Proteome analyses of drought signaling in rice root

Document Type : Research Paper

Authors

Abstract

Rice (Oryza sativa L. cv. IR64) was grown in split-root systems in order to analyze long-distance drought signaling within root systems. This in turn underpins how root systems in heterogeneous soils adapt to drought. The approach was to compare four root tissues: Well watered (WW), water deficit (WD), split-root systems where one half was well watered (spWW) and the other half water deficit (spWD). This was specifically aimed at identifying how drought root tissues altered the proteome of adjacent wet roots by hormone signals and secondly, how wet roots reciprocally affected dry roots hydraulically. Using a 2-DE based proteomics approach, 738 protein spots were reproducibly detected, Thirty-two proteins showed reproducible and statistically significant changes in response to drought. Of them, 13 protein spots up-regulated in WD and spWD treatments. Of them 9 protein spots up-regulated  in WD, spWD and spWW treatments, 8 protein spots not detected in WW and 2 protein spots just detected in WD. Specific functional groups changed consistently in drought. Pathogenesis-related proteins were generally up-regulated in response to drought and heat-shock proteins and thioredoxin were totally absent in roots of fully watered plants.
 

Keywords

Full Text

بررسی پروتئوم پیام رسانی خشکی در ریشه برنج

 

ندا سلطانی1، قاسم حسینی سالکده*2

1دانشجوی کارشناسی ارشد، واحد علوم و تحقیقات، دانشگاه آزاد اسلامی، تهران

2 عضو هیات علمی، پژوهشکده بیوتکنولوژی کشاورزی کرج

 

تاریخ دریافت: 18/4/1391، تاریخ پذیرش: 20/8/1391

 

چکیده

خشکی یکی از بزرگترین عوامل محدودکننده عملکرد گیاهان در سطح جهان می­باشد. بررسی تغییرات الگوی پروتیین­های ریشه برنج در سیستم خشکی نسبی با استفاده از تکنیک پروتئومیکس مورد مطالعه قرارگرفت. تیمارها در سه تکرار مستقل از هم اعمال شد و چهار بافت ریشه­ای مورد مقایسه قرارگرفت: ریشه­هایی که تحت آبیاری کامل قرارداشتند WW))، ریشه هایی که تحت خشکی کامل بوده (WD)، ریشه هایی که در تقسیم ریشه آب کافی دریافت کرده (SpWW) و ریشه هایی که در تقسیم ریشه در معرض خشکی کامل بودند (spWD) بررسی پروتئوم بافت­های ریشه حاصل از تیمارهای ذکر شده توسط الکتروفورز دوبعدی منجر به شناسایی 32 نقطه پروتیین شد که از این تعداد 13 نقطه پروتیینی در هر دو تیمار WD و spWD افزایش بیان داشته، تعداد 9 نقطه پروتیینی در هر سه تیمارWD، spWD و spWW نسبت به گیاهان نرمال WW افزایش نشان داده، تعداد 8 نقطه پروتیینی در گیاهان نرمال بیان نشده و 2 نقطه پروتیینی فقط در تیمار WD افزایش بیان داشت. تنش خشکی باعث تغییراتی در بیان پروتیین­ها گردید که اکثر تغییرات در ریشه­های در معرض تنش خشکی رخ داد، از جمله افزایش بیانPR  پروتیین­ها در پاسخ به خشکی افزایش و عدم بیان  Heat shock پروتیین­ها و تیرودوکسین در ریشه­های در معرض آب.

 

کلمات کلیدی: خشکی، تقسیم ریشه، برنج، پروتئومیکس.

 

 

مقدمه

برنج یکی از قدیمی ترین غلات بوده و بیش از ده هزار سال است که تعداد زیادی از مردم دنیا به عنوان غذا از آن استفاده می کنند همچنین در میان غلات یک گیاه مدل مطلوب برای مطالعات ژنتیکی و مولکولی می­باشد. (Ashraf, 1994). تنش کم آبی عمده­ترین محدودیت­ در تولید محصولات زراعی است (Boyer, 1982). اثر اولیه تنش خشکی بر روی برگ­ها، قطع شدن فشار هیدرولیکی آب است که یکسری اثرهای ثانویه مانند تغییر عملکرد روزنه­ها توسط کاهش تعرق را در پی­خواهد داشت (Hsiao, 1974). این پارامترهای فیزیولوژیک نیاز به تنظیم توسط پیام­های هورمونی دارند ((Blackman, 1985، پیام­رسانی هورمونی به صورت موضعی یا در فواصل زیاد در اندام های گیاه اتفاق می­افتد. پیام­رسانی از ریشه به ساقه نیازمند ترکیبات شیمیایی و یا پیام­های فیزیکی است که با احساس تنش توسط ریشه تولید شده و قادر به انتقال درگیاه باشند Chaves et al., 2004)). که ترکیبات شیمیایی تولید شده در ریشه به جریان آوندی اضافه شده و در سرتاسر گیاه حرکت می­کنند و بعضی مواقع نیز سلول­ها به تغییرات فشار هیدرولیکی و پتانسیل اسمزی ناشی از تنش خشکی بافت آوندی پاسخ داده و پیام به صورت فیزیکی عمل می­کند (Chaves et al., 2004). اهمیت نسبی پیام­های شیمیایی و پیام­های فیزیکی از موارد مورد بحث در تنش خشکی می­باشد، به عنوان مثال تنظیم ساختار روزنه در برگ که نقش کلیدی در مقاومت گیاه به خشکی دارد تحت کنترل هر دو نوع پیام­ مذکور قرار دارد (Comstock et al., 2002).ABA  به عنوان اولین پیام شیمیایی انتقالی به ساقه هنگام تنش خشکی پذیرفته شده است.Blackman et al., 1985) ) در دهه گذشته مشخص شد که ورود ABA به برگ­ها بخشی از پاسخ به خشکی می­باشد (Nilson et al., 2010). بنابراین ABA در ریشه تولید و در سلولهای اپیدرم برگ تجمع می­یابد. رشد ریشه­های ذرت در خاک خشک تغییر می­کند که احتمالا این تغییر برای رسیدن به آب کافی می­باشد (Sharp, 1985) متعاقبا رشد ریشه نشان دهنده حضور ABA می­باشد (Saab, 1990) گیاهان پس از درک تنش خشکی، در سطح مولکولی و سلولی به مانند سطح فیزیولوژیکی به تنش پاسخ می­دهند (Yamaguchi et al., 2002). لذا، ثابت شده است که بیان و تظاهر بسیاری از ژن­ها در پاسخ به تنش خشکی تحت تاثیر قرار می­گیرند و کاهش یا افزایش بیان می­یابند. مشخص شده که  بعضی از این ژن­ها در تحمل به خشکی نقش دارند (Kavar, 2007) . محصول این ژن­ها نه تنها در تحمل به خشکی، بلکه در تنظیم الگوی بیان ژن­ها و مسیرهای انتقال پیام در پاسخ به تنش خشکی نقش ایفا می­کنند (2000  (Shinozaki, همچنین یک گروه بزرگ از فاکتورهای رونویسی در حضور  ABA و تنش کم آبی افزایش بیان پیدا می­کنند (2010 Yoshida, ) در نتیجه پروتیین­هایی که به صورت معمول در بافت­های تحت تنش ایفای نقش می­کنند مانند پروتیین­های LEA افزایش بیان می­یابند. بررسی و تحقیق در مورد اتفاقاتی که در سطح بیان ژن رخ می­دهد، رویکردی جهت تشخیص هیدرولیک یا شیمیایی بودن پیام­هایی که از ریشه­های در حال خشک شدن می­آیند. این استراتژی به بهترین نحو در سیستم کشت تقسیم ریشه  (split-root)از ترکیب سیگنال­های مثبت هیدرولیکی حاصل از ریشه­هایی که در شرایط آبیاری کامل قرار دارند با سیگنال­های شیمیایی منفی برای کمک به جداسازی سهم هر کدام در احساس خشکی، اجرایی می­گردد.  این روش به طور اختصاصی به شناسایی چگونگی تغییر پروتئوم ریشه­هایی که در معرض آبیاری کامل هستند توسط پیام­های هورمونی ناشی از ریشه­های تحت خشکی کامل و متقابلا اثرهای هیدرولیکی ناشی از ریشه­های دارای آب کافی بر ریشه­های در معرض خشکی می­پردازد و نه تنها حاوی اطلاعات پیام­های خشکی به ساقه می­باشد بلکه امکان مطالعه سیگنال­های با فواصل زیاد و نحوه بیان ژن در تقابل نواحی از سیستم ریشه با میزان آب متفاوت را فراهم می­کند. همچنین سرنخ­هایی بر پایه واساس محدودیت آبیاری که در آن ریشه­های خشک پیام­های صرفه جویی آب را القا می­کنند و به طور همزمان گیاه آب کافی را از ناحیه­ای که آبیاری کامل انجام می­شود دریافت می­کند را نیز به ما می­دهد. پروتئومیکس ابزاری قدرتمند در شناسایی و بررسی ژن‌های پاسخ‌دهنده به تنش بوده که در سال‌های اخیر استفاده از آن جهت شناخت ماهیت تنش‌های زنده و غیر‌زنده و کشف مکانیزم‌های دفاعی گیاهان به منظور استفاده در برنامه‌های اصلاحی رشد چشمگیری یافته است. این تکنیک در مورد گیاهانی از جمله ذرت ((Vincent, 2005 برنج ,(Salekdeh et al., 2002; Ali,G.M et al., 2006; Mirzaei et al., 2011) چغندرقند(Hajheidari et al., 2005) ، موز (Carpenter, 2007)، یونجه(Aranjuelo ) و گندم،  (Bazargani et al., 2011)  به طور جداگانه تحت شرایط خشکی مورد استفاده قرار گرفته­است.

 

مواد و روشها

بذور مورد استفاده در این مطالعه، ژنوتیپ IR64 و از موسسه بین المللی تحقیقات برنج و جهت جوانه­زنی به ژرمیناتور منتقل شدند، سه روز پس از جوانه زنی، گیاهچه­ها به محیط کشت یوشیدا و پس از 10 روز  به گلدانهایی به ابعاد 26×20×15 که یک دیوار میانی گلدان را به دو قسمت مساوی تقسیم کرده جهت کشت ((split-root منتقل گردید.  گلدانها با مخلوطی از شن، ماسه و خاک گلدان با نسبت (1:2:1) پر شدند، گیاهچه بر روی دیوار میانی قرار گرفت و ریشه­ها به طور مساوی به دو طرف گلدان­ها هدایت شدند. جهت استقرار، گیاهان به مدت دو هفته در شرایط کاملا یکسان و میزان آب یکسان قرار داشتند پس از اتمام این دو هفته، تنش خشکی در سه تیمار و سه تکرار در قالب طرح کاملا تصادفی به این صورت که: آبیاری گلدان­ها همانند دو هفته استقرار ادامه یافت ((WW[1]. تیمار دوم آبیاری گلدان­ها کاملا قطع شد (WD)[2] و تیمار سوم؛ یک طرف گلدان آبیاری کامل ((spWW[3] و بخش دیگر همان گلدان قطع آبیاری (spWD)[4] اعمال شد و دو هفته پس از تنش نمونه برداری انجام شد، ریشه­ها با آب مقطر شستشو و به فریزر 80- انتقال داده شد.

 

محتوای آب نسبی

محتوای آی نسبی طبق روش Barrs ((1962 اندازه­گیری شد. دیسکهایی به قطر یک سانتیمتر از آخرین برگ گسترش یافته تهیه کرده بلافاصله توزین شده و وزن تر[5] آنها یادداشت گردید. سپس نمونه­های گیاهی در 15 میلی لیتر آب مقطر (25 درجه سانتیگراد) غوطه ور شدند. پس از گذشت 16 ساعت از آب مقطر خارج شده و مجددا وزن آنها تعیین گردید. نمونه های وزن شده به مدت 48 ساعت درون پاکت های کاغذی در آون (70 درجه سانتیگراد) قرار گرفتند تا کاملا خشک شوند. در نهایت وزن نمونه های خشک شده یادداشت گردید و درصد محتوای آب نسبی با استفاده از معادله زیر محاسبه شد.

RWC(%) =[(fresh weight-dryweight)/ (turgid weight – dry weight )]*100

 

تجزیه و تحلیل کمی ABA

استخراج ABA براساس روش Durley ((1982 با کمی تغییرات بدین شرح انجام شد. 5/0 گرم از نمونه های منجمد شده در هاون چینی پودر ، و به فالکون های 50 میلی­لیتری منتقل شدند. سپس 40 میلی­لیتر محلول متانول 80 درصد حاوی و سدیم اسکوربات به آن افزوده شد و به مدت 16 ساعت در تاریکی در دمای 4 درجه سانتیگراد نگهداری شد تا عمل انحلال هورمون ها در محلول به خوبی انجام شود. سپس نمونه ها توسط کاغذ صافی و اتمن 40 صاف شدند. متانول اضافی با استفاده از دستگاه لیوفلایزر از محلول صاف شده حذف شد. به محلول باقی مانده به مقدار مساوی محلول با فر فسفات (8g NaC1 , 0.2g KH2PO4,9.6g NaHPO412H2O1-1) اضافه شد وpH  آن «با هیدرواکسید پتاسیم 2/0 نرمال 2-3 تنظیم شده و دوبار دیگر با اتیل استات شتشو شد با این تفاوت که این بار اتیل استات در فالکون های جداگانه نگهداری شد. سپس اتیل استات توسط دستگاه لیوفلایزر کاملا تبخیر شد. پس از تبخیر کامل اتیل استات، بالفاصله رسوب باقی مانده رادر 1 میلی لیتر متانول با درجه خلوص HPLC[6] حل کرده و از فیلتر پلی تترافلوئورواتیلن 45/0 عبور داده تا نمونه ها آماده تزریق به دستگاه HPLC (Knuer Germany) شوند. سپس با استفاده از ستونc18 و فاز مایع اسید استیک 1/0 نرمال (آب اسید) و متانول 80 درصد مخصوصHPLC به نسبت 50:50 و شدت جریان 8/0 میلی لیتر در دقیقه ، تفکیک ABA صورت گرفته، و شناسایی هورمون ها با استفاده از دتکتور UV/VISدر طول موج 257 نانومتر انجام شد. باید توجه داشت به دلیل ناپایداری زیاد هورمون ها در نور بهتر است در حد امکان مراحل استخراج در تاریکی انجام شود.

 

استخراج پروتیین  

بافت گیاهی نگهداری شده در C  80- را به طورکامل پودر کرده واستخراج پروتیین از بافت گیاهی توسط ترایزول انجام شد. غلظت‌سنجی نمونه‌ها با استفاده از آزمون بردفورد انجام شد. برای انجام این آزمون از پودر پروتیینی BSA و محلول بردفورد ((Bio-Rad,Hercules,CA,USA محلول‌های استاندارد پروتیینی با غلظت مشخص تهیه و با استفاده از دستگاه اسپکتروفتومتر Cary300 در طول موج  nm595 تعیین غلظت شدند.

الکتروفورز دو بعدی

از ژل‌های نواری(Immobilin pH Gradiant) IPG  تهیه شده از شرکت (Amersham Pharmacia Biotech) با مشخصات ‌‌‌(7-4=pH وCm  24) جهت الکتروفورز استفاده شد. در محلول آبگیری  (8 M Urea, 0.5%Chaps, 0mM DTT, 0.5% v/v IPG buffer)) و300 میکروگرم پروتیین برای تهیه ژل‌های آنالیتیک (رنگ آمیزی شده با نیترات نقره) حل شد طوری که حجم کل محلول به350 ماکرولیتر برسد. آنگاه در داخل سینی‌های مخصوص بازجذب، ژل‌های نواری (Reswelling Trays) به مدت20 ساعت با این محلول تیمار و برای IEF(Isoelectricefocusing) به دستگاه Multiphor II منتقل شدند و الکتروفورز در دمای cْ20 با برنامة (V300 به مدت 1 ساعت، V500 به مدت 1 ساعت، V1000 به مدت 1 ساعت و V3500 به مدت 14 ساعت) انجام شد. پس از انجام IEF ژل‌های نواری به مدت 15 دقیقه در محلول متعادل‏کننده (SDS equilibration buffer) حاوی DTT 6M urea, 30% w/v) glycerol, 2% w/vSDS, 1% w/v DTT, 50 mM Tris-HCl buffer, pH 8.8) شیک شدند، پس از حذف بافر متعادل کننده مجددا 15 دقیقه دیگر در محلول متعادل کننده حاوی 2.5 w/v درصد ایدو‌استاماید شناور شدند. پس از شستشو با بافر تانک در روی ژل‌های 12 درصد SDS-PAGE قرار داده شدند و از محلول w/v 005/0 درصد آگارز جهت اتصال دو ژل استفاده شد. سپس با استفاده از تانک الکتروفورز عمودی (PROTEIN II, Bio-Rad)، با جریان v200 بعد دوم انجام شد. با پایان یافتن بعد دوم ژل‌ها از روی شیشه‌ جدا و حد‌اقل به مدت یک ساعت در محلول ثابت‌کننده (Fixator Solution) نگهداری شدند. ژل‌های آنالیتیک با استفاده از روش نیترات نقره و ژل‌های آماده‌سازی با روش کوماسی‌بلو رنگ‌آمیزی شدند  .(Blum, 1987; Smith, 1995)

 

اکتساب تصاویر، آنالیز ژل‌ها و شناسایی نقاط با MS

ژل‌ها پس از رنگ‏آمیزی با استفاده از دنسیتومتر (Bio-Rad) GS-700، با وضوح dpi600 اسکن و با فرمت Tiff ذخیره شدند. شناسایی و کمیت سنجی پروتیین‌ها (نقاط) و مقایسه ژل‌های کنترل با ژل‌های تحت تنش، به وسیله نرم‌افزار Melanie6 (Gen Bio, Geneva, Switzerland) انجام شد. در این تحقیق نقاط تکرارپذیر در سه تکرار، به عنوان نقاط مورد نظر برای آنالیز آماری انتخاب شده و آنالیز آماری نقاط با استفاده از t-test انجام و نقاط معنی‌دار در سطح (P ≤ 0.05) در صورتی ‏که مقدار بیان آن‌ها حداقل یک و نیم برابر نسبت به شاهد تغییر داشت، برای شناسایی با ESI-Q-TOF MS/MS، از روی ژل‌های رنگ‌آمیزی شده با کوماسی‌بلو جدا و به کشور استرالیا جهت شناسایی فرستاده شدند.

نتایج و بحث

محتوای آب نسبی و ABA

محتوای آب نسبی برگ­ها در هر دو تیمار WD و split-root نسبت به تیمار WW کمتر بود. (شکل1) تنش خشکی محتوای نسبی آب برگها را در تیمار split-root 16% و در تیمار WD حدود 30% نسبت به تیمار WW کاهش داده می­تواند بازگو کننده این مطلب باشد که نیمی از ریشه­ها که در شرایط آب کافی قرار دارند ضمن کمبود آب در نیم دیگر ریشه­ها، توانسته­اند تا حدی آب کافی را جذب کنند. همگام با کاهش سطح آب سطح ABA نیز درتیمارهای WD و  split-rootافزایش یافت اما این افزایش مقداری در تیمار WD بیشتر بود.پس از اندازه­گیری میزان ABA در تیمارها مشخص شد که تیمارهای WD و split-root به ترتیب 39% و23% نسبت به تیمار  WWافزایش نشان داد. (شکل 2)

 

تغییرات الگوی پروتئوم ریشه

از 738 نقطه تکرار‏پذیر در ریشه، 32 نقطه پروتیینی از نظر آماری در سطح 5 درصد تغییر معنی‌داری در بیان خود نشان دادند. از این تعداد 13 نقطه پروتیینی در هر دو تیمار WD و spWD افزایش بیان داشته، تعداد 9 نقطه پروتیینی در هر سه تیمار WD، spWD و spWW نسبت به گیاهان نرمال (WW) افزایش نشان داده، تعداد 8 نقطه پروتیینی در گیاهان نرمال بیان نشده و 2 نقطه پروتیینی فقط در تیمار WD افزایش نشان داده. (شکل 3) عملکرد پروتیین­ها در پاسخ به خشکی را در چند گروه ازجمله پروتیین­های پاسخ دهنده به محرک­ها،پروتیین­های دخیل در اکسیداسیون و احیا، متابولیسم لیپیدها و پیام رسانی میتوان خلاصه نمود. پروتیین­هایی که درگیر پاسخ به محرک­ها هستند نقشهای مختلفی ایفا می­کنند که HSP ها و PR پروتئین­ها گروهی از این دسته هستند که توسط خشکی القا می­شوند.

 

PR پروتیین­ها[7]

علیرغم نامشان تنها ویژه بیماری­ها نیستند بلکه اغلب توسط تنش­های مختلف غیر زنده القا می­شوند. خشکی (Dubos, 2001; Lee, 2008) شوری، (Srivastava, 2004) سرما، (Hon, 1995)  حرارت (Duke, 1996)  و فلزات سنگین، همچنین طی رشد و پیری گیاه القا می­شوند و این القا وابسته به حضور مولکول­های سیگنالینگ مانند اتیلن، آبسزیک­اسید و سالیسیلیک­اسید می­باشد Marion et al., 2003)). PR پروتیین­ها اولین­بار در تنباکو مشاهده شدند 2011)  (Afroz et al.,و به 17 گروه PR 1-17)) تقسیم می­شوند در این مطالعه چهار PR پروتئین در تیمارهای WD و spWD افزایش بیان شدیدی نشان دادند از جمله PR-10 و کیتیناز نقاط پروتیینی 7، 611 و 154 و باروین barwin نقطه پروتئینی 260 که در گیاهان نرمالWW مشاهده نشد و شبه تائوماتین نقطه پروتیینی 19 که علاوه بر افزایش در تیمارهای WD وspWD  در تیمار sp­WW  نیز افزایش نشان داده. که القا آن به علت سیگنال­هایی است که از ریشه در معرض خشکی ارسال می­شود (جدول1).

 

پروتئین­های شوک حرارتی (HSPs)[8] و چاپرونین­ها

موجودات زنده در پاسخ به دماهای بالا سنتز گروهی از پروتئین­ها به نام پروتئین­های شوک حرارتی (HSPs) را که از نظر تکاملی حفظ شده­اند، افزایش می­دهند (Vierling, 1991). هنگامی که گیاهان در معرض دماهای بالا قرار می­گیرند سنتز hsp­های با وزن مولکولی زیاد (kDa110-60) و hspهای با وزن مولکولی کم (kDa45-15) را افزایش می­دهند. این پروتئین­ها همچنین چاپرون­های مولکولی مرتبط با تنش[9] نیز نامیده می­شوند (Miernyk, 1997). پروتئین­های hsp در پاسخ به خشکی و سایر تنش­های محیطی شامل دمای پایین، شوری و غرقاب بیان می­شوند. پروتئین­های hsp و چاپرونین­ها در فرایند­های مهمی از جمله ترجمه، جابجایی پروتئین­ها به اندامک­ها، تاخوردن مجدد پروتئین­های دناتوره شده تحت تنش و جلوگیری از تجمع پروتئین­های دناتوره شده نقش دارند. این دسته از پروتیین­ها نیز مانند PR پروتئین­ها بر خلاف نامشان در متابولیسم نیز نقش دارند. در این مطالعه 2 پروتیین hsp شناسایی شد نقاط پروتیینی 381 و 382  که  در تیمارهای WD و spWD افزایش بیان و در تیمار spWW افزایش معنا داری نسبت به گیاهان در شرایط نرمال نشان نمی­دهد (جدول1).

 

تیرودوکسین[10]

از سری پروتیین­هایی هستند که طی تنش خشکی بیان می­شوند و دارای توان احیا کننده­گی بالایی بوده و بنابراین نقش مهمی در اکسیداسیون و احیا سلولی دارند. این آنزیم­ از آنزیم­های مهم در مسیرهای متابولیک و تنظیمی دیگر همچون چرخه کالوین، متابولیسم انرژی، فتوسنتز، پیچش پروتئین­ها و سنتز آمینواسیدها محسوب می­گردند (Sanchez & Hochstrasser, 1999).

 

 

 

جدول 1- نتایج طیف سنجی جرمی پروتیین‌های ریشه  گیاه برنج که به روش  ESI-Q-TOF MS/MSشناسایی شده اند. نقاط شناسایی شده به شدت افزایش بیان نسبت به WW  نشان دادند(p<0.05) . NWW: این نقطه پروتیینی در WW قابل جداسازی نبودند.

Table 1. Differentially expressed proteins identified by MALDI TOF/TOF mass spectrometer  Significant up-regulated proteins in spWD and/or DD and/or spWW conditions compared to WW condition (p<0.05) ;     NWW: not detected in well-watered samples.

Induction Factor

PMF/

MS-MSf

Score/ coveragee

Protein name

Gi no.d

Theo.

pI /MW

Exp. pI/MWb

Spota

DD/

WW

SPWW/

WW

SPWD/WW

4.438

1.70

2.94

 

225/66

salT protein

2072553

5/15

4.7/16

2

 

 

NWW

4/2

245/31

salT protein

2072553

5.19/15

4.7/17

3

2.98

1.52

3.32

3/2

231/14

 chitinase

115462835

5.56/22

4.6/17

7

5.41

2.68

8.19

7/7

1060/71

salT protein

115436436

5/15

5/16

10

6.77

1.9

7.03

3/3

184/23

Thioredoxin Type H

82407383

4.9/13

5.25/16

16

5.95

1.75

5.21

3/3

182/22

Thaumatin-like protein

115489688

5.07/17

5.31/19

19

4.97

1.39

4.07

8/6

410/54

pathogenesis-related protein 10

115489014

4.88/16

5.21/19

26

 

 

 

 

 

 

NWW

5/4

506/34

Barwin

125535005

8.16/16

6.49/16

58

 

 

NWW

2/1

72/37

Late embryogenesis abundant protein, group 3

115434068

8.34/40

5.65/33

75

2.95

1.85

3.76

6/1

84/40

drought-inducedS-like ribonuclease

9068149

5.25/38

5.32/31

136

17.08

8.94

12.05

8/6

693/58

Secretory protein, Putative

115482666

5.76/24

5.54/29

150

7.94

2.04

7.96

4/3

143/35

chitinase

3370780

6.28/27

5.45/30

154

3.29

1.87

4.74

5/4

437/24

DREPP plasma membrane polypeptide family protein

115435500

4.92/21

5/33

167

2.76

1.71

2.71

6/3

116/22

Receptor like-protein kinase DUF26

115461070

5.01/27

5.1/32

170

4.63

4.06

7.75

6/4

473/51

salT protein

158513205

5/15

4.97/35

175

 

 

NWW

11/4

279/29

Chitinase class III

115482030

4.48/31

4.65/33

 

Table 1. Differentially expressed proteins identified by MALDI TOF/TOF mass spectrometer  Significant up-regulated proteins in spWD and/or DD and/or spWW conditions compared to WW condition (p<0.05) ;     NWW: not detected in well-watered samples.
202

2.13

2.64

2.03

8/4

300/21

Late embryogenesis abundant protein 2 family

115456523

4.9/34

5/42

218

6.15

3.53

3.79

3/3

339/11

EF-Hand containing protein

115481300

4.94/42

5/53

224

7.15

2.88

4.70

 

356/15

EF-Hand containing protein

115481300

4.94/42

5.3/52

225

5.06

2.99

2.85

 

560/47

Actin-depolymerizing factor 3

115456239

4.9/16

4.88/23

 

Table 1. Differentially expressed proteins identified by MALDI TOF/TOF mass spectrometer  Significant up-regulated proteins in spWD and/or DD and/or spWW conditions compared to WW condition (p<0.05) ;     NWW: not detected in well-watered samples.
235

 

 

NWW

5/2

168/45

salT protein

158513205

5/15

5.51/17

251

 

 

NWW

8/3

477/46

Barwin

125535005

8.16/16

5.78/15

 

Table 1. Differentially expressed proteins identified by MALDI TOF/TOF mass spectrometer  Significant up-regulated proteins in spWD and/or DD and/or spWW conditions compared to WW condition (p<0.05) ;     NWW: not detected in well-watered samples.
260

7.16

4.67

6.89

7/2

293/33

glutathione S-transferase II

115440119

5.72/23

6.13/30

272

(ادامه جدول 1)

Continue table 1

Induction Factor

PMF/

MS-MSf

Score/ coveragee

Protein name

Gi no.d

Theo.

pI /MW

Exp. pI/MWb

Spota

DD/

WW

SPWW/

WW

SPWD/WW

1.74

1.09

1.35

6/4

430/19

60S acidic ribosomal protein P0

115474653

5.38/34

5.64/41

302

2.95

2.30

12.07

5/4

188/45

salT protein

158513205

5/15

5.3/39

323

2.17

2.37

2.53

2/1

108/10

Fructokinase-2

125559927

5.02/35

5.16/42

336

2.00

0.96

1.52

3/3

143/6

heat shock protein 70, chloroplast

222631026

5.12/73

4.93/91

381

2.13

1.05

2.2

8/5

464/12

heat shock protein 70, chloroplast

222631026

5.12/73

4.94/93

382

33.77

3.65

16.03

6/3

373/22

Chitinase 9

115463755

4.47/34

4.49/39

611

 

 

NWW

10/2

157/20

putative chitinase

54291729

6.08/32

6.31/31

628

 

 

NWW

4/2

87/49

Subitilisin-chymotrypsin inhibitor

125526847

5.39/7

4.86/13

691

2.13

1.20

2.30

14/5

337/

glyoxalase I

115475151

 

/32

5.57/38

726

 


علاوه بر این، خاصیت آنتی­اکسیدانی، تیوردوکسین­ها باعث محافظت سلول­ها در برابر تنش­های اکسیداتیو حاصل از تنش­ها می­شود و از طریق حذف H2O2 و برخی رادیکال­های آزاد، در فرایند سم­زدایی این ترکیبات شرکت می­نمایند (Zhu, J.K, 2001). تیوردوکسین­ها در تعدادی از فرایندهای بیوشیمیایی مانند نقل و انتقال پروتیین و نشاسته در زمان جوانه­زنی بذور غلات و تنظیم فعالیت آنزیم­های درگیر در متابولیـسم کربوهیـدرات­ها نیز دخالت دارند (Balmer, 2004). نقطه پروتیینی 16 مربوط به این آنزیم بوده که در تیمارهای WD و spWD افزایش بیان بالایی نسبت به WW نشان داده در صورتیکه افزایش بیان در تیمار spWW نسبت به تیمار نرمال معنا دار نبوده است (جدول 1).

نتیجه‌گیری

استفاده از سیستم کشت تقسیم ریشه امکان بررسی حضور پیام­های ریشه در گیاهان برنج تحت تنش را فراهم ساخته است. این مطلب با کاهش در محتوای آب نسبی،وزن خشک و افزایش میزان ABA در گیاهانی که فقط یک قسمت از ریشه­هایش تحت تنش قرار داشتند، نشان داده شد همچنین نتایج افزایش بیان پروتیین­های درگیر در مکانیسم­های دفاعی از جمله PR پروتیین­ها، HSPs و پروتیین­های درگیر در اکسیداسیون واحیا را نشان می­دهد. این مطالعه می­تواند سرآغاز خوبی برای مطالعات بیشتر در زمینه بررسی نقش پروتیین­های متفاوت در شروع و پیشرفت تنش خشکی و عملکرد دقیق آنها در مراحل مختلف رشد گیاه و تنش باشد.  

 

 

 

 

 

%RWC
 

 

 

 


شکل 1- محتوای آب نسبی.

Figure 1- Relative water content.

 

 

 

 

g/grµ
 

 

 

 

 

 


شکل 2- میزان آبسزیک اسید میکروگرم در هر گرم بافت گیاه

Figure 2- Abscisic acid in microgram per gram of leaf tissue.

 

 

 

شکل 1 و 2 پارامترهای فیزیولوژیک که از برگ گیاهان با آبیاری کامل (WW)، تحت خشکی (WD) و گیاهان در شرایط تقسیم ریشه   (SP) تهیه شد.


 

 

 

 

 

 

 

شکل3- تصویر ژل دو‌بعدی ریشه برنج و بزرگنمایی نقاط شناسایی شده. در بعد اول 300 میکرو‌گرم پروتیین از هر نمونه روی ژل‌های نواری لود شد و برای بعد دوم از ژل‌های 12 درصد SDS-PAGE استفاده شد. رنگ‌آمیزی نیترات نقره برای ظاهر‌سازی نقاط به کار رفت. نقاط اشاره شده مجموعه پروتیین‌های ریشه برنج را نشان می‌دهد که بیان آن‌ها در پاسخ به تنش خشکی تغییر یافته است.

 Figure 3- 2-D gel analysis of proteins extracted from root. In the first dimension (IEF), 300 µg of protein was loaded on a 24 cm IPG strip with a linear gradient of pH 4-7. In the second dimension, 12% SDS-PAGE gels were used, with a well for molecular weight standards. Proteins were visualized by silver staining. Arrows represent drought responsive spots identified by MS (Table 1).

منابع

Afroz GM, Ali A (2011). Springer Application of proteomics to investigate stress induced proteins for improvement in crop protection. Plant cell reports30:745-763 .

Ali G, Komatsu S (2006). Proteomic analysis of rice leaf sheath during drought stress. Proteome Research 5: 396-403.

Aranjuelo I, Molero G, Erice G, Avice J, Nogués S (2011). Plant physiology and proteomics reveals the leaf response to drought in alfalfa (Medicago sativa L.). Experimental Botany 62: 23-111.

Ashraf (1994). Breeding for salinity tolerance in plants. Review plant science 13: 17-32

Balmer Y, Vensel C, Tanaka W, Hukman, Gelhaye E, Rouhier J, Jacquot W, Manieri P.Schurmann M (2004). Thioredoxin links redox to the regulation of fundamental processes of plant mitochondria. Proc. Natl. Acad. Science USA 101: 2642-2647.

Barrs H, Weatherley P (1962). Reexamination of the relative turgidity technique for estimating water deficits in leaves. Australian Journal of Biological Sciences 15: 413-428

Bazargani M, Sarhadi E, Bushehri A, Matros A, Mock H.P, Naghavi M, Hajihoseini V, Mardi M, Hajirezaei M, Moradi F, Ehdaie B, Salekdeh G.H (2011). A proteomics view on the role of drought-induced senescence oxidative stressdefense in enhanced stem reserves remobilization in wheat. Proteomics 6;74(10):1959-73.

 Blackman P.G, Davies W (1985). Root to shoot communication in maize plants of the effects of soil drying. Experimental Botany 36: 39-48.

 Blum H, Beier H, Bremer E (1987). Improved silver staining of plant proteins, RNA and DNA in polyacrylamide gels. Electrophoresis. 8: 93–99.

Boyer J.S (1982). Plant productivity and environment. Science 218: 443-444.

Carpentier S, Witters E, Laukens K, Van Onckelen R, Panis B (2007). Banana (Musa spp.) as a model to study the meristem proteome: Acclimation to osmotic stress. Proteomics 7: 92-105.

Chaves M, Maroco J.P and Pereia J.S (2003). Understanding plant responses to     drought from genes to the whole plant ,Functional plant Biology 30: 239- 264.                    

Comstock p (2002). Hydraulic and chemical signaling in the control of stoma conductance and transpiration. Journal of Experimental Botany 16: 341–349.

Dubos C, Plomion C (2001). Drought differentially affects expression of a PR-10 protein in needles of maritime pine (Pinus pinaster Ait.) seedlings. Experimental Botany 52: 1143-1144.

Duke E. R, Doehlert D (1996). Effects of heat stress on enzyme activities and transcript levels in developing maize kernels grown in culture. Environ. Experimental Botany  36:  199-208.

Durley R. C, Kannagara T, Simpson G (1982). Leaf analysis for abscisic, phaseic and 3-indolylacetic acids by high-performance liquid chromatography. Journal Chromatography 236: 181-188.

Hajheidari M, Abdollahian-Noghabi M, Askari H, Heidari M, Ober E, Hosseini Salekdeh G (2005). Proteome analysis of sugar beet leaves under drought. Proteomics 5: 950-960.

Hon C, Griffith M, ynarz A, Yang D (1995). Antifreeze proteins in winter rye are similar to pathogenesis-related proteins. Plant Physiology. 109: 879-889.

Hsiao T. C (1973). Plant responses to water stress. Annual Review of Plant Physiology, 24: 519-570.

Kavar T, Maaras M, Kidrie S, ustar – Vozlie J and Meglic V (2008). Identificatiion of genes involved in the response of leaves of Phasiolus vulgaris to drought stress. Springer 21: 159-172.

 Lee B, Jung W, Lee B, Avice J, Ourry A, Kim T (2008). Kinetics of drought-induced pathogenesis-related proteins and its physiological significance in white clover leaves. Plant Physiology 132: 329-337.

Marion, Fecht-Christoffer, HP Braun (2003). Effect of manganese toxicity on the proteome of cowpea plant physiology 4: 1935-1946.

Miernyk JA (1997). The 70 KDa stress-related proteins as molecular chaperons. Trends. Plant science 2: 180-187.

Mirzaei M, Pascovici D, Atwell B, Haynes P (2011). Differential regulation ofaquaporins and small GTPases in rice leaves subjected to drought stress and recovery. Proteomics  12: 864-877.

Nilson S, Assmann S (2010). The α-subunit of the arabidopsis heterotrimeric Gprotein, GPA1, is a regulator of transpiration efficiency. Plant Physiology 152: 2067-2077.

Saab N, Sharp R, Pritchard J, Voetberg S (1990). Increased endogenous abscisic acid maintains primary root growth and inhibits shoot growth of maize seedlings at low water potentials. Plant Physiology 93: 1329-1336.

Salekdeh G. H, Siopongco, Bennet J (2002). proteomic analysis of rice leaves during drought stress. Proteomics 2: 1131-1145.            

 Sanchez J. C, Hochstrasser D. F (1999). High-resolution, IPG-based, mini two-dimensional gel electrophoresis. Methods in Molecular Biology. 112: 227–233.

Sharp  R, Davies W (1985). Root growth and water uptake by maize plants in drying soil. J. Experimental Botany 36: 1441-1456.

Shinozaki K and Yamaguchi – Shinozaki K (2000). Molecular responses to dehydration and low temperature: differences and cross – talk between two stress signaling pathways. plant  Biology 3: 217-223.

Smith DM, Tran HM, Epstein LB (1995). Two-dimensional electro- (Balkwill, F. R., ed.), IRL Press at Oxford University Press, Oxford, pp 111–128.

Srivastava S, Fristensky B, Kav N. N. V (2004). Constitutive expression of a PR10 protein enhances the germination of Brassica napus under saline conditions. Plant Cell Physiology 45: 1320-1324.

Vierling E (1991). The role of heat shock protein in plants. Annual review plant physiol Plant Mol Biol 42: 579-620.

Vincent D, Lapierre C, Pollet B, Cornic G, Negroni L, Zivy M (2005). Water deficits affect caffeate o-methyltransferase, lignification, and related enzymes in maize leaves Plant Physiology 137: 949-960.

Yamaguchi- Shinoazkil K, Kasugal M, Liu Q, Nakadhima K, Saluma Y, Abe H, Shinwari Z, Seki M and shinozaki K (2002). Bioligical mechanisms of drought stress response. JIFCAS Working Report. Pp, 1-8.

Yoshida T, Fujita Y, Sayama H, Kidokoro S, Maruyama K, Mizoi J, Shinozaki K, Yamaguchi-Shinozaki K (2010). AREB1, AREB2, and ABF3 are mastertranscription factors that cooperatively regulate ABRE-dependent ABA signaling involved in drought stress tolerance and require ABA for full activation. Plant journal 61: 672-685.

Zhu J. K (2001). Plant salt tolerance. Plant Science. 6: 66-71.

 

 

 

 

 

 

 

Proteome analyses of drought signaling in rice root

 

Soltani N.1, Hosseini Salekdeh Gh*2

 

1Science and Research Branch, Islamic Azad University, Tehran, Iran.

2[11]Department of Systems Biology, Agricultural Biotechnology Research Institute of Karaj, Iran.

 

Abstract

Rice (Oryza sativa L. cv. IR64) was grown in split-root systems in order to analyze long-distance drought signaling within root systems. This in turn underpins how root systems in heterogeneous soils adapt to drought. The approach was to compare four root tissues: Well watered (WW), water deficit (WD), split-root systems where one half was well watered (spWW) and the other half water deficit (spWD). This was specifically aimed at identifying how drought root tissues altered the proteome of adjacent wet roots by hormone signals and secondly, how wet roots reciprocally affected dry roots hydraulically. Using a 2-DE based proteomics approach, 738 protein spots were reproducibly detected, Thirty-two proteins showed reproducible and statistically significant changes in response to drought. Of them, 13 protein spots up-regulated in WD and spWD treatments. Of them 9 protein spots up-regulated  in WD, spWD and spWW treatments, 8 protein spots not detected in WW and 2 protein spots just detected in WD. Specific functional groups changed consistently in drought. Pathogenesis-related proteins were generally up-regulated in response to drought and heat-shock proteins and thioredoxin were totally absent in roots of fully watered plants.

 

Keywords: Drought, Split root, Rice, Proteomics.[12]

 

 


* نویسنده مسئول: قاسم حسینی سالکده                  تلفن: 02632703536                                   h_salekdeh@abrii.ac.ir Email:

[1] Well water

[2] Water Deficit

[3] Split root-Well water

[4] Split root-Water Deficit

[5] Fresh weight

[6] High performance liquid chromatography

Pathogenesis related proteins-1

Heat shock protein-1

-2Stress-related chaperon

 

Thioredoxin-1

* Corresponding Author: Hosseini Salekdeh Gh.            Tel: 02632703536         Email: h_salekdeh@abrii.ac.ir

 

 

References

Afroz GM, Ali A (2011). Springer Application of proteomics to investigate stress induced proteins for improvement in crop protection. Plant cell reports30:745-763 .
Ali G, Komatsu S (2006). Proteomic analysis of rice leaf sheath during drought stress. Proteome Research 5: 396-403.
Aranjuelo I, Molero G, Erice G, Avice J, Nogués S (2011). Plant physiology and proteomics reveals the leaf response to drought in alfalfa (Medicago sativa L.). Experimental Botany 62: 23-111.
Ashraf (1994). Breeding for salinity tolerance in plants. Review plant science 13: 17-32
Balmer Y, Vensel C, Tanaka W, Hukman, Gelhaye E, Rouhier J, Jacquot W, Manieri P.Schurmann M (2004). Thioredoxin links redox to the regulation of fundamental processes of plant mitochondria. Proc. Natl. Acad. Science USA 101: 2642-2647.
Barrs H, Weatherley P (1962). Reexamination of the relative turgidity technique for estimating water deficits in leaves. Australian Journal of Biological Sciences 15: 413-428
Bazargani M, Sarhadi E, Bushehri A, Matros A, Mock H.P, Naghavi M, Hajihoseini V, Mardi M, Hajirezaei M, Moradi F, Ehdaie B, Salekdeh G.H (2011). A proteomics view on the role of drought-induced senescence oxidative stressdefense in enhanced stem reserves remobilization in wheat. Proteomics 6;74(10):1959-73.
 Blackman P.G, Davies W (1985). Root to shoot communication in maize plants of the effects of soil drying. Experimental Botany 36: 39-48.
 Blum H, Beier H, Bremer E (1987). Improved silver staining of plant proteins, RNA and DNA in polyacrylamide gels. Electrophoresis. 8: 93–99.
Boyer J.S (1982). Plant productivity and environment. Science 218: 443-444.
Carpentier S, Witters E, Laukens K, Van Onckelen R, Panis B (2007). Banana (Musa spp.) as a model to study the meristem proteome: Acclimation to osmotic stress. Proteomics 7: 92-105.
Chaves M, Maroco J.P and Pereia J.S (2003). Understanding plant responses to     drought from genes to the whole plant ,Functional plant Biology 30: 239- 264.                    
Comstock p (2002). Hydraulic and chemical signaling in the control of stoma conductance and transpiration. Journal of Experimental Botany 16: 341–349.
Dubos C, Plomion C (2001). Drought differentially affects expression of a PR-10 protein in needles of maritime pine (Pinus pinaster Ait.) seedlings. Experimental Botany 52: 1143-1144.
Duke E. R, Doehlert D (1996). Effects of heat stress on enzyme activities and transcript levels in developing maize kernels grown in culture. Environ. Experimental Botany  36:  199-208.
Durley R. C, Kannagara T, Simpson G (1982). Leaf analysis for abscisic, phaseic and 3-indolylacetic acids by high-performance liquid chromatography. Journal Chromatography 236: 181-188.
Hajheidari M, Abdollahian-Noghabi M, Askari H, Heidari M, Ober E, Hosseini Salekdeh G (2005). Proteome analysis of sugar beet leaves under drought. Proteomics 5: 950-960.
Hon C, Griffith M, ynarz A, Yang D (1995). Antifreeze proteins in winter rye are similar to pathogenesis-related proteins. Plant Physiology. 109: 879-889.
Hsiao T. C (1973). Plant responses to water stress. Annual Review of Plant Physiology, 24: 519-570.
Kavar T, Maaras M, Kidrie S, ustar – Vozlie J and Meglic V (2008). Identificatiion of genes involved in the response of leaves of Phasiolus vulgaris to drought stress. Springer 21: 159-172.
 Lee B, Jung W, Lee B, Avice J, Ourry A, Kim T (2008). Kinetics of drought-induced pathogenesis-related proteins and its physiological significance in white clover leaves. Plant Physiology 132: 329-337.
Marion, Fecht-Christoffer, HP Braun (2003). Effect of manganese toxicity on the proteome of cowpea plant physiology 4: 1935-1946.
Miernyk JA (1997). The 70 KDa stress-related proteins as molecular chaperons. Trends. Plant science 2: 180-187.
Mirzaei M, Pascovici D, Atwell B, Haynes P (2011). Differential regulation ofaquaporins and small GTPases in rice leaves subjected to drought stress and recovery. Proteomics  12: 864-877.
Nilson S, Assmann S (2010). The α-subunit of the arabidopsis heterotrimeric Gprotein, GPA1, is a regulator of transpiration efficiency. Plant Physiology 152: 2067-2077.
Saab N, Sharp R, Pritchard J, Voetberg S (1990). Increased endogenous abscisic acid maintains primary root growth and inhibits shoot growth of maize seedlings at low water potentials. Plant Physiology 93: 1329-1336.
Salekdeh G. H, Siopongco, Bennet J (2002). proteomic analysis of rice leaves during drought stress. Proteomics 2: 1131-1145.            
 Sanchez J. C, Hochstrasser D. F (1999). High-resolution, IPG-based, mini two-dimensional gel electrophoresis. Methods in Molecular Biology. 112: 227–233.
Sharp  R, Davies W (1985). Root growth and water uptake by maize plants in drying soil. J. Experimental Botany 36: 1441-1456.
Shinozaki K and Yamaguchi – Shinozaki K (2000). Molecular responses to dehydration and low temperature: differences and cross – talk between two stress signaling pathways. plant  Biology 3: 217-223.
Smith DM, Tran HM, Epstein LB (1995). Two-dimensional electro- (Balkwill, F. R., ed.), IRL Press at Oxford University Press, Oxford, pp 111–128.
Srivastava S, Fristensky B, Kav N. N. V (2004). Constitutive expression of a PR10 protein enhances the germination of Brassica napus under saline conditions. Plant Cell Physiology 45: 1320-1324.
Vierling E (1991). The role of heat shock protein in plants. Annual review plant physiol Plant Mol Biol 42: 579-620.
Vincent D, Lapierre C, Pollet B, Cornic G, Negroni L, Zivy M (2005). Water deficits affect caffeate o-methyltransferase, lignification, and related enzymes in maize leaves Plant Physiology 137: 949-960.
Yamaguchi- Shinoazkil K, Kasugal M, Liu Q, Nakadhima K, Saluma Y, Abe H, Shinwari Z, Seki M and shinozaki K (2002). Bioligical mechanisms of drought stress response. JIFCAS Working Report. Pp, 1-8.
Yoshida T, Fujita Y, Sayama H, Kidokoro S, Maruyama K, Mizoi J, Shinozaki K, Yamaguchi-Shinozaki K (2010). AREB1, AREB2, and ABF3 are mastertranscription factors that cooperatively regulate ABRE-dependent ABA signaling involved in drought stress tolerance and require ABA for full activation. Plant journal 61: 672-685.
Zhu J. K (2001). Plant salt tolerance. Plant Science. 6: 66-71.
 
 
 
Agricultural Biotechnology Journal
Volume 5, Issue 2 - Serial Number 2
September 2013
Pages 87-100

Files

Share

How to cite

Statistics