shen et al., 2011). تا کنون دانش اندکی در رابطه با نوع الگوی بیان ژنهای مختلف تحت تنشهای زیستی و غیرزیستی در ارقام حساس و مقاوم یک گونه زراعی و مقایسه آن با گونههای وحشی وابسته به آنها بدست آمده است. در پژوهشی که توسط Ravash et al. (2013) انجام شد اهمیت پیدا کردن ژنهای مؤثر در ایجاد تحمل به تنشها در خویشاوندان وحشی گیاهان نشان داده شده است. با اینکه گندم یک گونه زراعی مهم در سرتاسر جهان میباشد و تحقیقات زیادی نیز نقش پمپ پروتونی را در تحمل به شوری نشان دادهاند اما تا کنون گزارشی از الگوی بیان ژنهای رمزکننده این پمپ در ارقام مقاوم و حساس گندم و خویشاوندان وحشی آن تحت شوری ارائه نشده است. به همین دلیل این تحقیق به منظور مطالعه چگونگی الگوی بیانی ژن رمزکننده پمپ پروتونی غشای پلاسمایی در شاخساره ارقام گندم مقاوم (ارگ) و حساس (الموت) به شوری و خویشاوند وحشی Aegilops crassa در زمانهای مختلف پس از اعمال تنش شوری انجام شده است. همچنین با توجه به اینکه ژنوتیپهای وحشی ذخایر با ارزشی از ژنهای مقاوم به تنشهای مختلف میباشند (Munns and Richards, 2007) و ژنوم D گندم از گونههای Aegilops منشاء گرفته است (Gorham, 1990)، بیان این ژن در ژنوتیپ وحشی A. crassa نیز جهت مقایسه با ارقام زراعی و یافتن همولوگ برتر مورد بررسی قرار گرفت. همچنین جهت درک چگونگی تنظیم بیان این ژن و نقش آن در سازوکارهای مولکولی تحمل به تنشهای مختلف، 2000 جفت باز بالادست ناحیه –UTR'5 ژن رمزکننده پمپ پروتونی غشای پلاسمایی به عنوان پیشبرنده مورد بررسی قرار گرفت.
مواد و روشها
به منظور برررسی تغییرات بیان ژن رمزکننده پمپ پروتونی تحت شرایط تنش شوری در ارقام گندم مقاوم ارگ و حساس الموت و خویشاوند وحشی آن، Aegilops crassa، آزمایشی به صورت فاکتوریل در قالب طرح کاملاً تصادفی با سه تکرار در پژوهشکده بیوتکنولوژی دانشکده کشاورزی دانشگاه شیراز در سالهای 90 و91 انجام شد. فاکتورهای آزمایشی شامل ژنوتیپ، ارقام گندم زراعی ارگ (مقاوم به شوری) و الموت (حساس به شوری)، و یک خویشاوند وحشی (A. crassa) (دارنده ژنوم DD)، و زمان نمونهبرداری در سه سطح (صفر ساعت، 12 ساعت و 3 هفته پس از اعمال تنش) بودند. در این تحقیق از کشت هیدروپونیک و محیط کشت مایع هوگلند استفاده شد (Kerepesi and Galiba, 2000). گیاهچههای 21 روزه به مدت سه هفته تحت تنش شوری، mM 150 کلرید سدیم، قرار گرفته و نمونهبرداری از بافت شاخساره در سه زمان صفر، 12 ساعت و 3 هفته پس از اعمال تنش شوری انجام شد.
استخراج RNA کل توسط کیت column RNA isolation kit (دنازیست، S-1020-1)، طبق دستورالعمل کیت انجام شد. کمیت RNA استخراج شده توسط دستگاه نانودراپ (در طول موجهای 260 و 280 نانومتر) و کیفیت آن با الکتروفورز روی ژل آگارز 1% بررسی شد. به منظور حذف آلودگی DNAژنومی در RNA استخراج شده، با توجه به دستورالعمل کیت فرمنتاز (K0701) تیمار DNaseانجام شد. سپس به منظور اطمینان از حذف DNA ژنومی از RNAهای استخراج شده، از RNA تیمار شده در یک واکنش PCR استفاده شد. رشته اول cDNA نیز با استفاده از کیت First Strand cDNA Synthesis (فرمنتاز، EP0441) و طبق دستورالعمل کیت تهیه شد.
تکثیر قطعهای از ژن رمزکننده پمپ پروتونی غشای پلاسمایی، همسانهسازی و توالی یابی آن
ابتدا قطعهای با طول 137 جفت باز از ژن رمزکننده پمپ پروتونی غشای پلاسمایی از A. crassa در حجم ٢٠ میکرولیتر واکنش زنجیرهای پلیمراز شامل mM ١٠ تریس، mM ٥٠ کلرید پتاسیم، mM ٥/١ کلرید منیزیم، µM ٢٠٠ از هر یک از نوکلئوتید تری فسفاتها، µM ٥/٠ از هر یک از آغازگرهای اختصاصی، 1 میکرولیتر از cDNA به عنوان رشته الگو و یک واحد آنزیم DNAپلیمراز تحت چرخه حرارتی C° 94 به مدت 5 دقیقه و سپس30 چرخه با C° 94 برای 30 ثانیه، C° 2/50 برای 20 ثانیه و C° 72 برای 30 ثانیه تکثیر شد. در انتهای چرخهها هم یک مرحله نهایی با دمای C° 72 به مدت 15 دقیقه انجام شد. سپس برای تایید صحت قطعه تکثیرشده، قطعه حاصل با استفاده از کیت TA clone PCR Cloning Ins ساخت شرکت فرمنتاز (K1213) در درون ناقل pTZ57R/T الحاق شده و طبق دستورالعمل کیت به سلولهای باکتری DH5α انتقال یافت و روی محیط LB جامد حاوی آمپیسیلین (µg/ml 50)، IPTG[2](µg/ml 20) و [3]X-gal (µg/ml 20) کشت داده شد. روز بعد، از کلنیهای آبی و سفید تشکیل شده، کلنیهای سفید که حاوی پلاسمید نوترکیب بودند روی محیط کشت انتخابی LB شناسایی شدند. برای اطمینان از الحاق قطعه تکثیر شده در ناقل، چند کلون سفید انتخاب شده و از آنها به عنوان رشته الگو در یک واکنش PCR استفاده شد. سپس حدود 100 نانوگرم از پلاسمیدهای نوترکیب توسط Gene JET Plasmid Miniprep Kit (فرمنتاز، K0502) استخراج و جهت توالییابی به شرکت دنا زیست ارسال شد. پس از توالییابی، توالی مربوط به ناقل توسط نرم افزارNT1 10.3.1 Vector حذف و توالی نوکلئوتیدی باقیمانده با استفاده از برنامههای blastx و blastn با توالیهای موجود در سایت NCBI مقایسه شد.
واکنش Real time PCR
جفت آغازگرهای مناسب جهت بررسی بیان ژن رمزکننده پمپ پروتونی غشای پلاسمایی با شماره دسترسی AY543630 و ژن رمزکننده اکتین به عنوان ژن مرجع با استفاده از نرمافزار AlleleID طراحی شدند (جدول 1). الگوی بیان ژن مورد نظر توسط دستگاه Real-Time PCR با استفاده از SYBR PrimeScript RT-PCR kit (تاکارا، RR820W) و دستگاه Bioer ساخت کشور چین مطالعه شد. مواد مورد استفاده در واکنش Real-Time PCR شامل 10 میکرولیتر از مخلوط SYBR، 8/0 میکرولیتر از هر آغازگر (Mµ 5/0)، 1 میکرولیتر از cDNA و 4/7 میکرولیتر آب مقطر بود. چرخه حرارتی استفاده شده در واکنش شامل C° 94 به مدت 2 دقیقه و سپس40 چرخه با C° 94 برای 10 ثانیه، C° 2/50 برای 15 ثانیه و C° 72 برای 30 ثانیه بود. به منظور اختصاصی بودن واکنش، در پایان واکنش از منحنی ذوب با برنامه دمایی 5/0 درجه برای هر چرخه و دمای C° 95-50 استفاده شد.
جدول 1- آغازگرهای مورد استفاده در Real Time PCR جهت تکثیر ژن رمزکننده پمپ پروتونی غشای پلاسمایی و اکیتن در گندم و خویشاوند وحشی آن.
Table 1- Sequences of primers used in Real time PCR for amplification of genes encoding plasma membrane proton pump and actin in wheat and its wild relative.
|
نام ژن gene name |
نام آغازگر primer name |
توالی آغازگر sequence |
دمای اتصال (C°) annealing temperature |
طولقطعه تکثیر شده (bp) amplicon length |
|
actin |
actin F |
5'-TATGCCAGCGGGCGAACAAC-3' |
57 |
351 |
|
actin R |
5'-GGAACAGCACCTCAGGGCAC-3' |
|||
|
H+-ATPase |
H+-ATPase F |
5'-TGCCATTCAACCCTACTG-3' |
50.2 |
137 |
|
H+-ATPase R |
5'-CACCTTTCTCTTCACATCC-3' |
آنالیز دادههای Real Time PCR
ابتدا Ct (Cycle threshold) هر نمونه برای ژن اصلی و مرجع با تعیین خط پایه (base line) با استفاده از نرم افزار LineGene تعیین شد. بدین صورت که محل تقاطع base line با ابتدای فاز نمایی نمودار تکثیر واکنش Real-time PCR، به عنوان Ct در نظر گرفته شد. آنالیز Ctهای حاصل با استفاده از روش کمی سنجی نسبی انجام شد. در این روش از فرمول ΔΔCT2 (نمونهΔCT - کنترلΔCT= ΔΔCT) استفاده شد (Pfaffl, 2001). در نهایت با استفاده از نرمافزار SAS، اختلاف معنیدار بیان ژن رمزکننده پمپ پروتونی غشای پلاسمایی در ارقام حساس و مقاوم و خویشاوند وحشی A. crassa در بافت شاخساره در زمانهای صفر، 12 ساعت و 3 هفته پس از تنش توسط آزمون چند دامنهای دانکن در سطح احتمال 05/0 P≤ مورد مقایسه قرار گرفتند. از آنجا که دادههای حاصل از آنالیز Real Time PCR بیانگر تغییر بیان ژن در شرایط تنش شوری نسبت به شرایط کنترل متناظر خود در هر زمان نمونهبرداری میباشند، آزمایش با دو فاکتور شامل ژنوتیپها و زمان نمونهبرداری آنالیز گردید.
بررسی عوامل رونویسی و جایگاه اتصال آنها به پیشبرنده ژن رمزکننده پمپ پروتونی غشای پلاسمایی
از آنجا که بانک اطلاعاتی برای شناسایی پیشبرنده در گندم وجود ندارد جهت بررسی پیشبرنده این ژن در گندم از همولوگ ژن رمز کننده پمپ پروتونی غشای پلاسمایی در برنج (LOC_Os04g56160) استفاده شد. برای شناسایی و گرفتن توالی پیشبرنده ژن رمز کننده پمپ پروتونی غشای پلاسمایی در برنج از پایگاه اطلاعاتی Phytozome (http://www.phytozome.net) استفاده شد. به این منظور bp 2000 بالادست ناحیه'UTR 5 به عنوان پیشبرنده انتخاب شد. سپس به منظور بررسی عوامل رونویسی و جایگاه اتصال آنها به پیشبرنده این ژن، از سایت PlantPan (http://plantpan.mbc.nctu.edu.tw) و PlantCARE (http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html) استفاده شد.
نتایج و بحث
استخراج RNA و بررسی توالی قطعه تکثیر شده طی واکنش PCR
از شاخساره A. crassa و ارقام حساس و مقاوم گندم RNA استخراج و روی ژل آگارز 1 درصد الکتروفورز شد. هر دو باند S rRNA18 و S rRNA28 به صورت واضح روی ژل تشخیص داده شد و باند S rRNA28 تقریباً دو برابر باند S rRNA18 بود که نشان دهنده کیفیت خوب RNA بود (شکل 1). الکتروفورز محصول واکنش زنجیرهای پلیمراز با آغازگرهای اختصاصی برای تکثیر ژن رمزکننده پمپ پروتونی غشای پلاسمایی و اکتین در شکل 2 نشان داده شده است. پس از انجام PCR جهت تایید توالی تکثیر شده، محصولات واکنش، همسانه و توالییابی شدند. نتایج blast توالی نشان داد که قطعه تکثیر شده از A. crassa توسط آغازگر اختصاصی برای ژن رمز کننده H+-ATPase غشای پلاسمایی دارای تشابه 98 درصدی (E-value= 3e-37) با ژن رمز کننده پمپ پروتونی غشای پلاسمایی در گندم بود (شکل 3).
شکل 1- ژل تعیین کیفیت RNA کل استخراج شده از دو رقم گندم ارگ و الموت و خویشاوند وحشی A. crassa . 1) نشانگر اندازه 100 جفت بازی 2 و 3) ارگ 4) الموت 5) A. crassa.
Figure 1- Determining the quality of total RNA extracted from two wheat cultivars, Arg and Alamut, and wild relative A. crassa. 1) 100-bp size marker 2 and 3) Arg 4) Alamut 5) A. crassa.
|
|
|
شکل 2- الف) الکتروفورز محصول واکنش زنجیرهای پلیمراز با آغازگرهای اختصاصی برای تکثیر ژن رمز کننده پمپ پروتونی غشای پلاسمایی. 1) نشانگر اندازه 100 جفت بازی 2 و 3) ارگ 4 و 5) الموت 6 و 7) A. crassa. ب) الکتروفورز محصول واکنش زنجیرهای پلیمراز با آغازگرهای اختصاصی برای ژن رمز کننده اکتین. 1 و 2) A. crassa 3) نشانگر اندازه 100 جفت بازی.
Figure 2- a) Electrophoresis of polymerase chain reaction product with specific primers for amplification of the gene encoding plasma membrane proton pump. 1) 100-bp size marker 2 and 3) Arg 4 and 5) Alamut 6 and 7) A. crassa. B) Electrophoresis of polymerase chain reaction product with primers specific for the gene encoding actin. 1 and 2) A. crassa 3) 100-bp size marker.
شکل 3- نتیجه توالییابی محصول واکنش زنجیرهای پلیمراز با آغازگرهای اختصاصی برای تکثیر ژن رمزکننده پمپ پروتونی غشای پلاسمایی.
Figure 3- Sequencing result of PCR product using primers specific for amplification of the gene encoding the plasma membrane proton pump.
بررسی الگوی بیانی ژن رمزکننده پمپ پروتونی غشای پلاسمایی در ارقام گندم مقاوم ارگ، حساس الموت و خویشاوند وحشی A. crassa
نتایج مقایسه میانگین مربوط به بیان ژن مورد نظر بین A. crassa و ارقام حساس و مقاوم گندم در زمانهای مختلف پس از اعمال تنش، در شکل 4 آورده شده است. سه هفته پس از اعمال تنش شوری، بیان ژن رمزکننده پمپ پروتونی غشای پلاسمایی در رقم مقاوم ارگ، خویشاوند وحشی A. crassa و رقم حساس الموت رشد یافته تحت شرایط تنش شوری به ترتیب 91348/18، 25690/4 و 14343/2 برابر در مقایسه با گیاهان رشد یافته در شرایط عدم تنش بود. نتایج نشان داد که سه هفته پس از اعمال تنش شوری، بیان نسبی ژن رمز کننده پمپ پروتونی غشای پلاسمایی در رقم مقاوم ارگ تفاوت معنیداری با رقم حساس الموت و خویشاوند وحشی A. crassa داشت. همچنین بیان ژن مورد بررسی در مدت زمان طولانی (پس از سه هفته) در ژنوتیپ وحشی بیش از رقم حساس افزایش یافت (شکل 4). این موضوع میتواند به دلیل وجود جایگاههای ژنی موثر در تحمل به شوری در ژنوم آنها (Leonova and Chikida, 2011)، و رقم مقاوم ارگ و A. crassa اللهای مقاوم این جایگاهها را به ارث بردهاند درحالیکه رقم حساس الموت فاقد این اللهای مقاوم است.
شکل 4- بیان نسبی ژن رمزکننده پمپ پروتونی غشای پلاسمایی در زمانهای مختلف صفر، 12 ساعت و 3 هفته پس از اعمال تنش شوری در خویشاوند وحشی A. crassa، ارقام مقاوم ارگ و حساس الموت. میانگینهایی که دارای حروف مشابه میباشند با استفاده از آزمون چند دامنهای دانکن و در سطح 5% اختلاف آماری معنیدار با یکدیگر ندارند.
Figure 4- Relative expression of gene encoding plasma membrane proton pump at different times after applying salinity treatment (0, 12 hours and 3 weeks) in A. crassa as wild relative, Arg (resistant cultivar) and Alamut (sensitive cultivar).The same letters are not significantly different using Duncan’s Multiple Range Test (P ≤ 0.05).
نکته مهم دیگری که در نتایج مشاهده شد، کاهش میزان بیان ژن مورد مطالعه در زمان کوتاه پس از اعمال تنش در خویشاوند وحشی بود. این کاهش معنیدار نبوده و و در ارقام زراعی نه تنها این کاهش مشاهده نشد بلکه شاهد افزایش نیز بودیم هرچند این افزایش نیز معنیدار نبود (شکل 4). علت این امر ممکن است سازوکارهای خاصی در A. crassa باشد که برای افزایش کارایی مصرف انرژی در طبیعت بوجود آمدهاند (Moghadam, 2013). ژنوتیپهای وحشی بدلیل سازگاری با شرایط دشوار محیطی و روبرو بودن با انواع تنشها احتمالاً دارای سازوکارهای منحصر به فردی هستند که به آنها امکان ادامه حیات تحت این شرایط را اعطا میکند. این گیاهان همواره سعی در حفظ انرژی دارند به همین دلیل احتمالا گیاه با عدم افزایش رونویسی از ژن رمز کننده پمپ پروتونی غشای پلاسمایی تحت شرایط تنش در کوتاه مدت، از استفاده انرژی بیشتر توسط این پمپ جلوگیری به عمل میآورد و از سازوکارهای دیگری که گیاهان زراعی فاقد آن هستند و انرژی کمتری مصرف میکنند در کوتاه مدت سعی در مقابله با شرایط تنش دارد اما در بلند مدت احتمالاً بدلیل کافی نبودن آن مسیرها از سازوکارهای کاراتر اما با مصرف انرژی بیشتر استفاده میکند.
افزایش بیان ژن رمزکننده پمپ پروتونی غشای پلاسمایی در رقم مقاوم ارگ و خویشاوند وحشی A. crassa میتواند اشاره به اهمیت این پمپ در تحمل به تنش شوری داشته باشد. از آنجا که پمپ پروتونی غشای پلاسمایی مسئول ایجاد شیب پروتونی و تامین انرژی لازم برای انتقال یونها و متابولیتها از طریق این شیب پروتونی میباشد بنابراین افزایش بیان این ژن در رقم مقاوم و ژنوتیپ وحشی میتواند منجر به تعادل یونی در درون سلول و در نتیجه مقاومت به شوری شود. این یافتهها با نتایج سایر محققین مطابقت دارد. بهطوری که et al. (1993) Niu در مقایسه توتون گلایکوفیت وAtriplex nummularia هالوفیت نشان دادند که تجمع رونوشت ژن رمزکننده پمپ پروتونی غشای پلاسمایی در پاسخ به شوری در گیاه هالوفیت نسبت به گلایکوفیت بیشتر بود. همچنین گزارش شده است که در شرایط تنش، میزان تجمع رونوشت ژن رمز کننده پمپ پروتونی غشای پلاسمایی در Suaeda maritime (هالوفیت) و رقم مقاوم به شوری در برنج، بیشتر از رقم حساس برنج بوده است (Sahu and Shaw, 2009). همچنین مشخص شده است که فعالیت این پمپ تحت تنش شوری در رقم حساس گندم (L-Ch20) کاهش و در رقم مقاوم گندم (Y-J24) افزایش مییابد (Yang et al., 2004).
بررسی عناصر تنظیمی و کارکرد آنها میتواند در پیشبینی نقش احتمالی ژنها مفید باشد. آنالیز پیشبرنده ژن رمز کننده پمپ پروتونی غشای پلاسمایی در برنج نشان داد که چندین عنصر پاسخدهنده به تنشها از جمله ABRE (عنصر پاسخدهنده به هورمون آبسیزیک اسید)، Box-W1(عنصر پاسخدهنده به عصاره قارچی)، ERE (عنصر پاسخدهنده به اتیلن)، GARE-motif (عنصر پاسخدهنده به جیبرلین)، TC-rich repeats (عنصر پاسخدهنده به تنش و دفاع گیاهی)، HSE (عنصر پاسخدهنده به تنش گرمایی)، TCA-element (عنصر پاسخدهنده به سالسیلیک اسید)، CGTCA-motif و TGACG-motif (عناصر پاسخدهنده به متیلجاسمونات)،GT-1 motif (عنصر پاسخ به شوری و عامل بیماریزا) و عناصر پاسخدهنده به نور در این ناحیه وجود دارند (شکل 5). همچنین در این ناحیه تعدادی از جایگاههای عوامل رونویسی مربوط به ABI4 (AP2 domain transcription factor)، MYB4، Dof1، ERELEE4 (Ethylene-responsive transcription factor 4)، MYB1AT، Dof zinc finger protein PBF، WRKY71،GT-1 like transcription factor موجود میباشند که نقش آنها در پاسخ به تنشهای مختلف غیرزیستی مشخص شده است (Park et al., 2004; Mattana et al., 2005; Vannini et al., 2006; Huerta-Ocampo et al., 2011; Mizoi et al., 2012; Narsai et al., 2013). با توجه به اینکه پیشبرنده ژن رمزکننده پمپ پروتونی غشای پلاسمایی دارای عناصر پاسخدهنده به هورمون آبسیزیک اسید میباشد، به احتمال زیاد این ژن در مسیر وابسته به آبسیزیک اسید فعالیت دارد. همچنین با توجه به عناصر مختلف پاسخدهنده به تنشهای مختلف، پیشبرنده این ژن یک پیشبرنده القاپذیر در تنشهای زیستی و غیرزیستی میباشد. پیشبرندههای القاپذیر ابزار مفیدی در بهبود مقاومت به تنشهای مختلف محسوب میشوند.
|
|
|
|
|
GT-1 motif |
|
GT-1 motif |
شکل 5- عناصر پاسخ دهنده به تنش در پیشبرنده ژن رمز کننده پمپ پروتونی غشای پلاسمایی در برنج.
Figure 5- Responsive elements involved in stress responsiveness in promoter region of the gene encoding plasma membrane proton pump in rice.
تا به امروز فقدان دانش کافی در رابطه با سازوکارهای مولکولی تحمل به شوری و ژنهای مؤثر در مقاومت، موجب ایجاد محدودیت در ایجاد گیاهان مقاوم به شوری شده است (Chinnusamy et al., 2005; Munns & Tester, 2008). بنابراین، اطلاعات حاصل از بررسی بیان ژنهای مرتبط با تحمل به شوری و درک سازوکارهای تحمل به تنش اهمیت زیادی دارند.
بررسی الگوی بیانی ژن رمزکننده پمپ پروتونی غشای پلاسمایی نشان داد که بیان نسبی آن در ژنوتیپهای مقاوم سه هفته پس از تنش افزایش بیشتری نسبت به رقم حساس داشت. این نتایج میتواند بیانگر نقش مهم این ژن در اعطای تحمل به شوری و امکان استفاده کاربردی از آن به عنوان ژن هدف برای انتقال به گیاهان حساس به منظور افزایش تحمل در آنها باشد. به عبارت دیگر به نظر میرسد با افزایش بیان ژن رمزکننده پمپ پروتونی غشای پلاسمایی از طریق افزایش تعداد نسخههای این ژن در گیاهان، از طریق مهندسی ژنتیک، امکان افزایش تحمل آنها نسبت به تنش شوری وجود دارد.
سپاسگزاری
هزینههای این تحقیق توسط دانشگاه شیراز پرداخت شده است که موجب تشکر و قدردانی است.
منابع
Ahn SJ, Im YJ, Chung GC, Seong KY, Cho BH (2000). Sensitivity of plasma membrane H+-ATPase of cucumber root system in response to low root temperature. Plant Cell Reports 19: 831-835.
Alvarez I, Tomaro M, Benavides M (2003). Changes in polyamines, proline and ethylene in sunflower calluses treated with NaCl. Plant Cell, Tissue and Organ Culture 74: 51-59.
Apse MP, Blumwald E (2007). Na+ transport in plants. FEBS Letters 581: 2247-2254.
Binzel ML (1995). NaCl-induced accumulation of tonoplast and plasma membrane H+-ATPase message in tomato. Physiologia Plantarum 94: 722-728.
Chen M, Song J, Wang BS (2010). NaCl increases the activity of the plasma membrane H+-ATPase in C3 halophyte Suaeda salsa callus. Acta Physiologiae Plantarum 32: 27-36.
Chinnusamy V, Jagendorf A, Zhu JK (2005). Understanding and improving salt tolerance in plants. Crop Science. 45: 437-448.
Felle H (1982). Effects of fusicoccin upon membrane potential resistance and current-voltage characteristics in root hairs of Sinapis alba. Plant Science Letters 25: 219-225.
Flowers TJ (2004). Improving crop salt tolerance. Journal of Experimental Botany 55: 307-319.
Frias I, Caldeira MT, Perez-Castineira JR, Navarro-Avino JP, Culianez-Macia FA, Kuppinger O, Stransky H, Pages M, Hager A, Serrano R (1996). A major isoform of the maize plasma membrane H(+)-ATPase: characterization and induction by auxin in coleoptiles. Plant Cell 8: 1533-1544.
Fuglsang AT, Guo Y, Cuin TA, Qiu Q, Song C, Kristiansen KA, Bych K, Schulz A, Shabala S, Schumaker KS, Palmgren MG, Zhu JK (2007). Arabidopsis protein kinase PKS5 inhibits the plasma membrane H+-ATPase by preventing interaction with 14-3-3 protein. Plant Cell 19: 1617-1634.
Gorham J (1990). Salt tolerance in the triticeae: K/Na discrimination in Aegilops species. Journal of Experimental Botany 41: 615-621.
Harms K, Wohner RV, Schulz B, Frommer WB (1994). Isolation and characterization of P-type H(+)-ATPase genes from potato. Plant Molecular Biology 26: 979-988.
Huerta-Ocampo JA, Leon-Galvan MF, Ortega-Cruz LB, Barrera-Pacheco A, De Leon-Rodriguez A, Mendoza-Hernandez G, de la Rosa AP (2011). Water stress induces up-regulation of DOF1 and MIF1 transcription factors and down-regulation of proteins involved in secondary metabolism in amaranth roots (Amaranthus hypochondriacus L.). Plant Biology 13: 472-482.
Janicka-Russak M, Klobus G (2007). Modification of plasma membrane and vacuolar H+-ATPases in response to NaCL and ABA. Journal of Plant Physiology 164: 295-302.
Janicka-Russak M (2011). Plant plasma membrane H+-ATPase in adaptation of plants to abiotic stresses. In: Venkateswarlu B (ed) Abiotic Stress Response in Plants InTech, Rijeka, Croatia, pp. 197–218.
Kanczewska J, Marco S, Vandermeeren C, Maudoux O, Rigaud JL, Boutry M (2005). Activation of the plant plasma membrane H+-ATPase by phosphorylation and binding of 14-3-3 proteins converts a dimer into a hexamer. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 102: 11675-11680.
Kasamo K (2003). Regulation of plasma membrane H+-ATPase activity by the membrane environment. Journal of Plant Research 116: 517-523.
Kerepesi I, Galiba G (2000). Osmotic and salt stress-induced alteration in soluble carbohydrate content in wheat seedlings. Crop Science. 40: 482-487.
Leonova TG, Chikida NN (2011). Assessment of salt tolerance of Aegilops L. from the VIR collection. Russian Agricultural Sciences 37: 283-285.
Lopez-Perez L, Martinez-Ballesta Mdel C, Maurel C, Carvajal M (2009). Changes in plasma membrane lipids, aquaporins and proton pump of broccoli roots, as an adaptation mechanism to salinity. Phytochemistry 70: 492-500.
Maser P, Eckelman B, Vaidyanathan R, Horie T, Fairbairn DJ, Kubo M, Yamagami M, Yamaguchi K, Nishimura M, Uozumi N, Robertson W, Sussman MR, Schroeder JI (2002). Altered shoot/root Na+ distribution and bifurcating salt sensitivity in Arabidopsis by genetic disruption of the Na+ transporter AtHKT1. FEBS Letters. 531: 157-161.
Mattana M, Biazzi E, Consonni R, Locatelli F, Vannini C, Provera S, Coraggio I (2005). Overexpression of Osmyb4 enhances compatible solute accumulation and increases stress tolerance of Arabidopsis thaliana. Physiologia Plantarum 125: 212-223.
Michelet B, Boutry M (1995). The Plasma membrane H+-ATPase (A highly regulated enzyme with multiple physiological functions). Plant Physiology 108: 1-6.
Mizoi J, Shinozaki K, Yamaguchi-Shinozaki K (2012). AP2/ERF family transcription factors in plant abiotic stress responses. Biochimica et Biophysica Acta 2: 86-96.
Moghadam AA, Ebrahimie E, Taghavi SM, Niazi A, Zamansani Babgohari M, Deihimi T, javaheri MD, Ramezani A (2013). How the nucleus and mitochondria communicate in energy production during stress: nuclear MtATP6, an early-stress responsive gene, regulates the mitochondrial F(1)F(0)-ATP synthase complex. Molecular Biotechnology. 54: 756-769.
Munns R, Richards RA (2007). Recent advances in breeding wheat for drought and salt stresses. In: Jenks M, Hasegawa P, Jain SM Advances in molecular breeding toward drought and salt tolerant crops. Springer Netherlands, pp. 565-585.
Munns R, Tester M (2008). Mechanisms of salinity tolerance. Annu Review of Plant Biology. 59: 651-681.
Narsai R, Wang C, Chen J, Wu J, Shou H, Whelan J (2013). Antagonistic, overlapping and distinct responses to biotic stress in rice (Oryza sativa) and interactions with abiotic stress. BMC Genomics 14: 1471-2164.
Niu X, Narasimhan ML, Salzman RA, Bressan RA, Hasegawa PM (1993). NaCl regulation of plasma membrane H(+)-ATPase gene expression in a glycophyte and a halophyte. Plant Physiology 103: 713-718.
Oufattole M, Arango M, Boutry M (2000). Identification and expression of three new Nicotiana plumbaginifolia genes which encode isoforms of a plasma-membrane H(+)-ATPase, and one of which is induced by mechanical stress. Planta 210: 715-722.
Palmgren MG (2001). Plant plasma membrane H+-ATPases: Powerhouses for Nutrient Uptake. Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology 52: 817-845.
Park HC, Kim ML, Kang YH, Jeon JM, Yoo JH, Kim MC, Park CY, Jeong JC, Moon BC, Lee JH, Yoon HW, Lee SH, Chung WS, Lim CO, Lee SY, Hong JC, Cho MJ (2004). Pathogen- and NaCl-induced expression of the SCaM-4 promoter is mediated in part by a GT-1 box that interacts with a GT-1-like transcription factor. Plant Physiology. 135: 2150-2161.
Pfaffl MW (2001). A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-PCR. Nucleic Acids Research 29.
Ravash R, Shiran B, Ebrahimie E, Houshmand SA (2013). Study of S -Like RNase expression in wheat and its wild relatives under drought stress. Journal of Agricultural Biotechnology. 9: 27-38.
Saeedpour A, Kavousi HR, MohamadiNejad GH, Khosravi S (2014). Gene expression analysis of NHX to salinity stress in safflower (CarthamustinctoriusL.). Journal of Agricultural Biotechnology. 16: 91-100.
Sahi C, Singh A, Blumwald E, Grover A (2006). Beyond osmolytes and transporters: novel plant salt-stress tolerance-related genes from transcriptional profiling data. Physiologia Plantarum 127: 1-9.
Sahu BB, Shaw BP (2009). Salt-inducible isoform of plasma membrane H+ATPase gene in rice remains constitutively expressed in natural halophyte, Suaeda maritima. Journal of Plant Physiology 166: 1077-1089.
Shen P, Wang R, Jing W, Zhang W (2011). Rice phospholipase Dalpha is involved in salt tolerance by the mediation of H(+)-ATPase activity and transcription. Journal of Integrative Plant Biology 53: 289-299.
Surowy TK, Boyer JS (1991). Low water potentials affect expression of genes encoding vegetative storage proteins and plasma membrane proton ATPase in soybean. Plant Molecular Biology 16: 251-262.
Tuteja N (2007). Abscisic Acid and abiotic stress signaling. Plant Signaling and Behavior 2: 135-138.
van der Hoeven PC, Siderius M, Korthout HA, Drabkin AV, de Boer AH (1996). A calcium and free fatty acid-modulated protein kinase as putative effector of the fusicoccin 14-3-3 receptor. Plant Physiology 111: 857-865.
Vannini C, Iriti M, Bracale M, Locatelli F, Faoro F, Croce P, Pirona R, Di Maro A, Coraggio I, Genga A (2006). The ectopic expression of the rice Osmyb4 gene in Arabidopsis increases tolerance to abiotic, environmental and biotic stresses. Physiological and Molecular Plant Pathology 69: 26-42.
Yang YL, Guo JK, Zhang F, Zhao LQ, Zhang LX (2004). NaCl induced changes of the H+-ATPase in root plasma membrane of two wheat cultivars. Plant Science. 166: 913-918.
Zhu, JK (2003) Regulation of ion homeostasis under salt stress. Current Opinion in Plant Biology. 6: 441-445.
Assessment of the expression pattern of a gene encoding plasma membrane pump under salt stress in the shoots of resistant and sensitive wheat cultivars and its wild relative, Aegilops crassa
Zinati Z.1, Alemzadeh A.* 2, Ebrahimie E.3, Niazi A.3
1 Assist. Prof. of plant breeding, Agroecology Department, College of Agriculture and Natural Resources of Darab, Iran
2 Assoc. Prof. of molecular biotechnology, Crop Production and Plant Breeding Department, College of Agriculture, Shiraz University, Shiraz, Iran.
3Assoc. Prof. of molecular genetics and genetic engineering, Center of Biotechnology, College of Agriculture, Shiraz University, Shiraz, Iran
Abstract
Plasma membrane proton pump (H+-ATPase) has important roles in various physiological processes. Hence, the expression pattern of the gene which encodes a plasma membrane proton pump was surveyed in the shoots of resistant and sensitive wheat cultivars and its wild relative, Aegilops crassa under salinity stress. Salinity stress induced by adding 150 mM NaCl to the basic solution and sampling was performed in three intervals: 0, 12 h and 3 weeks after applying salinity treatment. A quantitative PCR technique was used to study the relative expression of the gene of interest and a gene encoding actin was used as the reference gene to normalize the samples. The results showed that the expression level of the gene encoding plasma membrane proton pump significantly increased in response to salt stress after 3 weeks in comparison to 12 h after applying salinity treatment. It also revealed that the expression level of the gene was significantly higher in the resistant cultivar, Arg, than sensitive cultivar and Aegilops crassa. It revealed that the expression level of the gene was not significantly different in sensitive cultivar under salinity treatment in different times after salinity treatment. The bioinformatics analysis of promoter region of the gene encoding plasma membrane proton pump showed that various motifs within this region involved in response to abiotic stress and light. Overall, bioinformatics and laboratory studies revealed that gene encoding a plasma membrane proton pump plays a role in induction of salinity tolerance.
Keywords: Gene expression, Salt stress, Proton pump, Wheat.
)
