Investigation of genetic diversity of Barley and Virginia tobacco varieties using Amplified Fragment Length Polymorphism

بررسی تنوع ژنتیکی ارقام توتون دسته بارلی و ویرجینیا با استفاده از چند شکلی طولی قطعات تکثیری

احمدرضا دادرس¹، حسین صبوری²، قاسم محمدی­نژاد*³،  عاطفه صبوری⁴، مرداویج شعاعی دیلمی⁵

1- دانشجوی سابق کارشناسی ارشد، بخش زراعت و اصلاح نباتات، دانشکده کشاورزی دانشگاه شهید باهنر کرمان.

2- عضو هیات علمی گروه تولیدات گیاهی، دانشکده کشاورزی و منابع طبیعی، دانشگاه گنبد کاووس.

3- عضو هیات علمی بخش زراعت و اصلاح نباتات، دانشکده کشاورزی دانشگاه شهید باهنر کرمان.

4- عضو هیات علمی گروه زراعت و اصلاح نباتات، دانشکده کشاورزی دانشگاه گیلان.

5- پژوهشگر بخش اصلاح نباتات مرکز تحقیقات توتون رشت.

تاریخ دریافت: 5/5/1391، تاریخ پذیرش: 18/7/1391

چکیده

با توجه به اهمیت توتون از نظر اقتصادی و نقش آن به عنوان یک گیاه مدل در پژوهش­های مولکولی در پژوهش حاضر به بررسی میزان شباهت­ ژنتیکی 50 ژنوتیپ توتون از دو دسته بارلی و ویرجینیا پرداخته شد. به منظور تعیین ژنوتیپ از 21 ترکیب آغازگری نشانگر AFLP استفاده شد. از تعداد کل 480 نوار ایجاد شده، با تعداد متوسط 76/17 نوار در هر ترکیب، 373 نوار چندشکل بودند. با توجه به میانگین درصد چندشکلی بالا (45/77 درصد) می­توان انتظار داشت بتوان برای شناسایی تنوع ژنتیکی موجود در ارقام از این نشانگر به عنوان ابزاری قدرتمند در برنامه­های اصلاحی توتون استفاده نمود. بررسی ضرایب ژنتیکی جاکارد نشان داد ژنوتیپ­های Badisher Burley E، Pennbel69، R9 و Coker 176 واجد بالاترین فاصله ژنتیکی از بقیه ژنوتیپ­ها هستند. لذا، به نظر می­رسد بتوانند در برنامه­های اصلاحی از جمله هیبریداسیون و تشکیل جمعیت­های در حال تفرق برای مکان­یابی QTL ارزشمند باشند. نتایج تجزیه واریانس مولکولی نیز 4 درصد از کل تنوع ژنتیکی موجود در بین ژنوتیپ­ها را تنوع بین دو دسته بارلی و ویرجینیای گرمخانه­ای برآورد نمود و 96 درصد از تنوع موجود را در درون دسته­ها نشان داد. همچنین بررسی آماره­های تنوع ژنتیکی نشان داد ترکیبات آغازگری E060-M160، E070-M140، E070-M150 و E070-M160، E080-M160، E080-M150، E100-M140 و E100-M150 درکل به عنوان قدرتمندترین نشانگرها از بین کل ترکیبات آغازگری در ارزیابی و تشخیص روابط بین ژنوتیپ­های توتون مورد مطالعه هستند و می­توانند در سایر پژوهش­های توتون مورد توجه قرار گیرند.

کلمات کلیدی: تجزیه واریانس مولکولی، تنوع ژنتیکی، توتون، AFLP.

مقدمه

توتون (Nicotiana tabacum L.) از تیره سولاناسه (Solanaceae) گیاهی است یکساله و علفی که به منظور برداشت برگ­هایش کشت    می­شود. در ایران کشت توتون برای اولین بار در سال 1292 در گیلان انجام گردید. توتون از نظر اقتصادی یکی از مهمترین گیاهان غیرخوراکی در دنیاست به­طوری­که طبق آخرین گزارش فائو عملکرد توتون به طور متوسط در کل دنیا به 17838 هکتوگرم در هکتار رسیده است
(FAO, 2010). توتون نقش بسیار مهمی در اقتصاد کشاورزی کشورهای تولید کننده دارد به­طوری­که درآمد حاصل از فرآورده­های مختلف آن، میزان قابل توجهی از درآمد این کشورها را تشکیـــل می­دهد. بنابرگزارش شرکت جهانی توتون، در سال 2007، تقریباً 4916 میلیون کیلوگرم توتون در سراسر جهان تولید شده است (ULTCI, 2008). گیاه توتون از جنبه­های بسیاری یک گیاه مهم ژنتیکی به حساب می­آید و در چند دهه گذشته به عنوان یکی از مهمترین سیستم­های مدل در بیوتکنولوژی و مهندسی ژنتیک بوده و در بیــان ژن­های انتقال یافته یک گیاه استراتژیک محسوب می­شود. به دلیل اهمیت اقتصادی و ارزش توتون در پژوهش­های بیولوژیکی، مطالعات متعددی جهت آگاهی از منشأ تکاملی، تنوع ژنتیکی و روابط خویشاوندی ژنتیکی آن صورت گرفتــه است (Ren and Timko, 2001). بنابراین، بالابردن کمی و کیـفی این محصول از جایـگاه ویــژه­ای برای به­نژادگران برخوردار است.

در اصلاح نباتات تنوع ژنتیکی از ملزومات اصلاح گیاه است که از تکامل طبیعی نشات گرفته و مهمترین جزء در پایداری نظام­های بیولوژیکی است. به طور حتم اطلاع از محتوی و سطح تنوع ژنتیکی منابع گیاهی هر محصول مهمترین گام در جهت برآورد اهداف اصلاحی می­باشد  .(Abd Mishahni and Shahnejat Bushehri, 1997) بر این اساس امروزه توجه به تنوع ژنتیکی باقیمانده در خزانه های ژنتیکی ژرم پلاسم گونه­های زراعی که در برنامه­های اصلاحی مورد استفاده قرار می­گیرند همچنان رو به افزایش است. به طور کلی می­توان اذعان داشت شناخت خویشاوندی­های ژنتیکی به منظور مدیریت ژرم­پلاسم، حفظ و نگهداری آن، انگشت نگاری­های ژنتیکی،گزینش ژنوتیپ­ها، تهیه نقشه­های ژنتیکی، تعیین مکان و جداسازی ژن­ها و همچنین شناسایی والدین مطلوب جهت تولید واریته­های هیبرید و در نهایت تدوین برنامه­های به­نژادی از اهمیـت به ســزایی برخوردار است (Fufa, et al., 2005). از سوی دیگر افزایش تقاضا و نیازمندی­های مصرف کننده بعلاوه تأکید بر روی تولید سریع ارقام جدید، اصلاح­گران را ناگزیر به استفاده از راهکارهای مولکولی به همراه روش­های اصلاح سنتی، به عنوان مکمل این روش­ها می­نماید (Moon et al. ,2009). در طول دو دهه اخیر پیشرفت­های چشم­گیر در زمینه اصلاح­نباتات مولکولی مخصوصاًً فناوری نشانگرهای DNA، ابـزارهای جدیدی را برای بالا بردن کــارایی روش­های اصلاحی فراهم نموده­اند. ارزیابی تنوع ژنتیکی در ارقام توتون نیز به­ویژه با استفاده از نشانگرهای مولکولی همانند سایر گیاهان در بهبود و اصلاح طولانی مدت این گیاه بسیار حائز اهمیت می­باشد. تنوع ژنتیکی را می­توان با فناوری نشانگرهای DNA، که بررسی مستقیم ژنوم بدون متأثر شدن از محیط را امکان پذیر می­سازد بررسی کرد .(Doveri et al., 2008) از مرسوم­ترین نشانگرهای DNA می­توان RFLP، RAPD، AFLP، ریزماهواره­ها و ISSR را نام برد et al., 2008)  .(Muthusamy

نشانگر AFLP (Amplified fragment length polymorphism) یا چندشکلی طولی قطعات تکثیری از جمله مهمترین نشانگرهای DNA است که با استفاده از این روش به طور همزمان حدود 50-10 ناحیه ژنومی با اندازه تقریبی 500-80 جفت باز تکثیر می­شود و دارای تکرار پذیری بالایی است (Guo et al., 2005). این نشانگر یکی از انواع نشانگرهای مبتنی بر PCR است که ترکیبی از RFLP  و RAPD بوده و شامل هضم DNA ژنومی با آنزیم های برشی خاص و اتصال سازگارسازهای چند نوکلئوتیدی کوتاه به انتهای قطعات برش یافته و سپس تکثیر قطعات ایجاد شده با کمک PCR می­باشد. این روش تفاوت در مکان های برشی را آشکار می­کند و حساسیت بسیار زیادی در آشکار سازی چند شکلی در سراسر ژنوم دارد و بدلیل قابلیت تکرار پذیری بالا بر RAPD برتری دارد. همچنین بدلیل عدم نیاز به اطلاعات اولیه در مورد ژنوم مورد مطالعه و نیز سرعت و درجه اطمینان بالا، امروزه بطور وسیعی برای تهیه نشانگرهای چند شکل استفاده می شود (Farsi and Zolala,  2003). در مطالعه­ای که با استفاده از نشانگرهایRAPD  وAFLP برای بررسی تنوع ژنتیکی بین 28 رقم توتون گرمخانه­ای در مرکز پرورش و اصلاح نژاد توتون درجنوب چین صورت گرفت، تعداد 78 نوار RAPD و 154 نوار AFLP از ارزیابی به دست آمد. تجـزیه خوشه­ای به روش UPGMA ارقام را به سه خوشه اصلی گروه­بندی کرد که ارقام هر خوشه از لحاظ شجره­ مشابه بودند (Zhang et al., 2008).

در پژوهش دیگری تنوع ژنتیکی 19 رقم توتون در تایلند با استفاده از نشانگر AFLP، مورد بررسی قرار گرفت. در مطالعه مذکور سه ترکیب آغازگری از بین 32 ترکیب برای بررسی درجمعیت مذکور انتخاب شدند که از بین 139 نوار  قابل امتیاز دهی، 103 نوار (1/74%) چند شکل بودند. در مطالعه آنها مطابقت قابل توجهی بین منشاء ارقام و گروه­بندی حاصل از ارزیابی ژنتیکی AFLP وجود داشت به طوری­که ارقام بومی شباهت ژنتیکی بالایی نشان دادند (Denduangboripant et al., 2010). همچنین تنوع ژنتیکی 28 رقم توتون با استفاده از نشانگر AFLP، در مرکز پرورش و اصلاح نژاد توتون، در استان یوننان در جنوب غربی چین مورد مطالعه قرار گرفت. در این پژوهش با استفاده از 10 ترکیب آغازگری، 154 نوار چند شکل از 561 نوار شناسایی شد و متوسط تعداد نوار چند شکل برای هر جفت آغازگر، 4/15برآورد شد. در این بررسی گروه­بندی ارقام و شناسایی ارقام از لحاظ خویشاوندی به عنوان یکی ابزارهای مؤثر برای حفاظت از ژرم پلاسم عنوان شد
(Liu et al., 2009). با توجه به اهمیت توتون به عنوان یک محصول اقتصادی مهم و نقش نشانگرهای مولکولی به­ویژه AFLP در بررسی تنوع ژنتیکی، پژوهش حاضر با هدف تعیین میزان شباهت و تنوع موجود بین ژنوتیپ­های توتون طراحی گردید تا بدین­وسیله قدرتمندترین ترکیبات آغازگری در تعیین میزان تمایز بین ژنوتیپ­ها مشخص گردند.

مواد و روشها

مواد گیاهی

اسامی و منشاء 50 ژنوتیپ توتون که در این پژوهش مورد مطالعه قرار گرفتند در جدول 1 آورده شده است. تعداد 17 ژنوتیپ از دسته بارلی و تعداد 33 ژنوتیپ از دسته ویرجینیای گرمخانه­ای انتخاب شد. بذور ژنوتیپ­های مذکور از مرکز تحقیقات توتون رشت تهیه شد و سپس در آزمایشگاه ژنتیک دانشگاه گنبد کاووس به صورت خزانه شناور کشت گردید. خزانه شناور از دو بخش اصلی بستر آبی[1] و بستر شناور[2] تشکیل یافته است. بستر آبی شامل محـلول غذایی حاوی قـارچ­کش بوده که در داخل حوضچه­ای به ارتفاع حدود 20 سانتی­متر و ابعاد دلخواه قرار داشت. بستر شناور شامل سینی­های استیروفومی حفره دار حاوی بستر کشت و بذر بود. در این پژوهش از نسبت 70% پرلیت و 30% کود دامی پوسیده شده به عنوان بستر کشت استفاده شد  .(Hartley et al., 2001) پس از رشد کافی گیاهچه­ها (درمرحله 4 تا 5 برگی)، نمونه­های برگی تهیه شد و بدنبال آن استخراج DNA به روش CTAB   (Saghai Maroof et al., 1994)تغییر یافته (Sabouri et al., 2009) انجام شد. سپس DNA استخراج شده بر روی ژل آگارز 8/0 درصد به همراه فاژ لامبدا جهت تعیین کمیت و کیفیت برده شد.

تجزیه AFLP

روشAFLP مطابق روش وس و همکاران (Vos et al. , 1995) انجام شد. پانصد نانوگرم از DNA ژنومی با پنج واحد از آنزیم های محدودگر EcoRI و MseI به مدت سه ساعت در دمای 37 درجه سانتیگراد  مورد هضم قرار گرفتند. در ادامه سازگارسازهای EcoRI و MseI به مدت دوساعت در دمای 37 درجه سانتیگراد و یک ساعت در دمای 20 درجه سانتیگراد به انتهای DNA برش یافته متصل شدند. سپس در مرحله بعد نمونه­های حاصل از مرحله قبل به نسبت 5:1 رقیق شدند و با آغازگرهای EcoRI و MseI واجد یک نوکلئوتید انتخابی در انتهای'3 با توالی­های زیر مورد تکثیر پیش انتخابی قرار گرفتند.

آغازگر  Mse1:

5’-GATGAGTCCTGAGTAAA-3’

آغازگر EcoR1:

5’-GACTGCGTACCAATTCA- 3’

چرخه­های حرارتی در این مرحله به تعداد 30 بار و با برنامه 94 درجه سانتیگراد به مدت 30 ثانیه، 60 درجه سانتیگراد به مدت 30 ثانیه، 72 درجه سانتیگراد به مدت 60 ثانیه بود. سپس محصولات حاصل از تکثیر پیش انتخابی به نسبت 5:1 رقیق شده و با 21 ترکیب آغازگری دارای 2 نوکلئوتید انتخابی علاوه بر یک نوکلئوتید اضافه شده در مرحله پیش تکثیر در انتهای '3، تحت چرخه حرارتی Touch down شامل سه مرحله دمایی مختلف تکثیر شدند. فراورده­های واکنش زنجیره­ای پلیمراز با استفاده از الکتروفورز ژل پلی­اکریل­آمید واسرشته­ساز شش درصد تفکیک و با روش نیترات نقره رنگ آمیزی شدند. امتیازدهی نوارها  به صورت صفر و یک به ترتیب برای عدم حضور و حضور نوار باندی انجام گرفت.

تجزیه­های آماری

پس از تشکیل ماتریس صفر و یک و انتقال آن به نرم­افزار­ GGT، تشکیل ماتریس فاصله ژنتیکی جاکارد، تجزیه خوشه­ای امکان­پذیر شد. با در نظر گرفتن دو دسته توتون بارلی و ویرجینیای گرمـخانه­ای به عنوان دو جمعیت، تجزیه واریانس مولکولی با استفاده از برنامه GenAlEx 6.41  انجام شد و سرانجام برای برآورد آماره­های تنوع ژنتیکی نیز از نرم­افزار 32 PopGene و Excel استفاده شد. محتوای اطلاعات چندشکلی (PIC) نیز مطابق رابطه PICi= 2 fi(1-fi) برآورد شد. در این رابطه PICi، PIC نشانگر i ام، fi   فراوانی قطعه نشانگر iام هنگام وجود و (1-fi) فراوانی قطعه نشانگر i ام در حالت عدم وجود نوار است این رابطه برای نشانگرهای غالب مثل  AFLP پیشنهاد شده است (Roldain-Ruiz, 2000). سایر آماره­ها شامل درصد چندشکلی، ضریب تنوع ژنتیکی نی، تعداد الل مؤثر و آماره تنوع ژنتیکی برای تمایز جمعیت­ها (G_ST) با استفاده از نرم­افزار 32 PopGene محاسبه شد. در این نرم­افزار آماره [3]G_ST بر اساس رابطه زیر محاسبه گردید.

G_ST=

در این رابطه، H_T، H_S و D_ST بترتیب تنوع ژنتیکی کل، میانگین وزنی تنوع ژنتیکی درون جمعیت و تنوع ژنتیکی بین جمعیت­ها
می­باشد(Nei, 1973) .

جدول 1- اسامی ژنوتیپ­ها همراه با منشاء آنها بر طبق Sisson (2002). هفده ژنوتیپ اول از دسته بارلی و بقیه از دسته ویرجینیای گرمخانه­ای می­باشند.

Table 1- The genotypes names and their origin according to Sisson (2002). The first 17 genotypes belonged to Barley  group and rest to Virginia flue-cured group.

جدول 2- ترکیبات آغازگری استفاده شده در تجزیه AFLP.

Table 2- Primer combinations used for AFLP analysis

نتایج و بحث

بررسی آماره­های تنوع ژنتیکی

ترکیبات آغازگری بکار رفته در جمعیت با 50 ژنوتیپ توتون در کل با 21 ترکیب آغازگری بکاررفته 480 نوار ایجاد نمود که تعداد 373 نوار چندشکل بودند. دامنه اندازه نوارها بین 100 تا bp700 بود. تعداد نوارهای چندشکل در ترکیبات آغازگری از 10 نوار در E120-M140 و E070-M140 تا 27 نوار چند شکل در E080-M150 متغیر بودند و متوسط تعداد نوارهای چندشکل 76/17 تخمین زده شد. نرخ چندشکلی در بین ترکیبات در پژوهش حاضر از 63/52 تا 59/92 درصد متغیر بود و میانگین درصد چندشکلی حدود 45/77 درصد برآورد گردید و می­توان اینگونه نتیجه­گیری نمود که روش AFLP یک ابزار قدرتمند و ارزشمند در برنامه­های اصلاحی توتون می­باشد چون دسترسی به نرخ بالایی از چندشکلی، ارزیابی کارا و سودمندی را در بررسی­های مربوط به تنوع ژنتیکی به دست می­دهد (Zhang et al., 2006).  

در سایر مطالعات مربوط به توتون با استفاده از نشانگر AFLP برآوردهای مختلفی حاصل گردید. در پژوهشی که بر روی 46 رقم با استفاده از نشانگر AFLP صورت گرفت 92 نوار چندشکل به ازای هر ترکیب آغازگری شناسایی شد (Ren & Timko, 2001) و مطالعه­ای دیگر بر روی 19 رقم توتون به طور متوسط 34 نوار چندشکل به ازای هر ترکیب آغازگری مشاهده شد (Denduangboripant et al., 2010). همچنین درصد پایین­تری از چندشکلی در پژوهشی دیگر گزارش شد که به طور میانگین 4/15 نوار و 45/27 درصد چندشکلی و در بررسی بر روی 28 ژنوتیپ توتون بود (Zhang et al., 2008).   

برآورد ضریب تنوع ژنتیکی نی، شاخص محتوای اطلاعات چند شکلی، تعداد الل مؤثر برای هر ترکیب آغازگری در جمعیت اول، دوم و کل جمعیت به تفکیک، در جدول 3 ارائه شده است. همچنین بالاترین مقادیر ضریب تنوع ژنتیکی نئی و تعداد الل مؤثر در کل جمعیت به ترکیبات آغازگری E060-M160، E070-M140، E070-M150، E070-M160، E080-M160 و E100-M140 و در دسته ویرجینیای گرمخانه­ای به ترکیبات E070-M140، E070-M150، E070-M160، E080-M150، E080-M160 و E100-M150 اختصاص داشتند. در دسته بارلی نیز ترکیبات  E060-M160 و E070-M160، E090-M140 و E100-M140 بالاترین مقادیر ضریب تنوع ژنتیکی نی و تعداد الل مؤثر را به خود اختصاص دادند.  از لحاظ درصد چندشکلی نیز بالاترین مقدار 59/92 درصد بود که به ترکیب آغازگری E070-M150 اختصاص داشت.

تجزیه خوشه­ای

تجزیه خوشه­ای بر اساس روش UPGMA و فاصله ژنتیکی جاکارد انجام شد و درخت حاصل در شکل 1 نشان داده شده است. در این شکل فاصله ژنوتیپ­ها نیز درج شده­اند. همچنین زیر نام ژنوتیپ­های دسته بارلی خط کشیده است. نتایج این تجزیه گویای این واقعیت است که با استفاده از اطلاعات حاصل از ترکیب­های آغازگری AFLP بکار رفته در این تحقیق، اگرچه بسیاری از ژنوتیپ­های بارلی­ یا ویرجینیای گرمخانه­ای در گروه­های کوچک نزدیک بهم قرار گرفتند اما ژنوتیپ­های دسته بارلی به طور کامل و شفاف از ژنوتیپ­های دسته ویرجینیای گرمخانه­ای تفکیک نشدند. البته از آنجایی­که ژنوتیپ­های دسته بارلی و دسته ژنوتیپ­های ویرجینیای گرمخانه­ای هر دو از توتون­های تیپ غربی می­باشد و از لحاظ پاره­ای از خصوصیات مشابه هم می­باشند، چنین نتیجه­ای دور از انتظار نیست. البته باید خاطر نشان نمود در برخی از مطالعات مربوط به بررسی میزان کارایی نشانگرها و گروهبندی و تفکیک دسته­های مختلف توتون، نشانگرهایی مانند AFLP و RAPD قادر بودند تا حدی این تفکیک را عملی سازد (Denduangboripant et al., 2010; Siva Raju et al., 2008; Sarala & Rao, 2008). به نظر می­رسد اندازه نمونه و نوع نمونه­های مورد بررسی به طوری­که نمونه­ها بتوانند نماینده خالص (بدون اختـلاط) و واقـعی از هر دستـه یا گـروه باشند می­تواند نقش مهمی در تفکیک دسته­ها داشته باشد. بهرحال بررسی­های بیشتری با تعداد بیشتری ژنوتیپ نیاز است تا بتوان به یک نتیجه­گیری نهایی رسید.

 جدول 3– آماره­های تنوع ژنتیکی برای 21 ترکیب آغازگری بررسی شده بر روی دو جمعیت توتون بارلی و ویرجینیای گرمخانه­ای.

Table 3- Diversity statistic for evaluated 21 AFLP primer combinations on two population of Barley and Virginia flue cured.

با توجه به تجزیه خوشه­ای انجام شده، از دسته بارلی ژنوتیپ­های Barley b.5 و103  Barley Ree در فاصله ادغام 01/0، Burlina، Barley BB163 و Barley Barsoma در فاصله ادغام 03/0، Barley semparent، Barley7 و Banket A1 در فاصله 02/0 ادغام شده و به یک خوشه تعلق یافتند. در حقیقت ژنوتیپ­­های هر کدام از این گروه­های کوچک بیشترین شباهت را به یکدیگر داشتند. از دسته ویرجینیای گرمخانه­ای نیز ژنوتیپ­های Virginia American، TRUMPF و RXT در فاصله ادغام 01/0، Perega، Hicks Broad Leaf، K.E1 و Pfatzer در فاصله ادغام 03/0،  GA.955، Virginia RP-37، MC.I، Virginia Bright 88، Parfum-ditalie  و Montealm Brum در فاصله ادغام 02/0، Virginia Ree 488 و NOD 8 در فاصله ادغام 05/0 ، R9، NR 23، Rosecan Nela، Hicks 55 و Virginia RP37  در فاصله ادغام 04/0، Golden gift، Pennbel 69 و Coker 176 در فاصله ادغام 04/0 و  TL 33، Holandisher و Pereg R.2-288 در گروهک­هایی قرار گرفتند که از لحاظ ژنتیکی شباهت قابل توجهی به هم داشتند. بر اساس این تجزیه ژنوتیپ­های Badisher Burley E، Pennbel69، R9 و Coker 176 ژنوتیپ­های بودند که بالاترین فاصله ژنتیکی را از بقیه ژنوتیپ­ها نشان دادند (شکل 1). از سوی دیگر ماتریس فاصله ژنتیکی جاکارد نیز نتایج مفیدی را در بر داشت. این ماتریس نشان داد بالاترین مقادیر فاصله ژنتیکی بین جفت ژنوتیپ­ها به فاصله ژنتیکی بین ژنوتیپ­های مذکور با سایر ژنوتیپ­ها اختصاص دارد. شناسایی ژنوتیپ­هایی که از لحاظ ژنتیکی و فنوتیپی بیشترین فاصله را از هم داشته باشند در برنامه­های اصلاحی از جمله هیبریداسیون و مکان­یابی QTLهای کنترل کننده صفات کمی نقش اساسی دارد. با استفاده از این ژنوتیپ­هایی می­توان جمعیت­های مکان­یابی با تفرق بالا در افراد را توسعه داد که امکان مکان­یابی QTLهای کوچک اثر نیز امکان­پذیر گردد (Collard et al., 2005).

تجزیه واریانس مولکولی و بررسی تنوع ژنتیکی بین و درون دو جمعیت

با در نظر گرفتن دو جمعیت بترتیب شامل دسته توتون­های بارلی با 17 ژنوتیپ و دسته توتون­های ویرجینیای گرمخانه­ای با 33 ژنوتیپ، تجزیه واریانس مولکولی انجام گرفت. درصد تنوع ژنتیکی موجود در بین دو جمعیت تنها 4 درصد از کل تنوع ژنتیکی را به خود اختصاص داد و 96 درصد مربوط به تنوع درون جمعیتی بود (جدول 4). وجود تنوع ژنتیکی زیاد در درون جمعیت نشان­دهنده وجود تفاوت­های ژنتیکی زیاد افراد درون جمعیت از لحاظ مکان­های ژنی تکثیر یافته است و این گــویای ناهمـگنی درون جمعیـت می­باشد. به طور کلی ناهمگنی زیاد در درون جمعیت می­تواند دلایل زیادی ازجمله ماهیت چند پلوئیدی، دگرگشنی، تلاقی­های مختلف بین ارقام، اختلاط فیزیکی بذور و غیره داشته باشد. در اینجا می­توان دلیل بالا بودن تنوع در درون جمعیت بارلی و ویرجینیای گرمخانه­ی را احتمالاً به انجام تلاقی­ بین ارقام از گروه­های مختلف، اختلاط بذور هنگام تکثیر، یا اندازه کوچک جمعیت­های مورد مطالعه و یا بزرگ بودن ژنوم توتون و کافی نبودن ترکیبات آغازگری برای پوشش کامل ژنوم و در نتیجه عدم ارزیابی کامل ژنوتیپ­ها از لحاظ تنوع ژنتیکی در کل ژنوم نسبت داد. میزان شباهت ژنتیکی جاکارد در بین ژنوتیپ­ها از 16/0 تا 64/0 متغیر بود که نشاندهنده شباهت پایین ژنوتیپ­ها در داخل هر کدام از گروه­ها بود (ماتریس اعداد نشان داده نشده است).

همچنین شاخص G_ST نیز به عنوان شاخص تمایز جمعیت­ها در مجموع مکان­های ژنی مورد ارزیابی، محاسبه شد (جدول 3). این شاخص نشان می­دهد که دو جمعیت­ از لحاظ مکان­های تکثیر شده توسط ترکیب­های آغازگری AFLP مورد بررسی، پایین است. از بین 21 ترکیب آغازگری بکاررفته بالاترین تمایز در ترکیب E070-M140 مشاهده شد که برابر با 06/0 بود. در واقع از کل تنوع ژنتیکی موجود از لحاظ این ترکیب آغازگری، 6 درصد مربوط به تنوع بین دو جمعیت و 94 درصد مربوط به تنوع درون جمعیت می­شود. از لحاظ سایر ترکیبات آغازگری، تنوع ژنتیکی برآورد شده بین دو جمعیت کمتر بودند. لذا این ترکیب آغازگری نسبت به سایر ترکیبات تنوع بین دو جمعیت را بهتر نشان داد. مقدار متوسط Gst برابر با 032/0 برآورد گردید که نشاندهنده مقدار تنوع ژنتیکی بسیار بالایی است که در درون ژنوتیپ­های هر دسته­ وجود دارد. در پژوهشی وسیع در دانشگاه کارولینای شمالی، 702 ژنوتیپ توتون با منشاء کشورهای مختلف دنیا با استفاده از 72 نشانگر ریزماهواره مورد بررسی قرار گرفتند. در کل 1031 الل با میانگین 7/14 الل برای هر نشانگر شناسایی شد. بسیاری از ژنوتیپ­هایی که منشاء جغرافیایی یکسانی داشتند در گروه­های یکسانی قرار گرفتند با این حال تنوع درون جمعیتی در تجزیه واریانس مولکولی 18/92 درصد برآورد گردید که به نوبه خود مقدار تنوع قابل توجهی است (Moon et al., 2009). در پژوهش دیگری 51 ژنوتیپ توتون از دسته ویرجینیای گرمخانه­ای با استفاده از AFLP به دو گروه اصلی با منشاء آمریکایی و چینی تفکیک شدند. و تجزیه واریانس مولکولی داده­های آنها ضمن برآورد شاخص تثبیت[4] برابر با 167/0، نشان داد 76/55 درصد از کل واریانس ژنتیکی موجود به تنوع بین دو منشاء و 24/44 درصد به تنوع درون ژنوتیپ­های هر منطقه جغرافیایی بر می­گردد (Zhang et al., 2006).