Document Type : Research Paper
Authors
Abstract
Keywords
جایگاه تاکسونومیکی جدایه های ایرانی ویروس موزائیک خیار از استان های کرمان و یزد
محمد مداحیان1، حسین معصومی*2، جهانگیر حیدرنژاد2، اکبر حسینی پور2
1دانشجوی سابق کارشناسی ارشد بیماری شناسی گیاهی، دانشکده کشاورزی، دانشگاه شهید باهنر کرمان.
2دانشیار بخش گیاهپزشکی، دانشکده کشاورزی، دانشگاه شهید باهنر کرمان.
تاریخ دریافت: 13/3/1391، تاریخ پذیرش: 22/5/1391
چکیده
ویروس موزائیک خیار (CMV Cucumber mosaic virus,) یکی از ویروس های مهم کدوئیان در نقاط مختلف دنیاست. به منظور شناسایی و تعیین جایگاه تکاملی جدایههای این ویروس، تعدادی نمونه از استانهای کرمان و یزد جمعآوری گردید. آلودگی به CMV در این نمونهها توسط آزمون DAS-ELISA مورد بررسی قرار گرفت. بر اساس گیاه میزبان و مناطق نمونهبرداری، از نمونه های آلوده شش جدایه متفاوت، جهت مطالعات مولکولی انتخاب گردیدند. با استفاده از آزمون RT-PCR و آغازگرهای اختصاصی، یک قطعه 946 جفت بازی در برگیرنده ژن پروتئین پوششی، تکثیر، همسانه سازی و تعیین ترادف گردید. قطعات همسانه سازی شده جهت تعیین جایگاه تکاملی جدایههای ایرانی با ترادف های مشابه مربوط به سایر جدایه های CMV موجود در بانک ژن مقایسه شدند. آنالیز فیلوژنتیکی نشان داد که جدایههای بررسی شده در دو زیر گروه I و II قرار میگیرند که زیر گروه I نیز به دو زیر گروه IA وIB تقسیم میگردد. دو جدایه ایرانی CMV در زیر گروه IA و چهار جدایه دیگر در زیر گروه IB واقع گردیدند. بیشترین میزان تشابه ترادف نوکلئوتیدی در بین جدایههای ایرانی به میزان 1/99% دربین دو جدایه Ker.Ker.Pep و Ker.Ker.Mel.2 از زیر گروه IB و کمترین میزان تشابه به میزان 1/92% بین دو جدایه Ker.Jir.Cu از زیر گروه IA و Yaz.Yaz.Tom از زیر گروه IB تعیین گردید. جدایههای زیر گروه IB اختصاص به کشورهای شرق آسیا داشته و این بررسی اولین گزارش از وجود تعدادی ازجدایههای CMV مربوط به زیر گروه IB از ایران و خاورمیانه میباشد.
واژه های کلیدی: فیلوژنی، پروتئین پوششی، ویروس موزائیک خیار.
مقدمه
ویروس موزاییک خیار (Cucumber mosaic virus) دارای میزبانهای گیاهی متعدد و متنوعی است که با بیش از 60 گونه شته به طریقه ناپایا منتقل می گردد (Palukaitis & Garcia-Arenal, 2003). این ویروس باعث بروز اپیدمی های خطرناک از جمله نکروز حاد و نابود کننده گوجه فرنگی در ایتالیا، اسپانیا و ژاپن و موزاییک حبوبات در جنوب شرقی ایالات متحده، موزاییک خربزه در کالیفرنیاشده است (Zhang, 2005 ).
ویروس موزاییک خیار (CMV) از جنس کوکومو ویروس (Cucumovirus) وخانواده بروموویریده (Bromoviridae) می باشد (Arenal et al., 2000.). ژنوم ویروس از سه قطعه RNA شامل RNA-1 ، RNA-2 و RNA-3 تشکیل شده و حداقل دارای یک آر.ان.ای زیر ژنومی RNA4)) نیز می باشد که از ناحیه َ3 RNA-3 نسخه برداری میگردند. RNA-1 پروتئین 1a، RNA-2 پروتئین های 2a و 2b و RNA-3 پروتئین پوششی (coat protein, CP) و پروتئین حرکتی (movement protein, MP) را رمز می نمایند. پروتئین 1a جزئی از آنزیم رپلیکاز است، پروتئین2a به عنوان یک RNA dependent RNA polymerase (RdRp) عمل کرده و در همانند سازی ویروس دخالت دارد. پروتئین2b چندین وظیفه دارد از جمله به عنوان بازدارنده خاموشی ژن پس از ترجمه در برابر سیستم دفاعی میزبان عمل می نماید. MP نقش اساسی در حرکت ویروس در گیاه دارد و CP علاوه بر اینکه یکی از اجزاء پیکره های ویروس میباشد در بیان علائم، انتقال توسط شته و کمک به حرکت سلول به سلول در گیاه و انتقال در مسافتهای طولانی نیز نقش دارد (Palukaitis & Garcia-Arenal, 2003). نژادهای CMV در مواردی از قبیل انتقال با ناقل، علائم ایجاد شده در گیاهان آزمون و میزبان طبیعی، خواص سرولوژی و ژنتیکی با یکدیگر متفاوت میباشند. روشهای مختلفی جهت بررسی تنوع در بین جدایه های این ویروس از قبییل تعیین نقوش پپتیدی پروتئین پوششی (Palukaitis et al., 1992)، بررسی های سرولوژیکی (Wahyuni et al., 1992)، هیبریداسیون اسید نوکلئیک (Owen & Palukaitis, 1988) وتعیین ترادف اسیدهای نوکلئیک و اسیدهای آمینه (Palukaitis & Garcia-Arenal, 2003) مورد استفاده قرار گرقتهاند. از نظر فیلوژنتیکی جدایه های این ویروس بر اساس توالی ژن پروتئین پوششی به دو گروه I و II تقسیم می شوند که گروه I نیز به دو زیر گروه IA و IB تقسیم می گردد (Palukaitis & Garcia-Arenal, 2003; Rizos et al., 1992).
در ایران بررسی های مولکولی محدودی در مورد جدایه های ایرانی CMV صورت گرفته است. رسول پور و ایزدپناه دو جدایه این ویروس را از استان های اصفهان و فارس مورد بررسی قرار دادند (Rasoulpour & Izadpanah, 2008). همچنین (2006 & 2008)Bashir et al., برخی از جدایههای ایرانی CMV را از مناطق شمال و شمال غربی کشور و (2009)Golnaz et al., جدایه های CMV از استان خراسان رضوی را از نظر مولکولی طبقه بندی نمودند. با توجه به اهمیت CMV و از آنجائیکه تاکنون در مورد وضعیت مولکولی جدایههای این ویروس در استان های کرمان و یزد مطالعهای صورت نگرفته است، لذا هدف از انجام این تحقیق بررسی خصوصیات مولکولی تعدادی از جدایههای این ویروس در استان های کرمان و یزد می باشد.
مواد و روشها
طی سالهای 1387 الی 1389 از مزارع و گلخانههای گوجه فرنگی و کدوئیان استان یزد شامل مناطق: شمسی آباد، عسکر آباد، محسن آباد و خضر آباد شهر یزد و شهرستان تفت و تفت-محمد آباد و مزارع و گلخانههای فلفل و کدوئیان استان کرمان شامل شهرهای کرمان، بافت، جیرفت و عنبر آباد نمونه برداری به عمل آمد. از گیاهان با علائم مختلف ویروسی از قبیل موزائیک، بندکفشی شدن، زردی، کوتولگی، شکستگی رنگ برگها، رگبرگ نواری، تاولی شدن برگها و میوهها و بدشکلی شدید برگها نمونه برداری گردید و سپس به آزمایشگاه منتقل شدند.
به منظور شناسایی ویروس های آلوده کننده گیاهان نمونه برداری شده از آزمون ساندویچ دوطرفه الایزا به روش کلارک و آدامز (Clark & Adams 1977) و با استفاده از آنتیسرم چند همسانهای CMV، Zucchini Yellow Mosaic Virus (ZYMV)، Squash mosaic virus (SqMV)، Cucumber green mottle mosaic virus (CGMMV)، Watermelon mosaic virus (WMV) و Papaya Ring Spot Virus (PRSV) تهیه شده از موسسه DSMZ کشور آلمان استفاده گردید. سپس نتایج با استفاده از دستگاه الایزا خوان مدل (Biotek Instrument) EL800 در طول موج 405 نانومتر مورد ارزیابی قرار گرفتند.
استخراج RNA از نمونه های آلوده با استفاده از کیت High Pure Viral Nucleic Acids Kit (شرکت Roche کشور آلمان) طبق دستورالعمل شرکت سازنده انجام گردید. آر ان ای استخراج شده جهت واکنش نسجه برداری معکوس (Reverse transcription, RT) با آنزیم M-MLV reverse transcriptase شرکت Fermentas وآغاز گر پس سوی R-DAG: 5'- GACTGACCATTTTAGCCG- 3' طراحی شده توسط (1999)Seung et al., استفاده شد. جهت انجام واکنش RT و ساخت دی.ان.ای مکمل 5/2 میکرولیتر آر.ان.ای کل، 5/2 میکرولیتر آغازگر پسسو (10μM) و 5/8 میکرولیتر آب دیونیزه استریل به لوله ها اضافه و پس از 1 دقیقه در دمای C°95، بلافاصله بر روی یخ قرار داده شد. سپس مقدار چهار میکرولیتر بافر RT (5x)، دو میکرولیتر مخلوط دئوکسی ریبونوکلوتید تری فسفات (dNTPs, 10μM)، 5/0 میکرولیتر آنزیم نسخه برداری معکوس (M-MuLV) (µL/200U)، 5/0 میکرولیتر بازدارنده RNase (µL/10U) به لولهها اضافه و به مدت 45 دقیقه در دمای ºC42 قرار داده شدند. توقف واکنش با قرار دادن مخلوط به مدت 15 دقیقه در دمای ºC72 انجام گرفت. جهت تکثیر ژن پروتئین پوششی جدایههای CMV مورد مطالعه در این تحقیق و انجام آزمون RT-PCR به ترتیب از آغازگرهای همسو (F-DAG: 5'-TAGTTTTGAGGTTCAATTCC - 3') و پسسوی (R-DAG: 5'- GACTGACCATTTTAGCCG- 3') بر اساس مقاله (1999)Seung et al., استفاده گردید. مراحل پی سی آر شامل یک مرحله واسرشت سازی اولیه به مدت چهار دقیقه در دمای ºC94، 35 چرخه شامل مرحله واسرشت سازی در دمای ºC94 به مدت یک دقیقه، مرحله اتصال در ºC 56 به مدت 30 ثانیه، مرحله گسترش در دمای ºC 72 به مدت یک دقیقه و مرحله گسترش نهایی به مدت 10 دقیقه در دمای ºC 72 صورت گرفت. در نهایت محصولات PCR به دست آمده، در ژل آگاروز یک در صد الکتروفورز گردیدند.
قطعات تکثیر شده توسط آغازگرهای اختصاصی F-DAG وR-DAG در واکنش RT-PCR با استفاده از کیت (InsTA cloneTM PCR Cloning Kit) در پلاسمید pTZ57R/T، سویه JM 107 باکتری Escherichia coli همسانه سازی گردیدند. پلاسمیدهای نوترکیب پس از استخراج به وسیله آغازگرهای عمومی M13F و M13R توسط شرکت ماکروژن کشور کره جنوبی از هر دو سمت تعیین ترادف شدند. جهت جستجوی ترادفهای مشابه در بانک ژن از نرمافزار بلاست استفاده گردید و ترادفهای مشابه مورد بررسی و مقایسه قرار گرفتند. همردیف سازی چندگانه (multiple sequence alignment) با برنامه Clustal X (1997 .Thompson et al) انجام و فایل های همردیف سازی شده حاصل از این برنامه در نرم افزار MEGA 4 برای ترسیم درخت فیلوژنتیکی به روش Neighbor-Joining استفاده گردیدند. همچنین جهت بررسی میزان همولوژی جدایه های مورد بررسی در این تحقیق و دیگر جدایه های CMV از نرم افزار DNAMAN Version 4.02 استفاده گردید.
نتایج و بحث
شناسایی جدایه های CMV
بر اساس نتایج بدست آمده از آزمون DAS-ELISA از مجموع 390 نمونه جمع آوری شده از گیاهان کدو، فلفل، گوجه فرنگی، خیار، هندوانه، طالبی و خربزه از استان های کرمان و یزد 28 نمونه آلودگی به ویروس CMV را نشان دادند (جدول 1). علائم CMV بر روی گیاهان خانواده کدوئیان عمدتا شامل تاولی شدن برگها، بدشکلی شدید برگ و میوه و موزائیک شدید بودند. در دو جدایه گیاه فلفل و گوجه فرنگی نیز علائمی مانند رگبرگ روشنی، ماتل، بدشکلی و باریک شدن برگها مشاهده گردید. از بین نمونه های دارای آلودگی به ویروس CMV شش نمونه جدا شده از گیاهان فلفل (Ker.Ker.Pep)، خیار (Ker.Jir.Cu) و دو نمونه خربزه (Ker.Ker.Mel.1 و Ker.Ker.Mel.2) از استان کرمان و دو نمونه گوجه فرنگی (Yaz.Yaz.Tom) و کدو (Yaz.Sha.Cu) از استان یزد جهت مطالعات مولکولی انتخاب گردیدند (جدول 2). همچنین 105 نمونه آلودگی به ویروس موزائیک زردکدو (ZYMV)، 69 نمونه آلوده به ویروس موزائیک هندوانه (WMV)، 4 نمونه آلوده به ویروس موزائیک کدو (SqMV) و 1 نمونه آلودگی به ویروس لکه حلقوی پاپایا (PRSV) را نشان دادند. در ضمن آلودگی مزارع نسبت به ویروس موزائیک سبز خیار (CGMMV) مشاهده نگردید. علاوه براین، برخی از نمونه ها آلودگی توأم بصورت دوتائی (WMV+CMV و WMV+ZYMV) و سه تایی (CMV + WMV + PRSV) را نشان دادند. در مواردی که یک گیاه آلوده به دو یا چند ویروس بوده، این مسئله موجب اثر تشدید کنندگی ویروس ها بر روی یکدیگر گردیده و در نتیجه علائم ویروسی به نحو چشمگیری افزایش می یابند. همچنین تعدادی از نمونه ها دارای علائم ویروسی بودند که نسبت به هیچ کدام از آنتی سرم های مورد استفاده واکنش نشان ندادند که این نمونه احتمالا می توانند به دیگر ویروس های کدوئیان نظیر Cucurbit aphid-borne yellows virus (CABYV)، Cucumber yellow stunting disorder virus (CYSDV)، Watermelon chlorotic stunt virus (WcSV) و Tomato leaf curl Palampur virus (ToLCPMV) آلوده باشند. ویروس های WMV، ZYMV، CMV و CABYV شایع ترین ویروس های آلوده کننده کدوئیان در ایرن می باشند و نتایج به دست آمده در این تحقیق با دیگر نتایج گزارش شده از ایران در مورد شیوع ویروس های آلوده کننده بر روی کدوئیان مطابقت دارد (Massumi et al., 2007; Bananej & Vahdat, 2008).
تکثیر و همسانه سازی ژن پروتئین پوششی
با استفاده از آغازگرهای اختصاصی، گزارش شده توسط (1999)Seung et al., ، ژن پروتئین پوششی، جدایه های ایرانی CMV مورد مطالعه در این تحقیق در آزمون RT-PCR قطعه ای به طول 946 جفت باز حاوی طول کامل ژن CP و نواحی غیر قابل ترجمه '3 و '5 در دو انتهای این ژن تکثیر گردید (شکل 1). تعیین ترادف محصولات همسانه سازی شده پس از حذف نوکلئوتیدهای اضافی نشان داد که طول ژن CP در جدایههای تعیین توالی شده در این تحقیق 657 نوکلئوتید می باشد (شکل 2).
مطالعات فیلوژنتیکی
جهت تعیین جایگاه فیلوژنتیکی جدایههای مورد بررسی CMV در این تحقیق، جدایههای مذکور به همراه 56 جدایه گزارش شده موجود در بانک ژن مورد بررسی قرار گرفتند (جدول 3). بر اساس درخت تبارزایی رسم شده بر پایه ترادف نوکلئوتیدی و اسیدهای آمینه ژن پروتئین پوششی، جدایههای CMV در دو زیر گروه I و II قرار گرفتند. که گروه I خود نیز به دو زیر گروه IAو IB تقسیم شد.
|
جدول 1- گیاهان، مناطق نمونه برداری و میزان آلودگی نسبت به ویروس موزائیک خیار. Table 1- The locations, sample plants and rate of infection of Cucumber mosaic virus. |
||
|
میزان آلودگی Infection rate |
میزبان Host |
منطقه نمونه برداری Region |
|
0/11 |
کدو-Cucurbita pepo |
کرمان-Kerman |
|
1/9 |
فلفل-Capsicum annum |
کرمان-Kerman |
|
2/15 |
خربزه-Cucumis melo.var.indorus |
کرمان-Kerman |
|
0/19 |
کدو-Cucurbita pepo |
بافت-Baft |
|
0/4 |
هندوانه-Citrullus vulgaris |
جیرفت-Jiroft |
|
7/21 |
خیار-Cucumis sativus |
جیرفت-Jiroft |
|
0/4 |
هندوانه-Citrullus vulgaris |
جیرفت-Jiroft |
|
0/6 |
طالبی- Cucumis melo.var. cantalupensis |
جیرفت-Jiroft |
|
0/2 |
طالبی- Cucumis melo.var. cantalupensis |
عنبر آباد-Anbaraabad |
|
0/12 |
کدو-Cucurbita pepo |
عنبر آباد-Anbaraabad |
|
8/30 |
کدو-Cucurbita pepo |
تفت- محمد آباد-Taft-Mohammad aabad |
|
1/12 |
گوجه فرنگی-Solanum lycopersicon |
تفت-Taft |
|
0/4 |
خیار-Cucumis sativus |
تفت- محمد آباد-Taft-Mohammad aabad |
|
5/41 |
کدو-Cucurbita pepo |
یزد- عسگر آباد-Yazd-Askaraabad |
|
1/4 |
خیار-Cucumis sativus |
یزد- عسگر آباد-Yazd-Askaraabad |
|
0/35 |
هندوانه-Citrullus vulgaris |
یزد- عسگر آباد-Yazd-Askaraabad |
|
1/18 |
کدو-Cucurbita pepo |
یزد- محسن آباد-Yazd-Mohsenaabad |
|
0/22 |
هندوانه-Citrullus vulgaris |
یزد- محسن آباد-Yazd-Mohsenaabad |
|
0/20 |
کدو-Cucurbita pepo |
یزد- خضرآباد- Yazd-Khezraabad |
|
0/18 |
کدو-Cucurbita pepo |
یزد- شمسی آباد- Yazd-Shamsiaabad |
|
2/73 |
خربزه-Cucumis melo.var.indorus |
یزد- شمسی آباد- Yazd-Shamsiaabad |
|
28/390 |
Total-جمع کل |
|
|
جدول 2- محل جغرافیایی، گیاه میزبان و رس شمارههای شش جدایه ی تعیین ترادف شده در این پژوهش. Table 2- Geographical origin, host plant and accession number of the six sequenced isolates in this study. |
|||
|
شماره ثبت در بانک ژن Accession number |
میزبان Host |
محل جمع آوری Collecting region |
نام جدایه Isolate name |
|
JX112018 |
خیار Cucumis sativus |
جیرفت Jiroft |
Ker.Jir.Cu |
|
JX112021 |
فلفل Capsicum annum |
کرمان Kerman |
Ker.Ker.Pep |
|
JX112019 |
خربزه Cucumis melo.var.indorus |
کرمان Kerman |
Ker.Ker.Mel.1 |
|
JX112020 |
خربزه Cucumis melo.var.indorus |
کرمان Kerman |
Ker.Ker.Mel.2 |
|
JX112022 |
کدو Cucurbita pepo |
یزد Yazd |
Yaz.Sha.Cu |
|
JX112023 |
گوجه فرنگی Solanum lycopersicon |
یزد Yazd |
Yaz.Yaz.Tom |
شکل 1- الکتروفورز محصول PCR تکثیر شده با استفاده از آغازگرهای اختصاصی R-DAG/F-DAG و تشکیل باند 946 جفت بازی مربوط به ژن پروتئین پوششی جدایه های ایرانی CMV درون ژل آگاروز1%. M) نشانگر اندازهDNA (Gene Ruler™1Kb DNA Ladder, Fermentase). 1) جدایه Ker.Jir.Cu. متعلق به زیر گروه IA. 2) جدایه Yaz.Yaz.Tom متعلق به زیر گروه IB.
Figure 1- Electrophoresis of the RT-PCR products using specific primers of R-DAG/F-DAG showing amplification of 946 bp segment of coat protein gene of Iranian Cucumber mosaic virus isolates. Lane M, 1-kb DNA ladder. lane 1, Ker.Jir.Cu isolate belonged to IA subgroup. lane 2, Yaz.Yaz.Tom isolate belonged to IB subgroup.
شکل 2 - الکتروفورز پلاسمید نوترکیب حاوی قطعه ژن پروتئین پوششی جدایه های ایرانی TAV هضم شده با آنزیم های EcoR1 و Pst1 درون ژل آگاروز1%. (M نشانگر اندازه 1Kb DNA Ladder, Fermentase) DNA (Gen RulerTM. 1) جدایه Ker.Jir.Cu. متعلق به زیر گروه IA. 2) جدایه Yaz.Yaz.Tom متعلق به زیر گروه IB.
Figure 2-B - Recombinant plasmids comprising coat protein gene of Iranian isolates of Cucumber mosaic virus digested with EcoR1 and Pst1 restriction enzymes. Lane 1, Ker.Jir.Cu isolate belonged to IA subgroup. Lane 2, Yaz.Yaz.Tom isolate belonged to IB subgroup.
بر این اساس جدایه های Ker.Jir.Cu و Yaz.Sha.Cu به همراه چهارده جدایه دیگر گزارش شده از ایران (Bashir et al., 2006 & 2008; Rasoulpour & Izadpanah, 2008) و تعدادی از جدایههای گزارش شده از کشورهای مختلف دنیا از قبیل Y، N، O، CH و CMV-ON از ژاپن، Lucknow از هند، Fny و C از آمریکا و دو جدایه از کشور برزیل در زیر گروه IA قرار میگیرند (شکل 3 و 4). چهار جدایه دیگر شامل جدایه های Ker.Ker.Pep، Ker.Ker.Mel.1، Ker.Ker.Mel.2 و Yaz.Yaz.Tom به ترتیب جدا شده از گیاهان خربزه، گوجه فرنگی و فلفل جمع آوری شده از شهرهای کرمان و یزد در زیر گروه IB به همراه جدایه های PE، SD و X65017.1 از چین، ABI و As از کره جنوبی، NT9 از تایوان، C7-2 و K از ژاپن، 2A1-A و Ixora از آمریکا)، Tfn از ایتالیا و جدایه های B2، J&K، DQ285569، AF350450.1 و X89652.1 از هند قرار گرفتند (شکل 3 و 4). گروه II نیز شامل جدایه هایی از کشورهای ژاپن، آمریکا، استرالیا، مجارستان، ایران و انگلستان میباشد. ضمنا هیچ کدام از جدایههای ایرانی مورد بررسی دراین تحقیق در زیر گروه II قرار نگرفتند.
شکل 3- درخت فیلوژنتیکی رسم شده بر اساس روش neighbor-joining با استفاده از نرم افزار MEGA 4 بر پایه ترادف نوکلئوتیدی ژن پروتئین پوششی جدایه های ایرانی ویروس CMV و سایر جدایه های موجود در بانک ژن. جدایه های ایرانی مورد بررسی در این تحقیق به صورت Bold نشان داده شدهاند. جدا یه ای از TAV به نام AJ237849.2 و جدایه ای از PSV به نام NC_002040 به عنوان Outgroup انتخاب گردیده اند.
Figure 3- neighbor-joining tree illustrating the phylogenetic relationships between the Iranian and other published Cucumber mosaic virus isolates. The tree was constructed using the 657 bp of coat protein sequences. Multiple sequence alignments were generated with MEGA software (Version 4). The Iranian isolates investigated in this study are shown in bold. Tomato aspermy virus (TAV) and Peanut stunt virus (PSV) were selected as outgroup.
شکل 4- درخت فیلوژنتیکی رسم شده بر اساس روش neighbor-joining با استفاده از نرم افزار MEGA 4 بر پایه ترادف اسیدهای آمینه پروتئین پوششی جدایه های ایرانی ویروس CMV و سایر جدایه های موجود در بانک ژن. جدایه های ایرانی مورد بررسی در این تحقیق به صورت Bold نشان داده شدهاند. جدا یه ای از TAV به نام AJ237849.2 و جدایه ای از PSV به نام NC_002040 به عنوان Outgroup انتخاب گردیده اند.
Figure 4- Neighbor-joining tree illustrating the phylogenetic relationships between the Iranian and other published Cucumber mosaic virus isolates. The tree was constructed using the coat protein amino acid sequences. Multiple sequence alignments were generated with MEGA software (Version 4). The Iranian isolates investigated in this study are shown in bold. Tomato aspermy virus (TAV) and Peanut stunt virus (PSV) were selected as outgroup.
|
جدول 3- جدایه های مورد بررسی ویروس موزائیک خیار موجود در بانک ژن جهت مقایسه و رسم دندروگرام و تعیین جایگاه فیلوژنتیکی جدایه های ایرانی این ویروس. Table 3- GenBank accession number and origin of several CMV isolates used for phylogenetic analysis. |
|||
|
زیر گروه Subgroup |
کشور country |
جدایه Isolate |
رس شماره Accession number |
|
IA |
ایران - Iran |
Ker.Jir.Cu |
JX112018 |
|
IA |
ایران - Iran |
Yaz.Sha.Cu |
JX112022 |
|
IA |
ژاپن - Japan |
CH |
AB261174.1 |
|
IA |
برزیل - Brazil |
- |
AY380812.1 |
|
IA |
ژاپنJapan - |
O |
D00385 |
|
IA |
آمریکا - USA |
C |
D00462 |
|
IA |
آمریکا - USA |
Fny |
D10538 |
|
IA |
ژاپن - Japan |
Y |
D12499 |
|
IA |
ژاپن - Japan |
N |
D28486 |
|
IA |
هند - India |
Lucknow |
DQ295914.1 |
|
IA |
ایران - Iran |
CMV-Cu |
EF620777.1 |
|
IA |
ایران - Iran |
S337 |
AY871069.1 |
|
IA |
ایران - Iran |
B13 |
AY871070.1 |
|
IA |
ایران - Iran |
B23 |
AY871071.1 |
|
IA |
ایران - Iran |
DI1 |
DQ002876.1 |
|
IA |
ایران - Iran |
DI2 |
DQ002877.1 |
|
IA |
ایران - Iran |
DI3 |
DQ002879 |
|
IA |
ایران - Iran |
GI1 |
DQ002885.1 |
|
IA |
ایران - Iran |
SH17 |
AY871068.1 |
|
IA |
ایران - Iran |
EI1 |
DQ002880.1 |
|
IA |
ایران - Iran |
EI2 |
DQ002881.1 |
|
IA |
ایران - Iran |
EI3 |
DQ002882.1 |
|
IA |
ایران - Iran |
FI3 |
DQ002883.1 |
|
IA |
برزیل - Brazil |
- |
AY380533.1 |
|
IA |
ژاپن - Japan |
CMV-ON |
AB248752 |
|
IB |
ایران - Iran |
Yaz.Yaz.Tom |
JX112023 |
|
IB |
ایران - Iran |
Ker.Ker.Mel.1 |
JX112019 |
|
IB |
ایران - Iran |
Ker.Ker.Pep |
JX112021 |
|
IB |
ایران - Iran |
Ker.Ker.Mel.2 |
JX112020 |
|
IB |
چین - China |
SD |
AB008777.1 |
|
IB |
هند - India |
- |
DQ285569 |
|
IB |
هند - India |
J&K |
EF153737.1 |
|
IB |
هند - India |
B2 |
AB069971.1 |
|
IB |
چین - China |
PE |
AF268597.1 |
|
IB |
کره جنوبی South Korea |
As |
AF013291.1 |
|
IB |
تایوان - Taiwan |
NT9 |
D28780.1 |
|
IB |
ژاپن - Japan |
C7-2 |
D42079.1 |
|
IB |
ژاپن - Japan |
K |
AF127977.1 |
|
IB |
کره جنوبی South Korea |
ABI |
L36525.1 |
|
IB |
چین - China |
- |
X65017.1 |
|
IB |
هند - India |
- |
AF350450.1 |
|
IB |
آمریکا - USA |
2A1-A |
AJ271416.1 |
|
IB |
آمریکا - USA |
Ixora |
U20219.1 |
|
IB |
ایتالیا - Italy |
Tfn |
Y16926.1 |
|
IB |
هند - India |
- |
X89652.1 |
|
II |
ژاپن - Japan |
CMV-MT |
AB189917.1 |
|
II |
ژاپن - Japan |
PF |
AB368501.1 |
|
II |
آمریکا - USA |
LS |
AF127976 |
|
II |
استرالیا - Australia |
LY |
AF198103 |
|
II |
آمریکا - USA |
WL |
D00463 |
|
II |
مجارستان-Hungary |
Trk7 |
L15336 |
|
II |
استرالیا - Australia |
Q |
M21464 |
|
II |
انگلستان - England |
Kin |
Z12818 |
|
II |
ایران - Iran |
LD |
EF050074.1 |
چهار جدایه ایرانی تشابه بالای ترادف نوکلئوتیدی و اسیدهای آمینه به ترتیب به میزان 9/97 تا 1/99 و 2/97 تا 5/99 درصد با یکدیگر داشتند (جدول 4) و بر اساس درخت فیلوژنی رسم شده نیز جدایههای ایرانی به صورت یک زیر شاخه از دیگر جدایههای موجود در زیر گروه IB مجزا شدند. بیشترین میزان تشابه ترادف نوکلئوتیدی در بین جدایه های ایرانی مورد بررسی در این تحقیق واقع در دو زیر گروه ( IAو IB) بین جدایه های Ker.Ker.Pep از زیرگروه IB و Yaz.Sha.Cu از زیرگروه IA به میزان 5/94 در صد و کمترین میزان تشابه به میزان 1/92 درصد بین جدایه های Ker.Jir.Cu از زیرگروه IA و Yaz.Yaz.Tom از زیرگروه IB بود (جدول 4). در بین تمامی نمونه های مورد بررسی، بیشترین درصد تشابه ترادف نوکلئوتیدی و اسیدهای آمینه به ترتیب به میزان 8/99 و 100 درصد مربوط به جدایه ایرانی Yaz.Sha.Cu و جدایه Fny (از کشور آمریکا) میباشند. جدایه EI1 از ایران و جدایه CH (از ژاپن) نیز مشابهتی به میزان 100 درصد از نظرترادف اسیدهای آمینه با جدایه Ker.Jir.Cu داشتند. در زیر گروه IB جدایه ایرانی Yaz.Yaz.Tom دارای تشابه بالای ترادف نوکلئوتیدی به میزان 3/97 درصد با جدایه J&K گزارش شده از کشور هند بود.
جدایههای مختلف CMV که از نقاط مختلف دنیا گزارش گردیدهاند از نظر خصوصیات بیولوژیکی، سرولوژیکی و فیزیکوشیمیایی متفاوت هستند (Palukaitis & Garcia-Arenal, 2003). جدایههای CMV بر پایه خصوصیات سرولوژی، هیبریداسیون اسید نوکلئیک، ترادف نوکلئوتیدی ژن پروتئین پوششی و RFLP در دو زیر گروه I و II قرار می گیرند. جدایه های زیر گروه I نیز بر پایه ترادف نوکلئوتیدی ژن پروتئین پوششی و روابط فیلوژنتیکی به دو زیر گروه IA و IB تقسیم بندی میگردند (Palukaitis & Zaitlin, 1997; Roossinck, 2002). بر اساس مطالعات انجام شده بر روی جدایههای CMV در دنیا میزان مشابهت ترادف نوکلئوتیدی ژن پروتئین پوششی در بین جدایههای واقع در دو زیر گروه I و II به ترتیب بالاتر از 88 و 96 درصد میباشد. همچنین درصد تشابه در بین گونههای مربوط به دو زیر گروه I و II حدود 69 تا 77 درصد بوده است. لذا این موضوع بیانگر آن است که ناهمگونی (Heterogenecity) بالایی در بین جدایههای CMV وجود دارد (Roossinck, 2002). بر این اساس درصد تشابه ترادف نوکلئوتیدی جدایههای ایرانی مورد بررسی در این تحقیق با جدایههای زیر گروه II به میزان 1/76-3/78% و موقعیت این جدایه ها در درخت تبارزایی نشان دهنده تعلق این جدایه ها به زیر گروه I میباشد. بشیر و همکاران بر اساس ترادف نوکلئوتیدی ژن CP و RFLP، جدایههای ایرانی CMV را در دو زیر گروه IA و II قراردادند و هیچ کدام از جدایهها در زیر گروه IB قرار نگرفتند (Bashir et al., 2006 & 2008). بر پایه درخت تبارزایی رسم شده توسط رسول پور و ایزدپناه نیز جدایههای ایرانی CMV در زیر گروه IA و یک جدایه در زیر گروه II قرار میگیرند (Rasoulpour & Izadpanah, 2008). در این تحقیق نیز دو جدایه Ker.Jir.Cu و Yaz.Sha.Cu در درخت تبارزایی رسم شده در کنار جدایه های EI1، DI1، GI1، CMV-CU گزارش شده از ایران و جدایه CH گزارش شده از کشور ژاپن و Fny از کشور آمریکا در زیر گروه IA قرار گرفتند.
جدول 4- میزان تشابه ترادف نوکلئوتیدی (پایین-چپ) و اسیدهای آمینه (بالا-راست) جدایه های ایرانی CMV مورد بررسی در این تحقیق و دیگر جدایه های ایرانی CMV موجود در بانک ژن.
Table 4- Percentage of nucleotide (Down-Left) and amino acid (Up-Right) sequence identity of Iranian CMV isolates investigated in this study and other Iranian CMV isolates of GenBank.
جدایههای مربوط به زیر گروه IA و II در تمام دنیا یافت میگردند و گروه بندی آن ها به ناحیه جغرافیایی ارتباطی ندارد، در حالیکه اکثر جدایه های زیر گروه IB از شرق آسیا گزارش گردیده اند و تنها یک جدایه مربوط به کشور ایتالیا و دو جدایه از کشور آمریکا در زیر گروه IB واقع گردیدهاند (Gallitelli, 2000; Lin et al., 2003; Ng et al., 2000). (2010)Dubey et al., و (2004)Srivastava & Raj تمامی جدایه های گزارش شده از کشور هند (به جز جدایه Lucknow) به همراه تعدادی از جدایه های گزارش شده از کشورهای شرق و جنوب شرقی آسیا مانند چین، کره جنوبی، تایوان، اندونزی و ژاپن در زیر گروه IB قرار می گیرند. این در حالی است که چهار جدایه ایرانی Ker.Ker.Pep، Ker.Ker.Mel.1، Ker.Ker.Mel.2 و Yaz.Yaz.Tom به همراه جدایههای گزارش شده از شرق آسیا نیز در این زیر گروه واقع گردیدند. بر این اساس در صد میزان همولوژی بالای چهار جدایه ایرانی با یکدیگر در مقایسه با سایر جدایه های زیر گروه IB و مجزا شدن این جدایه ها به صورت یک زیر شاخه و وجود در یک مکان جغرافیایی جدید (کشور ایران) میتواند نشان دهنده یک منشاء مشترک بین این جدایهها باشد. این نتایج بر اساس اطلاعات مربوط به ترادف نوکلئوتیدی و اسیدهای آمینه ژن پروتئین پوششی میباشد و تحقیقات بیشتری جهت مطالعه قسمت های دیگر ژنوم این جدایهها و سایرجدایههای منطقه لازم میباشد. بیش از 80 درصد جدایههای گزارش شده CMV از مناطق مختلف دنیا و از میزبان های متفاوت به زیر گروه I تعلق دارند (Gallitelli, 2000)، لذا نتایج حاصل از این تحقیق و تحقیقات انجام شده گذشته در ایران (Bashir et al., 2006 & 2008; Rasoulpour & Izadpanah, 2008) نشان دهنده گسترش بیشتر جدایه های مربوط به زیر گروه I در کشور ایران میباشد.
تعیین زیر گروههای جدایه های CMV در بررسی اپیدمیولوژی ویروس از اهمیت زیادی برخوردار است (Yu et al., 2005). همچنین ردیابی جدایه های CMV و تشخیص تنوع ژنتیکی آنها یک مرحله موثر در کنترل ویروس به ویژه از طریق مهندسی ژنتیک می باشد (Lin et al., 2003). در این تحقیق شش جدایه از CMV از نظر جایگاه تکاملی در درخت تبارزایی مورد بررسی قرار گرفتند. پیش از این بر اساس مطالعات مولکولی انجام شده بر روی جدایههای ایرانی CMV تمامی جدایهها در دو زیر گروه IA و II قرار گرفتهاند (Bashir et al., 2006; 2008; Rasoupour & Izadpanah, 2008) و در این تحقیق برای نخستین بار چهار جدایه از ایران در زیر گروه IB طبقه بندی گردیدند. جدایههای زیر گروه IB اختصاص به کشورهای شرق آسیا داشته (Gallitelli, 2000) و این بررسی اولین گزارش از وجود جدایههای این زیر گروه از ایران و منطقه خاورمیانه میباشد. ضمنا وجود جدایههای مربوط به هر سه زیر گروه IA، IB و II در ایران نشان دهنده گوناگونی و تنوع ژنتیکی جدایههای CMV در ایران می باشد، لذا تحقیقات بیشتر جهت شناسایی جدایههای بیشتر CMV لازم میباشد.
منابع
Bananej K, Vahdat A (2008) Identification, distribution and incidence of viruses in field-Grown cucurbit crops of Iran. Phytopathologia Mediterranea 47: 247-257.
Bashir NS, Rasaei-Kalhor M, Nourinejhad-Zarghani Sh (2006) Detection, differentiation and phylogenetic analysis of cucumber mosaic virus isolates from cucurbits in the northwest region of Iran. Virus Genes 32: 277-288
Bashir NS, Nematollahi S, Torabi E (2008) Cucumber mosaic virus subgroup IA Frequently occurs in the Iran. Acta Virologica 52: 237–242.
Clark MF, Adams AN (1977) Characteristics of microplates method of enzyme-linked-immunosorbent assay for detection of plant viruses. Journal of General Virology 34: 475-483.
Dubey VK, Aminuddin, Singh VP (2010) Molecular characterization of Cucumber mosaic virus infecting Gladiolus, revealing its phylogeny distinct from the Indian isolate and alike the Fny strain of CMV. Virus Genes 41: 126–134
Gallitelli D (2000) The ecology of cucumber mosaic virus and sustainable agriculture.Virus Research 71: 9–21.
Garcia-Arenal F, Escriu F, Aranda MA, Alonso-Prados JL, Malpica JM, Fraile A (2000) Molecular epidemiology of cucumber mosaic virus and its satellite RNA. Virus Research 71: 1-8.
Golnaz N, Jafarpour B, Rastegar MF, Sabokkhiz MA (2009) Detection of cucumber mosaic virus and typing using serological and molecular methods in Razavi Khorasan province. Pakistan Journal of Biological Sciences 12: 657-659
Lin HX, Rubio L, Smythe A, Jiminez M, Falk BW (2003) Genetic diversity and biological variation among California isolates of Cucumber mosaic virus. Journal of General Virology 84: 249–258.
Massumi H, Shaabanian M, Hosseini Pour A, Heydarnejad J, Rahimian H (2009) Incidence of viruses infecting tomato and their natural hosts in the southeast and central regions of Iran. Plant Disease 93: 67-72.
Ng CK, Liu S, Perry KL (2000) Cucumber MosaicVirus Mutants with Altered Physical Properties and Defective in Aphid Vector Transmission. Virology 276: 395-403.
Owen J, Palukaitis P (1988) Characterization of cucumber mosaic virus. I. Molecular heterogeneity mapping of RNA 3 in eight CMV strains. Virology 166: 495-502
Palukaitis P, Garcia-Arenal F (2003) Cucumoviruses. Advances in Virus Reaearch 62: 241-323
Palukaitis P, Rossinck M J, Ditzgen RG, Francki IB (1992) Cucumber mosaic virus. Advances in Virus Research 414: 281-348.
Palukaitis P, Zaitlin M (1997) Replicase-Mediated Resistance to Plant Virus Disease. Advances in Virus Research 48: 349–377.
Rizos H, Gunn LV, Pares RD, Gillings MR (1992) Journal of General Virology 73: 2099–2103.
Rasoulpour R, Izadpanah K (2008) properties and taxonomic position of hoary cress strain of Cucumber mosaic virus. Journal of Plant Pathology 90: 97-102.
Roossinck MJ (2002) Evolutionary history of cucumber mosaic virus deduced by phylogenetic analyzes. Journal of Virology 76: 3382–3387.
Seung KC, Jang KC, Won MP, Ki HR, (1999) RT-PCR detection and identification of three species of cucumoviuses with a genus – specific single pair of primers. Journal of Virology 83: 67-73.
Srivastava A, Raj SK (2004) High molecular similarity among Indian isolates of Cucumber mosaic virus suggests a common origin. Current Science 87: 1126- 1131.
Thompson JD, Gibson TJ, Plewniak F, Jeanmougin F, Higguns DG (1997) The CLUSTAL_X Windows Interface: Flexible stratgies for Multiple Sequene Alignment Aided by Quality Analysis Tools. Nucleic Acids Research 24: 4876-4882.
Wahyuni WS, Dietzgen RG, Hanada K, Francki RIB (1992) Serological and biological variation between and within subgroup I and II strains of cucumber mosaic virus. Plant Pathology 41: 282-297.
Yu C, Wu J, Zhou X (2005) Detection and sub grouping of Cucumber mosaic virus isolates by TAS-ELISA and immunocapture RT-PCR. Journal of Virological Methods 123: 155–161.
Zhang D (2005) Sequence variability of Cumber mosaic virus (CMV) and its effects on CMV-resistance of capsicum sp. Ph.D. Thesis. Hamburg univesity, Hamburg, Germany.
Phylogenetic analysis of Iranian Cucumber mosaic virus isolates from Kerman and Yazd provinces
Maddahian M1., Massumi H*2., Heydarnejad J2., Hosseini Pour A.2
1 Former MSc. student of Plant Pathology, College of Agriculture, Shahid Bahonar University of Kerman, Kerman, Iran.
2 Department of Plant Protection, College of Agriculture, Shahid Bahonar University of Kerman, Kerman, Iran.
Abstract
Cucumber mosaic virus (CMV) is one of the most important viruses of cucurbits worldwide. To study the phylogenetic relationships of several CMV isolates, a number of samples were collected from Kerman and Yazd provinces. The CMV infection of the samples was tested using DAS-ELISA method. Based on the host and geographical regions, six ELISA positive samples were chosen for molecular characterization. A 946 bp fragment comprising full-length of coat protein gene with its flankes was amplified by RT-PCR using specific primer pairs, cloned and sequenced. Sequence comparisons were done using DNAMAN software on CP gene of Iranian isolates and those of available in GenBank . Phylogenetic analysis showed that CMV isolates were divided into two subgroups I and II in which the subgroup I was further divided into two subgroups of IA and IB. Two Iranian isolates sequenced in the present study were placed in the subgroup IA and the rest of isolates in the subgroup IB . The higest nucleotide sequence identity of 99.1% was obtained for the isolates Ker.Ker.Pep and Ker.Ker.Mel.2 (subgroup IB) while the lowest for the isolates Ker.Jir.Cu isolate (subgroup IA) and the Yaz.Yaz.Tom of 92.1 %. Isolates of subgroup IB belong almost exclusively to East Asia. It is the first report of occurrence of subgroup IB of CMV isolates in Iran and Middle East.
Key words: Phylogeny, Coat protein, Cucumber mosaic virus
)
