Comparison of Genetic and Morpho-physiological Distance via SDS-PAGE Marker in Some Rapeseed Genotypes

Document Type : Research Paper

Authors

Abstract

Oilseed crops such as rapeseed have the important role in the production of energy for humans. The most important part of plant breeding programs understanding of genetic diversity to classify population based on different markers for selecting the suitable parents. In this research, genetic diversity of 16 genotypes of rapeseed was evaluated using SDS-PAGE protein markers and morpho-physiological traits in the field and laboratory conditions. Extraction of leaf proteins was performed before physiological maturity and then concentration of proteins was measured by Bradford method. For separating and patterning of the extracted proteins, SDS-PAGE technique via poly acrylamide electrophoresis was used. After staining of proteins by coomassie blue R-250 and scoring of the bands, cluster analysis was computed based on Jaccard coefficient which that the genotypes classified into 2 separate groups. Results of cluster analysis based on agronomical traits shown that the studied genotypes classified into 5 groups. Correlation between morphological and molecular traits was assessed using Mantel test and significant positive correlation was observed between them. Thus according to genetic distances between the genotypes, we can use cross between Milena and Dante for obtain the highest amount of heterosis in future breeding program and hybridization between Opera and Sahara based on morpho-physiological  markers according to  similarity coefficient is justified.
 

Keywords

Full Text

مقایسه فاصله ژنتیکی و مورفوفیزیولوژیکی برخی از ژنوتیپ­های کلزا بر اساس نشانگر SDS-PAGE  

مهدی کاکایی1، علیرضا زبرجدی* ،٢، علی مصطفایی3

١ مربی دانشگاه پیام نور- گروه علمی مهندسی کشاورزی (ژنتیک و اصلاح نباتات)- تهران 4697-19395- ج. ا. ایران. و دانش آموخته دانشگاه آزاد اسلامی واحد کرمانشاه

2 استادیار گروه زراعت و اصلاح نباتات، دانشکده کشاورزی، و استادیار گروه پژوهشی بیوتکنولوژی مقاومت به خشکی، دانشگاه رازی.

3 استاد مرکز تحقیقات بیولوژی پزشکی، دانشگاه علوم پزشکی کرمانشاه.

 

 

چکیده

گیاهان دانه روغنی نظیر کلزا نقش مهمی در تولید انرژی برای انسان دارند. اطلاع از تنوع ژنتیکی بر پایه نشانگرهای گوناگون در برنامه­های به­نژادی، و از جمله انتخاب والدین نقش مهمی دارد. در تحقیق حاضر، تنوع ژنتیکی 16 ژنوتیپ کلزا به کمک نشانگر پروتئینی SDS-PAGE و صفات مورفوفیزیولوژیکی در شرایط مزرعه و آزمایشگاه مورد ارزیابی قرار گرفت. استخراج پروتئین­های برگ در مرحله قبل از رسیدگی فیزیولوژیکی انجام شد و غلظت پروتئین­ها توسط روش برادفورد تعیین گردید. سپس برای تفکیک پروتئین­های استخراجی، از روش الکتروفورز ژل پلی­اکریل آمید در حضور سدیم دو دسیل سولفات استفاده شد. پس از رنگ­آمیزی ژل پلی­اکریل آمید با کوماسی بلو R-250 و امتیازدهی باندها، تجزیه خوشه­ای بر اساس ضریب تشابه جاکارد انجام شد و بر این اساس ژنوتیپ­ها در دو کلاس مجزا قرار گرفتند. نتایج حاصل از تجزیه خوشه­ای بر مبنای صفات مورفوفیزیولوژیکی نشان داد که ژنوتیپ­های مورد مطالعه در 5 گروه قرار  می­گیرند. به­ منظور تعیین همبستگی بین صفات مورفوفیزیولوژیکی و ملکولی از آزمون مانتل استفاده گردید و همبستگی معنی­داری بین صفات مورفوفیزیولوژیکی و داده­های ملکولی مشاهده شد. بنابراین، با توجه به فواصل ژنتیکی ژنوتیپ­ها نسبت به هم، در برنامه­های به­نژادی برای بدست آوردن بالاترین مقدار هتروزیس، تلاقی ژنوتیپ­هایMilena  و  Operaو نیز ژنوتیپ­هایDante  با Sahara با توجه ضرایب تشابه نشانگرهای مورفوفیزیولوژیکی قابل توجیه است.

واژه­های کلیدی: کلزا، نشانگر پروتئینی، فاصله ژنتیکی، صفات زراعی

 


مقدمه

کلزا (Brassica napus L.)، از تیره چلیپائیان می باشد که یک گونه آمفی دیپلوئید طبیعی حاصل از تلاقی گونه روغنی (B. rapa) با شلغم روغنی (B. oleracea) و دو برابر شدن کروموزوم­های هیبرید حاصل می­باشد. کلزا گیاه روغنی نسبتاً جدیدی است که امروزه به طور گسترده در بسیاری از کشورها کشت می­شود (Weiss, 1983). دانه­های روغنی پس از غلات دومین ذخایر غذایی جهان را تشکیل می­دهند، این محصولات علاوه بر دارا بودن ذخایر غنی اسید چرب، حاوی پروتئین هم هستند. کلزا به عنوان یکی از مهمترین گیاهان روغنی در سطح جهان مطرح بوده و حدود 13 درصد روغن خوراکی جهان را تأمین می­کند. کلزا در بین گیاهان روغنی، بدلایل زیادی از اولویت برخوردار است و به جهت نیاز کشور به دانه­های روغنی، همواره سطح زیر کشت آن در حال افزایش است (2009-a et al., Kakaei).

وجود تنوع ژنتیکی جهت انتخاب والدین در برنامه­های اصلاح نباتات دارای اهمیت زیادی می­باشد. از جمله روش­های بررسی تنوع ژنتیکی، می­توان به روش­های مورفولوژیکی، مولکولی و بیوشیمیایی اشاره کرد. اطلاع درباره تنوع و ارتباط ژنتیکی میان ژنوتیپ­ها کمک بزرگی در تعیین راهبرد­های توسعه محصولات به شمار می­رود. الکتروفورز ژل اکریل آمید با حضور سدیم دو دسیل سولفات از جمله تکنیک­های پر استفاده است که در جدا سازی و تشخیص پروتئین کارآیی بالایی دارد (Laemmli, 1970). پروتئین­ها بطور مستقیم توسط اسیدهای نوکلئیک کد گذاری می­شوند بنابراین از نظر ژنتیکی، اختلاف در پروتئین­ها باید در تغییر رفتار الکتروفورزی بیان شود Mahmoudzadeh et al., 2003)).

 Shahnejate-Bushehriو همکاران (2005)، در مطالعه مقایسه فاصله ژنتیکی و مرفولوژیکی با هتروزیس بر اساس نشانگر RAPD در هیبریدهای جو گزارش کردند که الگوی نواری RAPD هیچ همسویی با صفات مرفولوژیک و زراعی نداشته است. Fareghi  و همکاران (2007)، پروتئین­های بذر و برگ یونجه را با SDS-PAGE مورد بررسی قرار دادند و تنوع باندی را بین آنها مشاهده کردند.

در سال 2004،  Mukhlesur & Hirata فاصله ژنتیکی گونه­های مختلف کلزا را بر اساس الگوی باندی پروتئین (SDS-PAGE)  بذر و برگ،  مطالعه و تنوع باندی را بین آن­ها گزارش کردند. مطالعه فاصله ژنتیکی بر اساس نشانگرهای ملکولی و مورفولوژیکی توسط دیگر محققان گزارش شده است (Fufa et al., 2005; Abbasi et al., 2009; Celebi et al., 2009; Kakaei et al., 2009).

تحقیق حاضر با اهداف زیر اجراء گردید:

(1) بررسی تنوع ژنتیکی ژنوتیپ­های مختلف کلزا بر اساس نشانگر پروتئینی، (2) مقایسه نتایج حاصل از روش­های مورفوفیزیولوژیکی و ملکولی بر اساس نشانگر پروتئینی در تعیین تنوع ژنوتیپ­ها و (3) دسته­بندی ژنوتیپ­های مورد مطالعه با استفاده از تجزیه خوشه­ای بر مبنای صفات مورفوفیزیولوژیکی و ملکولی .

 

مواد و روش­ها

مواد گیاهی

در این آزمایش 16 ژنوتیپ کلزا بشرح جدول 1 در سال زراعی 87-1386 در قالب طرح بلوک­های کامل تصادفی[1] (RCBD) با 3 تکرار، در مزرعه آزمایشی دانشکده کشاورزی دانشگاه رازی با اقلیم نیمه خشک سرد تا معتدل مورد ارزیابی قرار گرفتند. هر کرت شامل 5 خط 3 متری به فاصله 30 سانتی­متر و فاصله کرت­ها از هم 60 سانتی­متر بود. صفات اندازه­گیری شده شامل عملکرد دانه، تعداد دانه در نیام، طول نیام، تعداد نیام در شاخه اصلی، تعداد نیام در شاخه فرعی، تعداد شاخه فرعی در بوته، وزن هزار دانه، قطر نیام، میزان قند محلول به روش (Kennedy, 1987)، میزان تجمع پرولین (Bates et al., 1973)، پروتئین کل (Mostafaie, 2003)،  مقدارنسبی آب برگ (Egret & Tevini, 2002) ، میزان آب نگهداری شده در برگ­های قطع شده، کاهش نسبی آب برگ (Tourneux et al., 2003)، میزان آب نسبی از دست رفته (Yang et al., 1991)، فلورسانس، درصد سبزینگی برگ، تعداد روز تا نیام­دهی کامل، تعداد روز تا اواسط گلدهی، طول دوره پر شدن دانه، تعداد روز تا رسیدگی فیزیولوژیک، ارتفاع بوته، نشت یونی به روش (Jiang & Huang, 2002)، قطر ساقه و تاریخ سبز شدن بودند. کلیه صفات فوق الذکر بر اساس روش­های معمول و استاندارد اندازه­گیری شدند (Kakaei, 2009).

 

استخراج پروتئین برگ

نمونه ­3/0 گرمی از برگ­های گیاهی (به تصادف از سه گیاه) برداشت شده از هر پلات داخل هاون چینی در ازت مایع کوبیده و پودر شد. سپس 8/0 میلی­لیتر بافر استخراج کننده حاوی (تریس 50 میلی مولار با  pH5/8 حاوی EDTA 1 میلی مولار، PMSF 1 میلی مولار، MgCl2 20 میلی مولار،2/0%NP-40,  ،2% 2-Mercaptoethanol) مخلوط گردید بر روی نمونه­ها در میکروتیوپ­های 2 میلی­لیتری اضافه گردید. محتویات داخل هاون با بافر استخراج کاملاً مخلوط گردید، و به­صورت همگن در آمد. میکروتیوپ­ها به مدت یک ساعت در یخچال (4 درجه سانتی­گراد) نگهداری شدند و سپس 1 میلی­لیتر از مخلوط TCA- Aseton  به میکروتیوپ­ها اضافه شد، و به­مدت 1 ساعت در دمای20- نگهداری شد. سپس میکروتیوپ­ها با دور rpm 13500 سانتریفیوژ شد. محلول رویی دور ریخته شد، به رسوب باقیمانده استون اضافه کرده و پس از 5/0 ساعت نگهداری در یخچال، سانتریفیوژ در مدت 10 دقیقه در دمای یخچال و دور rpm 13500 انجام گرفت و محلول رویی دور ریخته شد و پودر سفید رنگ (پروتئین استخراجی) باقی می­ماند. بعد از استخراج پروتئین­های برگ، مقدار پروتئین به روش Bradford, 1979)) اندازه گیری شد.

 

الکتروفورز پروتئین برگ استخراجی

در این تحقیق برای الکتروفورز پروتئین از روش SDS-PAGE استفاده شد. SDS-PAGE در ژل جدا کننده  5/12 درصد و ژل متراکم کننده 5 درصد به روش لاملی با بعضی تغییرات انجام گرفت Mostafaie, 2003)). ابتدا مقدار پروتئین نمونه­ها به روش فوق تعیین و سپس مقدار 15 میکرولیتر از هر نمونه با غلظت یکسان روی ژل بار گذاری گردید. از پروتئین های اوترانسفرین (78 کیلو دالتون)، آلبومین گاوی (66 کیلو دالتون)، اوآلبومین (45 کیلو دالتون)، اکتینیدین (29 کیلو دالتون)، بتا- لاکتوگلوبولین (18 کیلو دالتون) و لیزوزیم (14 کیلو دالتون) به عنوان نشانگر در ژل استفاده گردید. الکتروفورز با ولتاژ 50 ولت در ژل متراکم کننده به­مدت 5/0 ساعت و ولتاژ 150ولت در ژل جدا کننده به مدت 5/1 ساعت با دستگاه پاور ساپلای نوع Vocam انجام شد.

 

رنگ آمیزی ژل پلی اکریل آمید

بعد از الکتروفورز، کار رنگ آمیزی با کوماسی بلو بریلیانت R-250 صورت گرفت، پس از 1 ساعت قرار گرفتن ژل در محلول رنگ، رنگ­بری آن توسط محلول رنگ بر (متانول) اسیداستیک گلاسیال و آب مقطر تا روشن شدن زمینه ژل ادامه یافت و سپس ژل توسط اسکن نوع HP، اسکن گردید. مطالعات الکتروفورزی مواد در آزمایشگاه الکتروفورز مرکز تحقیقات بیولوژی پزشکی دانشگاه علوم پزشکی کرمانشاه انجام گرفت.

 

رتبه­بندی و تجزیه آماری داده­ها

باندها بر اساس حضور و عدم حضور در هر نمونه امتیازدهی شدند. ماتریس دو طرفه ارقام و متغیرها بر اساس صفر و یک تشکیل شده و سپس آنالیز داده­ها با استفاده از نرم افزار NTsys pc Version 2.02e انجام گرفت. تجزیه کلاستر بر اساس ضریب تشابه جاکارد صورت گرفت و در نهایت دندروگرام بر اساس روش UPGMA ترسیم شد. جهت بررسی همسویی و مقایسه نتایج داده­های ملکولی و داده­های زراعی از آزمون مانتل استفاده گردید. بدین منظور داده­های کمی کد گذاری گردیده و به داده­های کیفی تبدیل گردیدند، سپس ماتریس ضرایب تشابه جاکارد برای آنها محاسبه گردید. به­منظور انجام آزمون مانتل محاسبه ماتریس تشابه ژنوتیپ­ها بر اساس داده های کمی (مربوط به اندازه­گیری های مورفوفیزیولوژیکی) و داده­های کیفی (مربوط به باندهای پروتئینی) لازم است ابتدا، با روش کدگذاری داده­های کمی به کیفی تبدیل شده و سپس ماتریش تشابه آن­ها محاسبه شود. رسم هیستوگرام آزمون مانتل نشانگر پروتئینی با داده­های زراعی توسط نرم افزار XL-STAT انجام پذیرفت.

 

نتایج و بحث

در مجموع برای ژنوتیپ­های مورد مطالعه 35 باند (شامل باندهای ضعیف و قوی) مشاهده گردید (شکل 1 و 2)، اگرچه باندهای پروتئینی مشترک زیادی در بین ژنوتیپ­های مذکور وجود داشت، امّا باندهای اختصاصی نیز مشاهده گردید که خاص هر ژنوتیپ بودند. باندهای پروتئینی علاوه بر اینکه از نظر محل قرار گرفتن روی ژل و وزن ملکولی متفاوت بودند از نظر تراکم و شدت نیز با یکدیگر تفاوت نشان دادند. بر اساس ماتریس تشابه بر مبنای ضریب جاکارد (جدول 2) کمترین تشابه و بیشترین فاصله ژنتیکی بین ژنوتیپ های Rainbow با Licord، Celecious با ARC-5 با ضریب تشابه صفر می­باشد. که می­توان جهت بدست آوردن بیشترین مقدار هتروزیس، از تلاقی آنها بهره برد، و بیشترین تشابه و کمترین فاصله ژنتیکی مربوط به ژنوتیپ Milena با Dante، SLM-046، Geronimo و Zarfamبا ضریب تشابه 1 و ژنوتیپ Celecious با ARC-5 - Geronimo با SLM-046 - Zarfam با SLM-046وGeronimo و ARC-2  با Talent دارای ضریب تشابه 1 بودند.

 

جدول 1- ژنوتیپ­های مورد استفاده در آزمایش.

مبداء

Source

 

ژنوتیپ

Genotypes

کد ژنوتیپ

Genotype code

 

Germany

Licord

G1

Germany

Milena

G2

Danisco

Sahara

G3

Svalof

Celecious

G4

Danisco

Sunday

G5

Iran

Talaye

G6

Australia

Shiralee

G7

Germany

Dante

G8

U.S.A

ARC-2

G9

U.S.A

ARC-5

G10

Germany

SLM-046

G11

Rostica-france

Geronimo

G12

Iran

Zarfam (Reg*Cob)

G13

Germany

Talent

G14

Australia

Rainbow

G15

Sw-sweden

Opera

G16

                                      Table 1- Genotypes used in experiment.

 

 

شکل 1-  تفکیک پروتئین­های محلول برگی ژنوتیپ­های کلزا با استفاده  .SDS-PAGE

Genotypes: (G1)Milena, (G2) Sahara, (G3) Celecious, (G4) Sunday, (G5) Talaye, (G6)Shiralee and (G7)Licord.

Figure 1- Separation of soluble leaf proteins of rapeseed genotypes using SDS-PAGE.

 

 

 

شکل 2- تفکیک پروتئین­های محلول برگی ژنوتیپ­های کلزا با استفاده SDS-PAGE.

Genotypes: (G8) Dante, (G9) ARC-2, (G10)ARC-5, (G11)SLM-046, (G12)Geronimo, (G13)Zarfam, (G14) Talent, (G15) Rainbow, (G16) Opera

Figure 2- Separation of soluble leaf proteins of rapeseed genotypes using SDS-PAGE.

 

 

 

 

 

 

 

شکل 3 دندروگرام حاصل از نشانگر پروتئینی بر اساس ضریب جاکارد را نشان می­دهد (ضریب کوفنتیک برای آن 9/0r = می­باشد که برازش مناسب دندروگرام با داده­ها را نشان می­دهد). با توجه به این تجزیه، ژنوتیپ­ها  در فاصله 58/0 در دو گروه قرار گرفت: گروه اول شامل ژنوتیپ­های 1 ،2، 3، 4، 5، 6، 7، 8، 9، 10، 11، 12، 13، 14 و 16 و گروه دوم شامل ژنوتیپ شماره 15 می­باشد. جدول 3 ماتریس تشابه جاکارد بر اساس نشانگر مورفوفیزیولوژیکی (داده­های زراعی) را نشان می­دهد. بر اساس داده­های جدول 3 مشخص شد که کمترین تشابه و بیشترین فاصله ژنتیکی بین ژنوتیپ Milena و Opera با ضریب تشابه 17/0 و ژنوتیپDante  با Sahara با ضریب تشابه 17/0، ژنوتیپ Licord با ژنوتیپ Geronimo و Licord با ضریب تشابه 18/0 بود. بر طبق جدول مذکور بیشترین شباهت و کمترین فاصله ژنتیکی مربوط به ژنوتیپ  SundayباCelecious  با ضریب تشابه 61/0 می­باشد. نتایج حاصل از تجزیه خوشه­ای داده­های مورفوفیزیولوژیکی بر اساس ضریب ضریب جاکارد در شکل 4 ارائه شده است. بر اساس این تجزیه، ژنوتیپ­ها در فاصله 39/0 به 5 گروه تقسیم شدند: گروه اول شامل ژنوتیپ­های 1، 2 و 13، گروه دوم ژنوتیپ شماره 3، گروه سوم شامل ژنوتیپ­های (4، 5، 6، 7، 8، 10، 11، 12 و 14)، گروه چهارم ژنوتیپ 9 و در گروه پنجم ژنوتیپ­های 15 و 16 قرار گرفت. ماتریس ضریب تشابه جاکارد حاصل از نشانگر پروتئینی و داده­های مورفوفیزیولوژیکی با استفاده از آزمون مانتل با هم مقایسه شدند (شکل 5). نتایج نشان داد که ژنوتیپ­هایی که بر اساس داده­های کمی شباهت بیشتری با هم دارند از نظر داده­های ملکولی (نشانگر پروتئینی) نیز شباهت بیشتری با هم دارند، در نتیجه تنوع در سطح مولکولی، تنوع در سطح مزرعه را تأیید می­کند. بنابراین در بین ژنوتیپ­های مورد مطالعه تنوع وجود داشته که با توجه به فواصل ژنتیکی ژنوتیپ­ها نسبت به هم در برنامه­های به­نژادی برای بدست آوردن بالاترین مقدار هتروزیس، تلاقی ژنوتیپ Milena  و Opera و نیز ژنوتیپ­هایDante  با Sahara با توجه ضرایب تشابه نشانگرهای مورفوفیزیولوژیکی قابل توجیه است. جهت موفقیت برنامه­های به­نژادی، اطلاع از میزان قرابت ژنتیکی والدین حائز اهمیت است. بر اساس نتایج بدست آمده تنوع ژنتیکی خوبی بین ژنوتیپ­های مورد بررسی وجود دارد.

 

 

 

 

 

 

 

 

شکل3- دندروگرام حاصل از نشانگر پروتئینی بر اساس ضریب جاکارد.

Figure 3- Dendrogram obtained from protein markers based on the Jaccard's coefficient.

 

 

شکل 4-  دندروگرام حاصل از داده­های کیفی مورفوفیزیولوژیک بر اساس ضریب جاکارد.

Figure 4- Dendrogram obtained from qualitative of morpho-physiological data based on the Jaccard's coefficient.

 

 

 

شکل 5- هیستوگرام آزمون مانتل نشانگر پروتئینی با داده­های مورفوفیزیولوژیکی. این نمودار توزیع p-value دو دامنه را نشان می­دهد (فلش قرمز مقدار p-value  مربوط به همبستگی محاسبه شده را نشان می­دهد). بنابراین با توجه به این مقدار می­توان در مورد مقدار همبستگی و معنی­دار بودن آن قضاوت نمود.

Figure 5- Histogram of Mantel test for protein marker with morpho-physiological data.  This graph was shown two tailed distribution of P-value (the red arrow revealed the amount of P-value related to calculated correlation). Thus according to it, the amount and significance of correlation could be Judged.   

 

 

بررسی تنوع ژنتیکی بر اساس صفات زراعی، نشانگرهای پروتئینی، ایزوزیم­ها و نشانگرهای DNA به­طور جداگانه و همزمان توسط محققین مختلف در برخی گیاهان گزارش شده است(Rousseeuw, 1990; Weegels et al., 1996; Waines & Murphy 2005; Kole, 2006; Bhutta, 2006; Kumar & Miaja, 2007; Leal et al., 2008; Hettel et al., 2008; Ruiz et al., 2007).

Rafezi و همکاران (2009) کاربرد نشانگر بیوشیمیایی (پروتئین­ها) در مطالعه جمعیت­های آگروپیرون و بررسی تشابه بین گونه­ها را بر اساس ضریب تشابه جاکارد مطالعه کردند، و جمعیت­هایی که بیشترین فاصله ژنتیکی را با هم داشتند جهت تلاقی و دستیابی به بیشترین هتروزیس پیشنهاد کردند. Salem و همکاران 2008، در مطالعه تنوع ژنتیکی برخی ژنوتیپ­های گندم بر اساس نشانگر DNA (ریزماهواره) و صفات مورفولوژیکی تفاوت معنی­داری در بین واریته­های مورد مطالعه بر اساس صفات مورفولوژیکی و نشانگر مولکولی میکروساتلایت گزارش کردند. Moradi (2008)، ماتریس­های تشابه حاصل از نشانگر RAPD و داده­های زراعی در برخی ژنوتیپ­های گندم دوروم را با استفاده از آزمون مانتل را مقایسه کرد و مشاهدات زراعی و نشانگر RAPD را همسو گزارش کرد، که با نتایج مطالعه حاضر مطابق بود. Yu و همکاران (2005)، فواصل ژنتیکی بین لاین­های کلزا (Brassica napus) را بر اساس صفات مورفولوژیکی، ایزوزیم­ها، پروتئین­ها و نشانگرهای DNA به­منظور پیش بینی عملکرد و هتروزیس هیبریدها مورد استفاده قرار دادند. فواصل ژنتیکی بدست آمده بر اساس صفات مورفولوژی از 455/0 تا 833/0 با میانگین 648/0، بر اساس صفات مولکولی (RAPD) از 309/0 تا 553/0 با میانگین 434/0 و بر مبنای نشانگر پروتئینی از 143/0 تا 535/0 با میانگین 297/0 محاسبه شد. نتایج مطالعه همبستگی بین این سه نوع فواصل ژنتیکی بدست آمده نشان داد که همبستگی معنی­داری بین آنها مشاهده نشد. از طرف دیگر تشابه ژنتیکی بین کلیه والدین بر مبنای نشانگر پروتئینی و ایزوزیم­ها بیشتر از تشابه بر اساس داده­های مولکولی و مورفولوژیکی بود. Ojaghi & Akhundova  (2010) در مطالعه تنوع ژنتیکی 102 لاین گندم دابل هاپلوئید از صفات مورفولوژیکی، نشانگرهای پروتئینی و RAPD استفاده نمودند. نتایج بدست آمده بیانگر استفاده همزمان از هر سه روش برای مطالعه تنوع ژنتیکی در جمعیت­های گندم نان می­باشد. همچنین مقایسه دندروگرام بدست آمده از صفات مورفولوژیکی با نشانگرهای پروتئینی و RAPD حاکی از تفاوت بین روش­ها در تعیین تنوع ژنتیکی می­باشد. ضریب همبستگی بین صفات مورفولوژیکی و نشانگر پروتئینی (گلیادین) 183/0، بین صفات مورفولوژیکی و نشانگر RAPD، 088/0 در حالیکه ضریب همبستگی بین نشانگر پروتئینی و نشانگر RAPD، 106/0 محاسبه گردید. Raouda و همکاران (2007) تنوع ژنتیکی و روابط بین 14 ژنوتیپ جو را با استفاده از نشانگرهای SSR و صفات فیزیولوژیکی ارزیابی نمودند. اگرچه بر مبنای آزمون مانتل همبستگی پائینی (r =0.276) بین روش­های مورد استفاده دیده شد اما هر کدام از روش­ها به تنهایی تنوع قابل توجهی را بین ژنوتیپ­ها نشان دادند. در مجموع پیشنهاد می­گردد جهت برنامه­های اصلاحی علاوه بر در نظر گرفتن صفات مهم مورفوفیزیولوژیک از صفات مولکولی (در سطح DNA و پروتئین) و روابط بین آن­ها بهره گرفته شود.  

 

سپاسگزاری

بدینوسیله از حمایت مالی دانشگاه رازی و مرکز تحقیقات بیولوژی دانشگاه علوم پزشکی کرمانشاه و کلیه عزیزانی که ما را در اجراء تحقیق و بازبینی مقاله (از جمله سرکار خانم مهندس لیلا زارعی) یاری نموده­اند کمال تشکر می­گردد.

 

جدول 2-  ماتریس تشابه جاکارد بر اساس نشانگر پروتئینی (داده­های مولکولی).

 

Table 2- Jaccard's similarity matrix based on protein marker (molecular data).

 

 

 

جدول 3-  ماتریس تشابه جاکارد بر اساس نشانگر مورفوفیزیولوژیکی (داده­های زراعی).

 

Table 3- Jaccard's similarity matrix based on protein marker (Agronomy data).

 

 

منابع

1.Abbasi SJ, Tullah F, Marwat KB, Khani IA, Muniri I (2009) Molecular analysis of genetic diversity in Brassica species. Pakestan Journal of Botany. 41: 167-176.

2.Bates IS, Waldern RP, Teare ID (1973) Rapid determination of free prolne for water stress. Plant and Soil. 39: 205-207.

3.Bhutta WM, Akhtar J, Ibrahim M, Shahzad A (2006) Genetic variation between Pakistani wheat (Triticum aestivum L.) genotypes as revealed by random amplified polymorphic DNA (RAPD) marker-. African Journal of Botany 72: 280-283.

4.Bradford MM (1979) A rapid and sensitive for the quantization of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-day binding. Analytical Biochemistry 72: 248-254.

5.Celebi A, Acik L, Aytac Z (2009) Biosystematics studies among ebenus L. species based on morphological, RAPD-PCR and seed protein analysis in turkey. Pakestan Journal of Botany. 41: 2477-2486.  

6.Egret M, Tevini M (2002) Influence of drought on some physiological parameters symptomatic for oxidative stress in leaves of chives (Allium choenoprasum). Environmental and Experimental Botany 48: 43-49. 

7.Fareghi SH, Farshadfar M, Farshadfar E (2007) Study of chemical composition and nutrition value of perennial Lucerne (Medicago sativa L.) and genetic diversity based on SDS-PAGE markers. Iranian Journal of Rangelands and Forests Plant Breeding and Genetic Research 15: 196-210.

8.Fufa H, Baenziger PS, Beecher BS, weikat ID, Graybosch RA, Eskridge KM (2005) Comparison of phenotypic and molecular marker-based classifications of hard red winter wheat cultivars. Euphytica 145: 133–146.

9.Hettel M, Gills T, Pomeranz SK (2008) Cluster and principle components analysis of wheat cultivars based upon coefficient of parentage. Journal Plant Genetics 14: 433-441.

  1. Jiang Y, Huang B (2002) Protein Alterations in Tall Fescue in Response to Drought Stress and Abscisic Acid.  Crop Science 42:202-207.
  2. Kakaei M, Mostafaie A,  Zebarjadi A R (2009-b) Protein pattern of seven genotypes of Brassica napus by sodium dodecyl sulfate polyacrylamid gel electrophoresis. Proc. of 6th  National Biotechnology Congress of Iran. Aug. 13-15, 2009. Tehran-Iran. Pp 1-5.
  3. Kakaei M (2009) Effects of genotype and drought stress on physiological, morphological, phonological and biochemical traits in winter rape (Brassica napus L.). M.Sc. Thesis, Islamic azad university, kermansha -Iran.
  4. Kakaei M, Zebarjadi AR, Mostafaie A, Zebarjadi M (2009-a) Evaluation  of oil yield canola under drought stress. Proc. of 1th Iranian oil seed plant Congress, Esfahan university, Iran. Pp 132.
  5. Kaufman L, Rousseeuw PJ (1990) Finding groups in data: An introduction to cluster analysis, John Wiley and Sons, In., New York.
  6. Kennedy JF (1987) Carbohydrate Analysis: A practical approached by M.F. Chaplin, J.F. Kennedy. Oxford.
  7. Kole C (2006) Cereals and Millets (Genome Mapping and Molecular Breeding in Plants). Springer. P. 373.

 

 

  1. Kumar D, Miaja T (2007) Genetic variation between Pakistan wheat (Triticum aestivum L.) based on agromorphological traits, RAPD and SSR markers. Journal Plant Genetics 14: 61-70.
  2. Laemmli, UK (1970) Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 227: 680-685.
  3. Leal M, Brown R, Wei L (2008) Genetic diversity in Triticum tuashii based on morphological traits and storage proteins. Journal Plant Genetics 17: 152-160.
  4. Ruiz M, Aguiriano E, Fite R, Carrillo JM (2007) Combined use of gliadins and SSRs to analyse the genetic variability of the Spanish collection of cultivated diploid wheat (Triticum monococcum L. ssp. monococcum). Genetic Resources and Crop 54: 1849-1860.
  5. Mahmoudzadeh A, Haidari R, Jamalomidi M (2003) Estimation of genetic distance among Tea varieties using protein electrophoresis and polymorphism for esterase. Journal Scinece Natural Resource 2: 73-80.
  6. Moradi A (2008) Evaluation of genetic diversity in genotypes of durum wheat (Triticum turgidum var durum) by using of molecular markers and agronomic traits. M.Sc. Thesis. Razi university., Kermanshah-Iran.
  7. Mostafaie A (2003) Theoretical and practical guide Protein Electrophoresis in Gel. yadavaran Publishers .
  8. Ojaghi J, Akhundova E (2010) Genetic diversity in doubled haploids wheat based on morphological traits, gliadin protein patterns and RAPD markers. African Journal of Agriculture Reasearch 13: 1701-1712.
  9. Rafezi A, Farshadfar M, Farshadfar E (2009). Investigation of intra-specific variation in Agropyron elongatum L. using biochemical (proteins) marker. Iranian Journal of Rangelands and Forests Plant Breeding and Genetic Research 16: 247-253.
  10. Mukhlesur RMd, Hirata Y (2004) Genetic diversity in Brassica species using SDS-PAGE analysis. Journal of Biological Sciences 4: 234-238.
  11. Raoudha A, Hatem CM, M˙barek BN, Chaabane R, Leila BK, Jeannette BH (2007) Simple sequence repeat markers and physiological characterization of some local Tunisian barley accessions. Journal of Cell and Molecular Biology 6: 19-29.
  12. Salem KF, El-Zanaty AM, Esmail RM (2008) Assessing wheat (Triticum aestivum L.) genetic diversity using morphological characters and microsatellite Markers. World Journal of Agricultural Sciences 4: 538-544.  
  13. Shahnejate-bushehri AA, Torabi S, Omidi M, Ghannadha MR (2005) Comparison of genetic and morphological distance with heterosis with RAPD Markers in hybrids of Barley. International Journal of Agriculture and Biology 7: 592- 595.
  14. Tourneux C, Devaux A, Camacho MR, Mamani P, Ledent JF (2003) Effect of water shortage on six potato genotypes in the highlands of Bolivia (II): water relations, physiological parameters. Agronomie 23: 181-190.
  15. Waines SK, Murphy AW (2005) Cluster analysis of breed wheat genotypes grown in divers rainfed environments. Journal Plant Genetics 11: 289-297.
  16. Weegels PL, Hamer RJ, Schofield JD (1996) Functional properties of wheat glutenins. Journal of Cereal Science 23: 1-17.
  17. Weiss EA (1983) Oilseed crops. Longman group limited, New York, USA.
  18. Yang RC, Jana S, Clarke JM (1991) Phenotypic diversity and associations of some potentially drought-responsive characters in durum wheat. Crop Science 31: 1484- 1491.
  19. Yu CY, Hu SW, Zhao HX, Guo AG (2005) Genetic distances revealed by morphological characters, isozymes, proteins and RAPD markers and their relationships with hybrid performance in oilseed rape (Brassica napus L.). Theoretical and Applied Genetics 110: 511-518.

 

 

 

Comparison of Genetic and Morpho-physiological Distance via SDS-PAGE Marker in Some Rapeseed Genotypes

Kakaei M.1, Zabarjadi A.R. 2,*, Mostafaie A.3

 

1 Agriculture (Genetic and Plant Breeding) Department, Payame Noor University, 19395-4697, I. R. of IRAN. and MSc Azad University Branch of Kermanshah.   

2 Dept. of Plant Breeding and Agronomy, Faculty of Agriculture and Dept. of Biotechnology for Environmental Stress Razi university, Kermanshah, Iran.

3 Medical Biology  Research Center, Kermanshah University of Medical Sciences

 

 

 

 

Abstract

Oilseed crops such as rapeseed have the important role in the production of energy for humans. The most important part of plant breeding programs understanding of genetic diversity to classify population based on different markers for selecting the suitable parents. In this research, genetic diversity of 16 genotypes of rapeseed was evaluated using SDS-PAGE protein markers and morpho-physiological traits in the field and laboratory conditions. Extraction of leaf proteins was performed before physiological maturity and then concentration of proteins was measured by Bradford method. For separating and patterning of the extracted proteins, SDS-PAGE technique via poly acrylamide electrophoresis was used. After staining of proteins by coomassie blue R-250 and scoring of the bands, cluster analysis was computed based on Jaccard coefficient which that the genotypes classified into 2 separate groups. Results of cluster analysis based on agronomical traits shown that the studied genotypes classified into 5 groups. Correlation between morphological and molecular traits was assessed using Mantel test and significant positive correlation was observed between them. Thus according to genetic distances between the genotypes, we can use cross between Milena and Dante for obtain the highest amount of heterosis in future breeding program and hybridization between Opera and Sahara based on morpho-physiological  markers according to  similarity coefficient is justified.

 

                                                                                                                  

Key word: Brassica napus, Protein Marker, Genetic Distance, Morpho-physiological traits

 

 

 


* نویسنده مسئول : علیرضا زبرجدی                      تلفن: 08318323731            Email: zebarjadiali@yahoo.com                                           

 1- Randomized Complete Block Design

*Corresponding author : Alireza Zebarjadi                      Email: zebarjadiali@yahoo.com

References

  1. 1.Abbasi SJ, Tullah F, Marwat KB, Khani IA, Muniri I (2009) Molecular analysis of genetic diversity in Brassica species. Pakestan Journal of Botany. 41: 167-176.

    2.Bates IS, Waldern RP, Teare ID (1973) Rapid determination of free prolne for water stress. Plant and Soil. 39: 205-207.

    3.Bhutta WM, Akhtar J, Ibrahim M, Shahzad A (2006) Genetic variation between Pakistani wheat (Triticum aestivum L.) genotypes as revealed by random amplified polymorphic DNA (RAPD) marker-. African Journal of Botany 72: 280-283.

    4.Bradford MM (1979) A rapid and sensitive for the quantization of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-day binding. Analytical Biochemistry 72: 248-254.

    5.Celebi A, Acik L, Aytac Z (2009) Biosystematics studies among ebenus L. species based on morphological, RAPD-PCR and seed protein analysis in turkey. Pakestan Journal of Botany. 41: 2477-2486.  

    6.Egret M, Tevini M (2002) Influence of drought on some physiological parameters symptomatic for oxidative stress in leaves of chives (Allium choenoprasum). Environmental and Experimental Botany 48: 43-49. 

    7.Fareghi SH, Farshadfar M, Farshadfar E (2007) Study of chemical composition and nutrition value of perennial Lucerne (Medicago sativa L.) and genetic diversity based on SDS-PAGE markers. Iranian Journal of Rangelands and Forests Plant Breeding and Genetic Research 15: 196-210.

    8.Fufa H, Baenziger PS, Beecher BS, weikat ID, Graybosch RA, Eskridge KM (2005) Comparison of phenotypic and molecular marker-based classifications of hard red winter wheat cultivars. Euphytica 145: 133–146.

    9.Hettel M, Gills T, Pomeranz SK (2008) Cluster and principle components analysis of wheat cultivars based upon coefficient of parentage. Journal Plant Genetics 14: 433-441.

    1. Jiang Y, Huang B (2002) Protein Alterations in Tall Fescue in Response to Drought Stress and Abscisic Acid.  Crop Science 42:202-207.
    2. Kakaei M, Mostafaie A,  Zebarjadi A R (2009-b) Protein pattern of seven genotypes of Brassica napus by sodium dodecyl sulfate polyacrylamid gel electrophoresis. Proc. of 6th  National Biotechnology Congress of Iran. Aug. 13-15, 2009. Tehran-Iran. Pp 1-5.
    3. Kakaei M (2009) Effects of genotype and drought stress on physiological, morphological, phonological and biochemical traits in winter rape (Brassica napus L.). M.Sc. Thesis, Islamic azad university, kermansha -Iran.
    4. Kakaei M, Zebarjadi AR, Mostafaie A, Zebarjadi M (2009-a) Evaluation  of oil yield canola under drought stress. Proc. of 1th Iranian oil seed plant Congress, Esfahan university, Iran. Pp 132.
    5. Kaufman L, Rousseeuw PJ (1990) Finding groups in data: An introduction to cluster analysis, John Wiley and Sons, In., New York.
    6. Kennedy JF (1987) Carbohydrate Analysis: A practical approached by M.F. Chaplin, J.F. Kennedy. Oxford.
    7. Kole C (2006) Cereals and Millets (Genome Mapping and Molecular Breeding in Plants). Springer. P. 373.

     

     

    1. Kumar D, Miaja T (2007) Genetic variation between Pakistan wheat (Triticum aestivum L.) based on agromorphological traits, RAPD and SSR markers. Journal Plant Genetics 14: 61-70.
    2. Laemmli, UK (1970) Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 227: 680-685.
    3. Leal M, Brown R, Wei L (2008) Genetic diversity in Triticum tuashii based on morphological traits and storage proteins. Journal Plant Genetics 17: 152-160.
    4. Ruiz M, Aguiriano E, Fite R, Carrillo JM (2007) Combined use of gliadins and SSRs to analyse the genetic variability of the Spanish collection of cultivated diploid wheat (Triticum monococcum L. ssp. monococcum). Genetic Resources and Crop 54: 1849-1860.
    5. Mahmoudzadeh A, Haidari R, Jamalomidi M (2003) Estimation of genetic distance among Tea varieties using protein electrophoresis and polymorphism for esterase. Journal Scinece Natural Resource 2: 73-80.
    6. Moradi A (2008) Evaluation of genetic diversity in genotypes of durum wheat (Triticum turgidum var durum) by using of molecular markers and agronomic traits. M.Sc. Thesis. Razi university., Kermanshah-Iran.
    7. Mostafaie A (2003) Theoretical and practical guide Protein Electrophoresis in Gel. yadavaran Publishers .
    8. Ojaghi J, Akhundova E (2010) Genetic diversity in doubled haploids wheat based on morphological traits, gliadin protein patterns and RAPD markers. African Journal of Agriculture Reasearch 13: 1701-1712.
    9. Rafezi A, Farshadfar M, Farshadfar E (2009). Investigation of intra-specific variation in Agropyron elongatum L. using biochemical (proteins) marker. Iranian Journal of Rangelands and Forests Plant Breeding and Genetic Research 16: 247-253.
    10. Mukhlesur RMd, Hirata Y (2004) Genetic diversity in Brassica species using SDS-PAGE analysis. Journal of Biological Sciences 4: 234-238.
    11. Raoudha A, Hatem CM, M˙barek BN, Chaabane R, Leila BK, Jeannette BH (2007) Simple sequence repeat markers and physiological characterization of some local Tunisian barley accessions. Journal of Cell and Molecular Biology 6: 19-29.
    12. Salem KF, El-Zanaty AM, Esmail RM (2008) Assessing wheat (Triticum aestivum L.) genetic diversity using morphological characters and microsatellite Markers. World Journal of Agricultural Sciences 4: 538-544.  
    13. Shahnejate-bushehri AA, Torabi S, Omidi M, Ghannadha MR (2005) Comparison of genetic and morphological distance with heterosis with RAPD Markers in hybrids of Barley. International Journal of Agriculture and Biology 7: 592- 595.
    14. Tourneux C, Devaux A, Camacho MR, Mamani P, Ledent JF (2003) Effect of water shortage on six potato genotypes in the highlands of Bolivia (II): water relations, physiological parameters. Agronomie 23: 181-190.
    15. Waines SK, Murphy AW (2005) Cluster analysis of breed wheat genotypes grown in divers rainfed environments. Journal Plant Genetics 11: 289-297.
    16. Weegels PL, Hamer RJ, Schofield JD (1996) Functional properties of wheat glutenins. Journal of Cereal Science 23: 1-17.
    17. Weiss EA (1983) Oilseed crops. Longman group limited, New York, USA.
    18. Yang RC, Jana S, Clarke JM (1991) Phenotypic diversity and associations of some potentially drought-responsive characters in durum wheat. Crop Science 31: 1484- 1491.
    19. Yu CY, Hu SW, Zhao HX, Guo AG (2005) Genetic distances revealed by morphological characters, isozymes, proteins and RAPD markers and their relationships with hybrid performance in oilseed rape (Brassica napus L.). Theoretical and Applied Genetics 110: 511-518.

     

Agricultural Biotechnology Journal
Volume 1, Issue 2 - Serial Number 2
December 2009
Pages 79-94

Files

Share

How to cite

Statistics