Agrobacterium rhizogense - mediated transformation of Atropa belladonna

ترانسفورماسیون گیاه شابیزک Atropa belladonna توسط Agrobacterium rhizogense

بتول زارعی¹، دانیال کهریزی*^{2 و 3}، سید علی رضا موسوی⁴، علی اصغر نصراله نژاد قمی⁵

1- دانش آموخته کارشناسی ارشد اصلاح نباتات دانشگاه رازی.

2- دانشیار اصلاح نباتات دانشگاه رازی.

3- گروه پژوهشی بیوتکنولوژی مقاومت به خشکی، دانشگاه رازی.

4- مربی دانشگاه ایلام.

5- استادیار دانشگاه علوم کشاورزی و منابع طبیعی گرگان.

تاریخ دریافت: 24/3/1391، تاریخ پذیرش: 6/6/1391

چکیده

شابیزک (Atropa belladonna) یکی از مهمترین گیاهان دارویی خانواده سولاناسه می باشد. این گیاه حاوی منابع آلکالوئیدهای تروپانی است. این آلکالوئیدها بیشتر درریشه ها بیوسنتز می شوند. تحقیق حاضر به منظور افزایش ریشه های مویی شابیزک به روش انتقال ژن انجام شد. برای این منظور از سویه آگروباکتریوم رایزوژنز (₁₅₈₄₃ AR) استفاه شد. ابتدا ریزنمونه های ساقه  با سوسپانسیون آگروباکتریوم دارای ژن rolB تلقیح شدند. سپس جهت باززایی مستقیم از پنج ترکیب (MS، KIN mg/l 3MS +  ،B5،  KIN mg/l 12 MS+ و mg/l KIN5 B5 +) در قالب طرح کاملاٌ تصادفی در سه تکرار استفاده شد. نتایج تجزیه آماری نشان داد که سطح هورمونی KIN mg/l 12+ MS بیشترین باززایی مستقیم از نوساقه را دارا می­باشد. برای آنالیز گیاهان تراریخت از دو روش فنوتیپی (مشاهده ریشه مویی از گیاهچه تراریخت) و تکثیر بخشی از ژن rolB (به روش PCR) استفاده شد.

کلمات کلیدی:  شابیزک، آگروباکتریوم ریزوژنز، تراریختی، آلکالوئید های  تروپانی.

مقدمه

گیاهان دارویی مهمترین منبع دارویی برای اکثر جوامع بشری می باشند. طبق برآورد سازمان بهداشت جهانی بیش از 80% جوامع انسانی در کشورهای در حال توسعه برای مراقبت های بهداشتی اولیه به طور سنتی به گیاهان دارویی و تولیدات طبیعی تمایل دارند (Vines, 2004; Canter et al, 2005) ابزار بیوتکنولوژی برای انتخاب، تکثیر و حفظ ژنوتیپ های حیاتی از گیاهان دارویی مهم هستند. باززایی در شرایط درون شیشه ای دارای پتانسیل شگرفی برای تولید گیاهان دارویی با کیفیت بالا است (Tripathi and Jaindra, 2003). گیاهان دارویی حاوی مواد شیمیایی مفید برای مصارف دارویی با چاشنی های غذایی، مواد خوشبو کننده و معطر هستند (Mulabagal and Tsay, 2004). یکی از روش های انتقال ژن، انتقال به واسطه آگروباکتریوم رایزوژنز می باشد که سبب تولید ریشه های موئین می شود (Tzfira and Vitaly, 2006).

شابیزک گیاهی است پایا و به ارتفاع یک تا یک و نیم متر می باشد که دارای ریشه هایی دراز، منشعب، ضخیم، گوشتدار و به رنگ حنائی است ساقه آن استوانه ای، پوشیده از تار و در انتها دارای تقسیمات دوتایی  یا سه تایی است  قسمت مورد استفاده این گیاه برگ، ریشه، میوه و دانه آن است (Rothe and Drager, 2002).

به علت گسترش زیاد ریشه (طول ریشه به 40 تا 60 سانتی متر می رسد)، برای کشت شابیزک باید از زمین هایی با خاک زراعِی عمِیق  استفاده نمود. شابیزک در طول رویش به شراِیط آب هواِیِی مرطوب و آب  فراوان نیاز دارد. این گیاه در مناطق خشک به کندی رشد می کند. از این رو، کاشت شابیزک در شرایط مرطوب در مناطقی که رطوبت هوا زیاد باشد، موفقیت آمیز خواهد بود خاکهای مناسب برای کاشت و تکثیر شابیزک، خاکهای شنی غنی از ترکیبات کلسیم دار و خاکهایی که حاوی مقادیر فراوان مواد و ترکیبات هوموسی  می باشند (Hornok, 1987).

شابیزک بر روی سلسله اعصاب تاثیر کرده و اثرات آرام کننده و ضد تشنج دارد. از شابیزک در درمان بیماریهای مختلف مانند آسم، سیاه سرفه، سرع، دفع غیر عادی ادرار، سرعت انزال، دردهای معدی، یبوست های مقاوم، دردهای آپاندیسیت، دریا گرفتگی (به علت دارا بودن آتروپین)، سر گیجه، قولنج های کبدی و کلیوی، ترشح فراوان عرق، عرق شبانه مسلولین و در بسیاری موارد دیگر استفاده به عمل می آید. هیوسیامین قادر است انقباضاتی را که در اثر بکار بردن گلوکوزیدهای ملین در روده‌ها ایجاد می‌شود بدون کم کردن اثر مسهلی آنها برطرف نماید. اثر اسکوپولامین مشابه هیوسیامین است ولی روی مراکز عصبی موثرتر می‌باشد ((Oksman et al., 1991

شابیزک گیاهی از خانواده ی سولاناسه و یکساله می باشد که یکی از آلکالوئیدهای تروپانی  مهم به نام هیوسیامین را دارا می باشد. مواد موثر دارویی این گیاه در ریشه ها تولید می شود(Rothe and Drager, 2002). باکتری آگروباکتریوم رایزوژنز عامل بیماری ریشه های مویی در گیاهان دو لپه و تعداد محدودی از گیاهان تک لپه می شود. پلاسمید بزرگ موجود در آن به نامRi، با اتصال این باکتری ها به نواحی زخمی گیاهان میزبان، قسمت بیماریزای خود که T-DNA نام دارد(Sosa Alderete et al., 2009) و در بر گیرنده ی ژنهای rol A,B,C است را به ژنوم یاخته های میزبان منتقل می نمایند و باعث افزایش مواد موثر دارویی می شود و این ریشه ها به صورت ژنتیکی تغییر کرده و قابلیت بروز صفت ریشه ای را به نسل بعد دارا هستند (Tzfira and Vitaly, 2006). این مواد موثر (هیوستامین و آتروپین و...) بر روی سیستم عصبی پاراسمپاتیک، قلب، چشم و غیره...تاثیر می گذارند (Rothe and Drager, 2002). سال 1987 اولین تحقیقات مهندسی متابولیک گیاهان دارویی را بر روی آلکالوئیدهای تروپانی انجام داده اند. آنها یک ژن هیوسامین 6 بتا هیدروکسیلاز را از Hyoacyamus  به Atropa belodonna منتقل نمودند. گیاهان تراریخت، سطح بالاتری از تبدیل هیوسامین به اسکویولامین که یک ترکیب دارویی مهمتر است را نشان دادند
Jung and Tepfer, 1987)). هدف از این تحقیق معرفی سیستم کشت ریشه های موئین در جهت مهندسی متابولیت های ثانویه گیاهی و انتقال ژن rol B به گیاه شابیزک و اثبات حضور ژن در سطح فنوتیپی و در سطح DNA (با استفاده از PCR) بود.

مواد و روش ها

مواد گیاهی

در این مطالعه بذور شابیزک (آتروپا) از باغ گیاه شناسی سازمان جنگلها و مراتع کشور تهیه گردید. بذور نسبتاٌ ریز شابیزک به مدت 12 دقیقه در محلول هیپوکلرید سدیم ( 5/1%)  ضد عفونی شدند. سپس به محیط MS )با غلظت قند 20 گرم در لیتر و 8% آگار که pH محیط روی 8/5 تنظیم و به مدت 20 دقیقه در 120 درجه سانتی گراد اتوکلاو گردید( منتقل شدند. پس از 35 روز گیاهچه های استریل تولید شدند.

تهیه باکتری و تلقیح

در این تحقیق از سویه آگروباکتریوم
) ₁₅₈₃₄ AR (تهیه شده از دانشگاه تربیت مدرس، استفاده شد. در داخل هر فالکون استریل، 5 میلی لیتر محیط کشت مایع LB ریخته شد و به هر یک  μl 10 استوک باکتری و μl300 ریفامیسین اضافه گردید. فالکون های محیط کشت حاوی باکتری در شرایط تاریکی، در دمای C° 27 و در داخل شیکر چرخشی با سرعت rpm 120 نگهداری شدند. پس از 48 ساعت با استفاده از دستگاه اسپکتروفتومتر غلظت باکتری ها در محیط کشت مشخص گردید که برابر μg/ml  2- 8/1 بود. برای انجام تلقیح از سرنگ آزمایشگاهی μl120 استریل استفاده شد. محفظه سرنگ از کشت مایع (48 ساعته باکتری) پر شد و سپس با استفاده از سوزن بسیار نازک سرنگ، زخم بسیار ریزی در ریز نمونه های ساقه ایجاد شد و قطره بسیار کوچکی از کشت باکتری در ناحیه زخم تلقیح گردید. ریز نمونه های تلقیح شده روی کاغذ صافی گذاشته شد تا باکتری های اضافی بر روی کاغذ صافی باقی بمانند، آنگاه ریزنمونه ها به محیط کشت  MS و B5 منتقل گردیدند. پس از درزگیری ظروف کشت با پارافیلم، کشت ها در دمای  C° 25 و فتوپریود 8:16 (نور: تاریکی) نگهداری شدند. پس از  48 ساعت تلقیح ریزنمونه ی ساقه با باکتری، سپس ریز نمونه ها به محیط کشت مورد نظر  حاوی  mg/L300 آنتی بیوتیک سفوتاکسیم و mg/L 100 کانامایسین، منتقل شدند. ریز نمونه ها هر 10 روز یک مرتبه به محیط کشت مشابه واکشت می شدند. برای باززایی به محیط های مختلف باززایی منتقل گردیدند. که برای این قسمت از تحقیق، از طرح کاملاً تصادفی با سه تکرار و پنج تیمار (MS، KIN mg/l 3MS +  ،B5،  KIN mg/l 12 MS+  و mg/l KIN5 B5 +) استفاده شد. برای مقایسه میانگین از روش دانکن استفاده شد. برای نرمال کردن مشاهدات از تبدیل داده Arc sin√x استفاده گردید. برای تجزیه واریانس و مقایسه میانگین داده ها از نرم افزار SAS استفاده شد.

تایید تراریختی گیاهان باززایی شده به روش PCR

در این بخش از PCR با DNA ژنومی استخراج شده (به روش  CTAB) از برگهای گیاه تراریخت برای تکثیر بخشی از ژن rol B به طور اختصاصی استفاده شد. با انجام واکنش PCR   با استفاده از آغازگرهایی اختصاصی (GAAGGTGCAAGCTACCTCTC و GCTCTTGCAGTGCTACATTT) انتظار می­رود که قطعه ی pb 430 تکثیر شود.

نتایج و بحث

نتایج تجزیه واریانس (جدول 1) نشان داد که بین سطوح مختلف Kin برای ساقه دهی ریزنمونه های تراریخت گیاه شابیزک اختلاف بسیار معنی داری وجود دارد.

همانطور که در جدول 2 (نتایج مقایسه میانگین به روش دانکن)  نشان داده شده است محیط  kin mg/l  12 MS+ بیشترین نوساقه دهی را داشته است. ولی در غلظتهای بالاتر ریزنمونه ها تولید ساقه نکردند. برای باززایی سه فاکتور کلیدی نقش دارد 1- نوع ریز نمونه 2- غلظت هورمونی 3- شرایط کشت (Wei et al., 2006). Feyzi  (2006) به منظور باززایی مستقیم گیاه ذرت از ریز نمونه مریستم ساقه، از سطوح مختلف هورمون kin ( 0، 5/.، 1) استفاده کردند و گزارش دادند که ریز نمونه مریستم ساقه در سطح هورمونی mg/l kin1  بیشترین باززایی را داشته است. در پژوهشیWei et al.  (2006) به منظور باززایی مستقیم گیاه Plumbago zeylanica از ریزنمونه هیپوکوتیل که با سویه ی ₄₄₀₂ LBA  تلقیح شده، از غلظتهای مختلف BA و  NAA استفاده کردند و گزارش شد در محیط mg/l BA 2  و  mg/l NAA 75/0 بیشترین باززایی را داشته است. در پژوهشی دیگر  Li et al. (2008) به منظور باززایی گیاه Sorghastrum nutans  از ریزنمونه کالوس، در غلظتهای مختلف کینتین (5، 2، 1، 5/0، 0) استفاده کردند و گزارش دادند که در غلظت هورمونی mg/ l kin   5 بیشترین باززایی را داشته است. Peddaboina et al.  (2006) به منظور باززایی گیاه Capsicum ssp از ریزنمونه مریستم ساقه، از سیتوکنین های مختلف (Zeatin , Kin, BA) استفاده کردند تنظیم کننده رشد Kin  را در غلظتهای mg/l  6/4، 2/9، 9/13، 2/23 و 4/46 به کار بردند و گزارش دادند که در غلظت 4/46 بیشترین باززایی را داشته است. البته در مجموع برای باززایی  Zeatin نسبت بهKin  بهتر جواب داده است. در پژوهشی Li et al. (2003) برای باززایی مستقیم گیاه ssp Squash از ریز نمونه کوتیلدون استفاده کردند و گزارش دادند که در غلظت هورمونی mg/l BA 1 بهترین باززایی را داشته است. در پژوهشی Thakur et al. (2005) برای باززایی مستقیم گیاه  Himalayan polar از ریزنمونه دمبرگ (که با آگروباکتریوم تومه فشنس تلقیح داده شده بود)، استفاده کردند. آنها گزارش دادند که سطح هورمونی  mg/ l kin   5/1 و IAA 1/0 بهترین باززایی را داشته است. بنابراین با توجه به نتایج حاصل از این آزمایش برآورد می شود هورمون Kin مناسب ترین سیتوکنین برای القاء شاخساره می باشد. در بررسی منابع هیچ گزارشی مبنی بر استفاده از ریزنمونه ساقه شابیزک جهت تولید شاخساره به طور مستقیم مشاهده نشده است.

تایید تراریختی گیاهان باززا شده براساس فنوتیپ

پس از تولید گیاه تراریخت می توان مشاهده کرد که ریشه های مویی گیاه تراریخت نسبت به غیر تراریخت بیشتر است. شکل (1) نشان دهنده این است که ژن به گیاه انتقال یافته و در جای مناسب خود قرار گرفته است.

تأیید تراریختی گیاهان باززا شده بر اساس PCR

به منظور تأیید ماهیت تراریختی گیاهان باززایی شده و اثبات ژن منتقل شده از آگروباکتریوم به ژنوم گیاه، آنالیز PCR انجام گرفت. آزمایشات برای تأیید حضور ژن rolB  به طول bp 430 انجام گرفت و حضور این ژن را در ژنوم سلولهای گیاهان باززایی شده را تأیید کرد (شکل 2).

جدول 1-  تجزیه واریانس سطوح مختلف Kin بر ساقه دهی ریزنمونه های تراریخت گیاه شابیزک.

Table 1- Analysis of variance for effect of different Kin levels on shoot induction in transgenic Atropa belladonna explants  

** : اختلاف در سطح احتمال یک درصد ** Significant differences (p<0.01)

جدول 2- مقایسه میانگین سطوح مختلف Kin بر ساقه دهی ریزنمونه های تراریخت گیاه شابیزک

Table 2- Mean comparison for effect of different Kin levels on shoot induction in transgenic Atropa belladonna explants

میانگین هایی که حداقل یک حرف مشترک دارند در سطح احتمال 5 درصد با یکدیگر اختلاف معنی دار ندارند.

Similar letters show that there is no significant difference (p<0.05)

شکل 2-  نتایج حاصل از الکتروفورز محصولات PCR برای ژن rolB. :A سایز مارکر، B : کنترل مثبت (پلاسمید حاوی ژن rolB)، C: کنترل منفی (ریشه­های گیاه غیر تراریخت)،F ، E ، D: گیاهان تراریخت احتمالی.

Table 2- Electrophoresis of PCR product for rolB gene. A: Size marker, B: positive control (the plasmid that is harboring rolB gene), C: negative control (non-transformant plant root), D, E, F: putative transgenic plants.