بررسی اثرات الیسیتور عصاره مخمر بر بیان ژن ایزوفلاون سینتاز و برخی پارامترهای بیوشیمیایی در گیاهچه­های سویا (Glycine max)

امیر آراسته­فر¹، علی ریاحی مدوار*²، مسعود توحید­فر³، کبری یوسفی¹

¹ دانش­آموخته کارشناسی ارشد رشته بیوتکنولوژی کشاورزی، دانشکده علوم و فناوری­های نوین، دانشگاه تحصیلات تکمیلی صنعتی و فناوری پیشرفته، کرمان، ایران.

² استادیار گروه بیوتکنولوژی، پژوهشکده علوم محیطی، پژوهشگاه علوم و تکنولوژی پیشرفته و علوم محیطی، دانشگاه تحصیلات تکمیلی صنعتی و فناوری پیشرفته، کرمان، ایران^.

³دانشیار پژوهشگاه بیوتکنولوژی کشاورزی ایران، کرج، ایران.

تاریخ دریافت: 8/7/1391، تاریخ پذیرش: 20/8/1391

چکیده

      تا­کنون اثرات عصاره مخمر بر خصوصیات مورفولوژیکی و بیوشیمیایی گیاهان مختلف به طور گسترده مورد مطالعه قرار گرفته است. در این تحقیق، میزان بیان ژن ایزوفلاون سینتاز (IFS)، محتوی فلاونوئیدی و آنتوسیانین و همچنین فعالیت برخی آنزیم­های آنتی اکسیدان در گیاهچه­های 9 روزه سویا تحت تیمار با غلظت­های مختلف (0، 1/0، 2/0 و 5/0 درصد) عصاره مخمر در بازه­های زمانی 8 و 16 ساعت مورد مطالعه قرار گرفت. سویا گیاهی یکساله از خانواده نخود است. دانه­های این گیاه سرشار از ترکیبات ایزوفلاونوئیدی (جنیستئین و دیدزین) می­باشد که از پیش ماده فلاونونی توسط آنزیمIFS  تولید می­شوند. نتایج نشان دهنده افزایش محتوی فلاونوئید­ها و آنتوسیانین و همچنین بیان ژن ایزوفلاون سینتاز و محتوی پروتئین کل گیاهچه­های تیمار شده با این الیسیتور در تمامی غلظت­ها در مقایسه با گیاه شاهد است که در  تیمار بمدت 16 ساعت بیشتر از زمان 8 ساعت می­باشد. از طرف دیگر، فعالیت آنزیم­های آنتی­اکسیدان شامل سوپراکسید دیسموتاز، کاتالاز و پراکسیداز در گیاهان تیمار شده بطور معنی­داری نسبت به گیاه شاهد افزایش یافته است که در تیمار بمدت 8 ساعت در مقایسه با زمان 16 ساعت بیشتر می­باشد. در مجموع چنین استنباط می­شود که عصاره مخمر باعث اعمال نوعی تنش اکسیداتیو در گیاهچه­ها شده است. در این شرایط، بمنظور کاهش رادیکال­های آزاد در زمان 8 ساعت تیمار، سیستم آنتی­اکسیدان آنزیمی فعالتر بوده درحالیکه در زمان 16 ساعت تیمار، بیشتر سیستم آنتی­اکسیدان غیرآنزیمی (فنیل پروپانوئیدی) وارد عمل می­شود. لذا بنظر می­رسد، تیمار گیاه به مدت  16 ساعت با این الیسیتور، زمانی مناسب جهت تحریک بیان ژن­ها و همچنین سنتز مواد موثره می­باشد.

کلمات کلیدی: ایزوفلاونوییدها، ایزوفلاون سینتاز، سویا، عصاره مخمر

مقدمه

       سویا (Glycine max) گیاهی یک­ساله، از خانواده نخود و بومی آسیای شرقی است (PIBA, 2001). این گیاه بوته­ای، بالارونده (مستقیم)، یک­ساله و تابستانه است که ارتفاع آن از 3/0 تا 2/1 متر متغیر می­باشد. برگ­های این گیاه متراکم، متناوب و بیضوی سه برگی است که هر کدام 5-10 سانتی­متر عرض دارند. کولتیوارهای مختلفی از این گیاه وجود دارند که رسیدگی دانه آن­ها تحت شرایط اقلیمی مختلف 75-100 روز می­باشد (Mcgregor et al., 1976).

       ایزوفلاونوییدها ترکیبات فلاونوییدی (از مسیر فنیل پروپانوئیدی) هستند که به­صورت غالب در گیاهان خانواده نخود وجود دارند. ایزوفلاونوییدها و همچنین پیش­سازهای آن­ها می­توانند تحت تاثیر آنزیم­های فرودست به ترکیبات فیتوالکسینی تبدیل شوند. فیتوالکسین­های ایزوفلاونوییدی از جمله عوامل اصلی مقاومت گیاهان به بیماری­های گیاهی و آفات محسوب می­شوند که تولید آن­ها تحت تاثیر محرک­های زنده و غیر زنده قرار می­گیرد. گونه­های مختلف خانواده نخود، ترکیبات فیتوالکسینی ایزوفلاونوییدی مختلفی را تولید می­نمایند که به عنوان مثال می­توان به پتروکارپان مدیکارپین در Medicago sativa (Dixon, 1999) و Medicago truncatula (Liu et al., 2003;  Farag, 2007;) و ماکاین و فورمونونتین در Trifolium repens اشاره نمود (Tebayashi et al., 2001). ایزوفلاونوییدها معمولاً به­صورت پیوسته در اشکال گلوکوزید و گلوکوزیدهای مالونیل، ابتدا در ریشه­ها و سپس در ساقه­ها تولید می­شوند. در مقابل، اشکال آزاد (غیرگلوکوزیله) این ترکیبات در اثر آلودگی­های میکروبی یا حملات حشرات و یا پس از القا با الیسیتورهای غیرزنده مانند نور ماورای بنفش و فلزات سنگین، تولید می­شوند (Dixon, 1999).

مسیر فنیل پروپانوئیدی در حضور آنزیم­های تیروزین آمینو ترانسفراز و فنیل آلانین آمینولیاز شروع می­شود. این آنزیم­ها  گروه آمینی را از اسیدهای آمینه فنیل­آلانین/تیروزین برداشته و اسید سینامیک را تولید می­نمایند. اسید سینامیک توسط آنزیم­های دیگر از جمله چالکون سینتاز، پیش ماده لیکویریتیجینین (Liquiritiginin) و نارینجنین (Naringenin) را تولید می­نمایند، که توسط آنزیم IFS به ترتیب به دیدزین و جنیستین تبدیل می­شوند (Hashim et al., 1990). یکی از مهمترین ویژگی­های ترکیبات ایزوفلاونی خواص استروژنی آن­ها است که می­تواند در درمان بیمارانی که عدم تعادل هورمونی دارند مورد استفاده قرار گیرند (Dewick, 1997). ترکیبات ایزوفلاونی در درمان بسیاری از بیماری­ها از قبیل پیشگیری از ابتلا به سرطان­های وابسته به هورمون (مانند سرطان پروستات و سینه)، کاهش علایم یائسگی، بهبود سطح کلسترول خون و همچنین بهبود بیماری­های قلبی-کرونری مورد استفاده قرار می­گیرند. آنزیم IFS  متعلق به خانواده سیتوکروم P450 است (Jung et al., 2000; Steele et al., 1999; Akashi et al., 1999) که واکنش تبدیل پیش ماده فلاونونی لیکویریتیجینینی و نارینجینی را به دیدزین و جنیستین در طی دو مرحله کاتالیز می­نماید. این مراحل شامل 2-هیدروکسیلاسیون و مهاجرت حلقه­ی پیش ماده فلاونونی بوده، که در ابتدا ترکیب 2-هیدروکسی ایزوفلاونونی تولید و به دنبال آن دهیدراسیون این ترکیب (به­صورت آنزیمی یا خودبخودی) سبب تولید محصول ایزوفلاونی می­شود (Hashim et al.,1990). ژن کدکننده این آنزیم از ژن­های خانه­دار (House keeping) نبوده و معمولاٌ تحت شرایط خاص بیان می­شود. در این تحقیق، میزان بیان ژن IFS و همچنین فعالیت سیستم آنتی­اکسیدان آنزیمی و غیر­آنزیمی در گیاهچه­های 9 روزه سویا در تیمار با غلظت­های مختلف عصاره مخمر مورد آنالیز قرار گرفتند.

مواد و روش­ها

کشت گیاه و تیمار گیاهچه­ها با الیسیتور عصاره مخمر(YE)

        بذر گیاه سویا (رقم ویلیامز III) از موسسه تحقیقات اصلاح و تهیه نهال و بذر کرج تهیه شد. به منظور ضدعفونی کردن سطحی بذرها از اتانول 70% به مدت 2 دقیقه و هیپوکلرید سدیم 5/2% به مدت 5 دقیقه استفاده شد و درنهایت سه بار با آب مقطر استریل آبکشی شدند. بذرهای استریل شده داخل محیط پیت ماس اتوکلاو شده کشت و به مدت 9 روز در شرایط تاریکی کامل داخل انکوباتور با دمای C° 28 قرار گرفتند. گیاهچه­های 9 روزه جدا شده از محیط به مدت­های 8 و 16 ساعت در معرض غلظت­های مختلف عصاره مخمر (0، 1/0، 2/0 و 5/0 درصد) که بطور جداگانه در آب مقطر استریل تهیه شده بودند قرار گرفتند. از هرکدام از غلظت­ها مقدار 50 میلی­لیتر به صورت جداگانه تهیه و گیاهچه­های رشد کرده در طی زمان­های ذکر شده در معرض آن­ها روی شیکر با دور rpm 120 قرار گرفتند. به منظور حذف سطحی الیسیتور، گیاهچه­ها با آب مقطر استریل شسته و بلافاصله بر روی دستمال­های کاغذی استریل (زیر هود) قرار گرفتند تا آب اضافی آن­ها حذف شود، سپس گیاهچه­ها به مدت 10 دقیقه در نیتروژن مایع قرار گرفته و تا زمان استفاده در دمای 80- نگهداری شدند.

آنالیز بیان ژن

       بررسی بیان ژن ایزوفلاون سینتاز در گیاهچه­های تیمار شده با عصاره مخمر به شرح زیر انجام گرفت.

استخراج RNA کل

       استخراج RNA کل با استفاده از کیت RNX – Plus (شرکت سینا ژن، شماره کاتالوگ: RN7713C) مطابق دستورالعمل شرکت انجام شد. به منظور حذف آلودگی­های DNA، در مرحله آخر استخراج، از آنزیم DNase 1 (1 میکرولیتر آنزیم، 20 دقیقه در دمای C° 37) استفاده شد. پس از استخراج  RNAکل بمنظور بررسی کیفیت تخلیص آن، از ژل آگارز یک درصد و جهت بررسی کمیت RNA تخلیص شده از دستگاه اسپکتروفتومتر (جذب 260 بر روی 280) استفاده شد.

ساخت cDNA

        به منظور ساخت cDNA، ابتدا 2 میکروگرم از  RNAکل به تیوب­های 2/0 اضافه شد (کلیه مراحل ساخت cDNA روی یخ انجام شد). در ادامه پس از اضافه نمودن 2 میکرولیتر پرایمر عمومی الیگو dT به تیوپ­ها به مدت 10 دقیقه در دمای C° 65 قرار گرفتند. پس از انتقال تیوپ­ها به روی یخ، یک میکرولیتر آنزیم رونوشت بردار معکوس (RT) (MMuLV از شرکت فرمنتاز)، مقدار 5/2 میکرولیتر بافر رونوشت RT (10X)، 75/0 میکرولیتر dNTP، 75/0 میکرولیتر RNase inhibitor، و در نهایت آب دیونیزه استریل (RNase free) تا حجم نهایی 25 میکرولیتر به تیوپ­ها اضافه شد. واکنش ساخت cDNA به مدت 80 دقیقه در دمای C° 42 انجام شد. در انتهای واکنش به منظور حذف اثر RT، تیوب­ها به مدت 10 دقیقه در دمای C° 70 قرار گرفتند. همچنین به منظور حذف آلودگی­های اضافی RNA از آنزیم RNase A (1 میکرولیتر،20 دقیقه در دمای C° 37) استفاده شد.

تکثیر ژن ایزوفلاون سینتاز و کنترل داخلی در حضور پرایمرهای اختصاصی

       واکنش تکثیر ژنIFS  و توبولین (به عنوان کنترل داخلی) با استفاده از آنزیم Taq پلیمراز و در حضور پرایمرهای اختصاصی است انجام شد (جدول 1).

جدول 1- توالی پرایمرهای مربوط به ژن ایزوفلاون سینتاز و توبولین و Tm و درصد GC هرکدام.

Table 1- The sequence of Tubulin and IFS primers and whose Tm and GC contents.

توالی مربوط به ژن ایزوفلاون سینتاز بر اساس توالی این ژن از گیاه سویا با شماره دسترسی NM-001249093  ثبت شده درGene Bank و توالی پرایمرهای مربوط به توبولین بر اساس توالی ژن توبولین بر اساس ژن توبولین گیاه گندم با شماره دسترسیDQ435671.1  ثبت شده در Gene Bank طراحی و توسط شرکت  MWG آلمان ساخته شدند.

        تکثیر ژن IFS با شرایط زیر انجام شد. واسرشت سازی اولیه در دمای C° 94 به مدت 5 دقیقه، 30 سیکل شامل واسرشت سازی در دمای C° 94، 30 ثانیه، اتصال پرایمرها در دمای C° 55، 30 ثانیه و بسط در دمای C° 72، به مدت90 ثانیه و یک مرحله بسط نهایی در دمای C° 72 به مدت 8 دقیقه انجام گرفت. تکثیر ژن توبولین مشابه شرایط قبل بجز اینکه دمای اتصال پرایمرها در دمای C° 51 انجام گرفت. مقایسه بیان این ژن در غلظت­های مختلف الیسیتور عصاره مخمر با استفاده از روش نیمه کمی  RT-PCRو از روی شدت باند تکثیر شده که بر روی ژل آگارز یک درصد تفکیک شدند و پس از نرمالیز نمودن با ژن توبولین تکثیر شده مربوطه، توسط نرم افزار Gene tools انجام شد.

اندازه­گیری محتوی فلاونوئید کل

     جهت سنجش محتوی فلاونوئید کل، مقدار 2/0 گرم از بافت­تر گیاهچه­های در اتانول اسیدی (شامل اتانول و اسید استیک گلاسیال به نسبت 99 به 1) هموژنیزه شد. پس از همگن و سانتریفوژ کردن عصاره با دور rpm3600 به مدت 10 دقیقه، محلول رویی جدا و 10 دقیقه در حمام آب گرم قرار گرفت. سپس جذب محلول رویی در سه طول موج 270، 300 و 330 نانومتر اندازه­گیری شد (Krizek, 1998). در این مطالعه از ضریب خاموشی mM ^-1 cm ^-13300  =ε جهت محاسبه محتوی فلاونوئید کل استفاده و مقدار آن بر حسب M/g fwµ گزارش گردید.

اندازه­گیری محتوی آنتوسیانین

    محتوی آنتوسیانین گیاهچه­های تیمار شده و شاهد بر اساس روش  Krizek(1993) انجام شد. به این منظور مقدار 2/0 گرم بافت­تر گیاهچه­ها در متانول اسیدی (شامل متانول و اسید استیک گلاسیال به نسبت 99 به 1) سائیده شد. محلول رویی پس از سانتریفوژ شدن با دور  rpm10000 به مدت یک شب در تاریکی قرار گرفت. جذب نمونه­ها در 550 نانومتر اندازه­گیری شد. از ضریب خاموشی  mM ^-1 cm ^-13300= ε جهت محاسبه محتوی آنتوسیانین استفاده و مقدار آن بر حسب M/g fwµ گزارش گردید.

عصاره­گیری و سنجش فعالیت آنزیم­های آنتی­اکسیدان

       به منظور تهیه عصاره آنزیمی برای سنجش فعالیت آنزیم­های آنتی­اکسیدان، مقدار نیم گرم از بافت­تر گیاهچه­های سویا در بافر پتاسیم فسفات 50 میلی­مولار (pH=7/5) حاوی پلی ونیل پیرولیدین (PVP) 1%، EDTA 1 میلی­مولار و PMSF 1 مولار سائیده و محلول همگن به دست آمده به مدت 15 دقیقه با دور  rpm18000 در دمای ^oC 4 سانتریفوژ گردید.

سنجش فعالیت آنزیم سوپر­اکسید­دیسموتاز (SOD)

      برای سنجش فعالیت آنزیم سوپراکسید دیسموتاز از روش Giannopolitis & Ries (1997) استفاده شد. یک واحد فعالیت سوپراکسیددیسموتاز به عنوان مقدار آنزیمی در نظر گرفته شد که منجر به مهار 100% احیای نوری نیتروبلوتترازولیوم می­گردد.

سنجش فعالیت آنزیم کاتالاز (CAT)

        فعالیت آنزیم کاتالاز با استفاده از محاسبه کاهش جذب H₂O₂ در nm 240 (Dhindasa, et al., 1981) سنجیده و میزان H₂O₂ موجود در مخلوط واکنش با استفاده از ضریب خاموشی 0.28 mM^-1 cm^-1 =ε محاسبه شد. فعالیت آنزیم به صورت واحد آنزیمی بر حسب مقدار پروتئین کل (میلی­گرم) موجود در 100 میکرولیتر عصاره در مدت زمان یک دقیقه محاسبه گردید.

سنجش فعالت آنزیم پراکسیداز (POD)

     سنجش فعالت آنزیم پراکسیداز با استفاده از اندازه­گیری میزان جذب تتراگایاکول تشکیل شده از گایاکول در مدت زمان 3 دقیقه در طول موج nm470 انجام گرفت (Plewa et al., 1991). ضریب خاموشی تتراگایاکل 25.5 cm ^-1 mM^-1= ε می­باشد.

سنجش مقدار پروتئین

    مقدار پروتئین­های محلول در گیاهچه­های به روش Bradford (1976) اندازه گیری شد. غلظت پروتئین با استفاده از رسم منحنی استاندارد محاسبه و برحسب میلی­گرم بر گرم بافت­تر گزارش گردید.

آنالیز آماری

    تمامی آزمایشات با 3 تکرار مستقل و در قالب یک طرح کاملاً تصادفی انجام شدند. میانگین داده­ها با استفاده از نرم افزار SAS توسط آزمون دانکن و با در نظر گرفتن سطح اطمینان P≤0.05 مورد تجزیه واریانس یک عاملی قرار گرفتند.

نتایج

میزان بیان ژن ایزوفلاون سینتاز در تیمار با غلظت­های مختلف الیسیتور عصاره مخمر

      کیفیت RNA استخراج شده با تفکیک باندهای rRNA بر روی ژل آگارز %1 انجام شد. طبق شکل 1 دو باند مربوط به rRNA S28 و S18 نشان دهنده کیفیت مناسب  RNAتخلیص شده و دست نخورده بودن آن است.

شکل 1- نمونه­ای از  RNAکل استخراج شده از گیاهچه­های شاهد و تیمار شده با غلظت 1/0 درصد عصاره مخمر بمدت 8 ساعت بر روی ژل آگارز. دو باند مربوط به S28 وS 18، rRNA به وضوح قابل مشاهده می­باشند. از چپ به راست؛ چاهک 1 مربوط به مارکر وزن مولکولی و چاهک 2 و 3 بترتیب مربوط به نمونه RNA تخلیص شده از نمونه شاهد و تیمار شده با غلظت 1/0 درصد عصاره مخمر می­باشند.

Figure 1- Sample of total RNA extracted of control and treated seedlings with 0.1% yeast extract after 8-hour elicitation on agarose gel. The both rRNA 18S and 28S bands are clearly revealed.  Left to right; lane 1 is related to molecular weight marker and lane 2 and 3 are related to RNA extracted of control and treatment with 0.1% yeast extract respectively. 

از RNA استخراج شده با استفاده از پرایمرهای عمومی الیگو  dTو آنزیم نسخه­بردار معکوس، کتابخانه cDNA مربوط به هر نمونه ساخته شد. از cDNA ساخته شده در حضور پرایمرهای اختصاصی عمل تکثیر انجام و ژن IFS و توبولین تکثیر شدند. مطابق شکل 2 قطعه تکثیر شده IFS باندی معادل  bp1566 و برای ژن توبولین باندی معادل bp 700 بر روی ژل ظاهر شد.

شکل 2- محصولات تکثیر ژن  IFS(I) و توبولین (T) در گیاهچه­های تیمار شده با غلظت 1/0 درصد عصاره مخمر بمدت 8 ساعت. قطعه تکثیر شده IFS باندی معادل  bp1566 و برای توبولین باندی تقریباً معادل bp700 بر روی ژل آگارز ظاهر گردید. WM نشان دهنده مارکر وزن مولکولی می­باشد.

Figure 2- Amplified products of IFS (I) and Tubulin (T) genes in seedlings that treated with 0.1% yeast extract after 8-hour elicitation. The IFS and Tubulin genes show a band about 1566 bp and 700 bp on 1% of agarose gel respectively. WM indicate the molecular weight marker.

شکل 3- میزان بیان ژن IFS در گیاهچه­های شاهد و تیمار شده با غلظت­های مختلف عصاره مخمر به مدت 8 و 16 ساعت. حروف متفاوت بالای نمودارها نشان دهنده معنی­دار بودن در سطح p≤ 0.05 می­باشد.

Figure 3- Comparison of IFS gene expression in control and treated seedlings with different concentrations of yeast extract after 8 and 16 hours elicitation. In each group, signs with different letters indicate significant differences at p≤ 0.05.

     در این مطالعه از نرم افزار Gene Tools برای آنالیز نیمه کمی بیان ژن IFS در مقایسه با ژن توبولین (کنترل داخلی) استفاده شد. همانطور که در شکل 2 مشاهده می­شود درحالیکه بیانی برای این ژن در نمونه شاهد مشاهده نشد در حضور تمامی غلظت­های الیسیتور میزان بیان ژن افزایش یافت. در زمان 8 ساعت اعمال تیمار، بیشترین میزان بیان در غلظت 2/0 درصد مشاهده می­گردد ولی با افزایش غلظت الیسیتور در محیط میزان بیان ژن کاهش معنی­داری را نسبت به تیمار 2/0 درصد نشان داد. درحالیکه در تیمار بمدت 16 ساعت نیز بیانی در نمونه شاهد مشاهده نشد، بیان آن بطور قابل توجهی در حضور تمامی غلظت­های الیسیتور افزایش یافت. میزان بیان این ژن در زمان 16 ساعت تقریبا معادل دو برابر زمان 8 ساعت است.

محتوی فلاونوئیدی

    همانطور که در شکل 4 مشاهده می­شود محتوی فلاونوئیدی کل گیاهچه­ها در تمامی غلظت­ها و در هر دو زمان اعمال تیمار، نسبت به نمونه شاهد بطور معنی­داری افزایش یافته است. افزایش محتوی این متابولیت­ها، در زمان 8 ساعت تیمار بطور خطی با افزایش غلظت الیسیتور در محیط افزایش می­یابد و بیشترین میزان فلاونوئید در تیمار 5/0 درصد مشاهده گردید. درحالیکه در زمان 16 ساعت، بیشترین محتوی فلاونوئید در غلظت 1/0 درصد مشاهده گردید و با افزایش غلظت الیسیتور در محیط محتوی آن نسبت به غلظت 1/0 درصد به طور معنی­داری کاهش یافت.

شکل 4- محتوی فلاونوئید کل گیاهچه­های شاهد و تیمار شده با غلظت­های مختلف الیسیتور عصاره مخمر بمدت 8 و 16 ساعت. حروف متفاوت بالای نمودارها نشان دهنده معنی­دار بودن در سطح p≤ 0.05  می­باشد.

Figure 4- Total flavonoid content in control and treated seedlings with different concentrations of yeast extract after 8 and 16 hours elicitation. In each group, signs with different letters indicate significant differences at p≤ 0.05.

محتوی آنتوسیانین

      محتوی آنتوسیانین گیاهچه­های تیمار شده با الیسیتور عصاره مخمر در غلظت­ها و زمان­های مختلف در شکل 5 نشان داده شده است. همانطور که در شکل قابل مشاهده است در حالیکه کاهش معنی­دار محتوی آنتوسیانین در غلظت 1/0 درصد در هر دو زمان اعمال تیمار در مقایسه با نمونه شاهد صورت گرفته است افزایش معنی­دار محتوی آنتوسیانین در غلظت­های بالاتر اعمال تیمار به وضوح قابل مشاهده می­باشد.

سنجش فعالیت آنزیم­های آنتی اکسیدان گیاهچه­های تیمار شده با غلظت­های مختلف عصاره مخمر

اثر عصاره مخمر بر فعالیت آنزیم  SOD

مطابق با شکل 6، میزان فعالیت آنزیم سوپر اکسید دیسموتاز در مدت زمان 8 ساعت تیمار در تمامی غلظت­های مورد استفاده نسبت به نمونه شاهد افزایش معنی­داری را نشان می­دهد و بیشترین افزایش فعالیت آنزیم در غلظت 5/0 درصد تیمار مشاهده گردید. درحالیکه در تیمار بمدت 16 ساعت نیز مانند تیمار بمدت 8 ساعت، تمامی غلظت­ها مورد استفاده الیسیتور نسبت به نمونه شاهد افزایش معنی­دار فعالیت این آنزیم را نشان می­دهند و بیشترین افزایش فعالیت این آنزیم در غلظت 2/0 درصد مشاهده گردید.

شکل 5- محتوی آنتوسیانین گیاهچه­های شاهد و تیمار شده با غلظت­های مختلف الیسیتور عصاره مخمر بمدت 8 و 16 ساعت. حروف متفاوت بالای نمودارها نشان دهنده معنی­دار بودن در سطح p≤ 0.05 می­باشد.

Figure 5- Anthocyanin content in control and treated seedlings with different concentrations of yeast extract after 8 and 16 hours elicitation. In each group, signs with different letters indicate significant differences at p≤ 0.05.

شکل 6- فعالیت آنزیم سوپر اکسید دیسموتاز در گیاهچه­های شاهد و تیمار شده با غلظت­های مختلف عصاره مخمر بمدت 8 و 16 ساعت. حروف متفاوت بالای نمودارها نشان دهنده معنی­دار بودن در سطح p≤ 0.05 می­باشد.

Figure 6 - Activity of superoxide dismutase in control and treated seedlings with different concentrations of yeast extract after 8 and 16 hours elicitation. In each group, signs with different letters indicate significant differences at p≤ 0.05.

اثر الیسیتور عصاره مخمر بر فعالیت آنزیم CAT

    فعالیت آنزیم کاتالاز (شکل 7) در گیاهچه­های تیمار شده با غلظت­های مختلف عصاره مخمر در هر دو زمان 8 و 16 ساعت بطور معنی­داری در مقایسه با نمونه شاهد افزایش یافته است. در تیمار بمدت 8 ساعت ، افزایش فعالیت آنزیم با افزایش غلظت الیسیتور در محیط همخوانی دارد و بیشترین فعالیت آنزیم در غلظت 5/0 درصد مشاهده گردید. در حالیکه فعالیت این آنزیم در زمان 16 ساعت اعمال تیمار تا غلظت 2/0 درصد بصورت خطی افزایش و سپس بطور معنی­داری کاهش نشان می­دهد.

اثر الیسیتور عصاره مخمر بر فعالیت آنزیم POD

    همانطور که در شکل 8 قابل مشاهده است، فعالیت آنزیم پراکسیداز در گیاهچه­های تیمار شده به مدت 8 ساعت در تمامی غلظت­ها نسبت به نمونه شاهد افزایش معنی­داری یافته است. بیشترین افزایش در تیمار با غلظت 1/0 درصد الیسیتور مشاهده گردید ولی با افزایش غلظت آن در محیط، فعالیت این آنزیم به صورت خطی کاهش یافت. در حالیکه فعالیت این آنزیم در زمان 16 ساعت اعمال تیمار به صورت خطی با افزایش غلظت الیسیتور در محیط افزایش نشان می­دهد.

شکل 7- فعالیت آنزیم کاتالاز در گیاهچه­های شاهد و تیمار شده با غلظت­های مختلف عصاره مخمر بمدت 8 و 16 ساعت. حروف متفاوت بالای نمودارها نشان دهنده معنی­دار بودن در سطح p≤ 0.05 می­باشد.

Figure 7- Activity of catalase in control and treated seedlings with different concentrations of yeast extract after 8 and 16 hours elicitation. In each group, signs with different letters indicate significant differences at p≤ 0.05.

شکل 8- فعالیت آنزیم پراکسیداز در گیاهچه­های شاهد و تیمار شده با غلظت­های مختلف عصاره مخمر بمدت 8 و 16 ساعت. حروف متفاوت بالای نمودارها نشان دهنده معنی­دار بودن در سطح p≤ 0.05 می­باشد.

Figure 8- Activity of peroxidase in control and treated seedlings with different concentrations of yeast extract after 8 and 16 hours elicitation. In each group, signs with different letters indicate significant differences at p≤ 0.05.

اندازه گیری میزان پروتئین کل

     میزان پروتئین کل (شکل 9) در گیاهچه­های تیمار شده با غلظت 1/0 درصد عصاره مخمر نسبت به نمونه شاهد در هر دو زمان اعمال تیمار بطور معنی­داری کاهش یافت. در حالیکه در حضور غلظت­های 2/0 و 5/0 درصد الیسیتور، افزایش معنی­داری محتوی پروتئین نسبت به نمونه شاهد مشاهده می­شود.

شکل 9- محتوی پروتئین کل گیاهچه­های شاهد و تیمار شده با غلظت­های مختلف عصاره مخمر بمدت 8 و 16 ساعت. حروف متفاوت بالای نمودارها نشان دهنده معنی­دار بودن در سطح p≤ 0.05  می­باشد.

Figure 9- Total protein content in control and treated seedlings with different concentrations of yeast extract after 8 and 16 hours elicitation. In each group, signs with different letters indicate significant differences at p≤ 0.05.

بحث

      عصاره مخمر که از مخمر ساکارومیسس سرویزیه (Saccharomyces cerevisiae) تهیه می­شود به عنوان یک الیسیتور شناخته شده است. در واقع الیسیتور مذکور باعث فعال شدن نوعی مکانیسم دفاعی در گیاهان شده و ژن­های خاص مربوط به آنزیم­های درگیر در بیوسنتز متابولیت­های ثانویه را تحریک می­نماید. پیشنهاد می­شود، که محرک، ممکن است از طریق گیرنده­های موجود در سطح غشاء پلاسمایی مکانیزم تحریک را، راه بیندازند (Savitha et al., 2006). زمانیکه سلول­های گیاهی در معرض تنش­های غیرزیستی و زیستی مانند تیماردهی با محرک­ها قرار می­گیرند، قطع واکنش­های اکسایشی، یک رویداد قابل توجه در پاسخ­های دفاعی می­باشد. مشخص شده است که عصاره مخمر، مخلوطی از آمینو اسیدهای مختلف، ویتامین­ها و ترکیبات معدنی می­باشد. همچنین اثر عصاره مخمر به عنوان محرک می­تواند ناشی از ترکیبات دیگری باشد که هنوز به درستی شناسایی نشده­اند. یک دلیل ممکن برای تولید متابولیت­های ثانویه از طریق عصاره مخمر می­تواند مربوط به برخی ترکیبات از قبیل کاتیون­های فلزی Zn, Co و Ca در این ترکیب باشد که به عنوان محرک غیر زنده عمل می­کنند (Sandra et al., 2000). در این تحقیق، اثرات غلظت­های مختلف عصاره مخمر در زمان­های متفاوت بر بیان ژن IFS و سیستم آنتی­اکسیدان گیاهچه­های سویا مورد بررسی قرار گرفت. سویا (از خانواده نخود) حاوی ایزوفلاونوئیدهای مختلفی از قبیل دیدزنین و جنیستئین می­باشد که اثرات دارویی متفاوتی دادند. این ترکیبات دارویی مهم در مسیر فنیل پروپانوئید از پیش ماده فلاونونی تحت تاثیر آنزیم IFS سنتز می­شوند. در این پژوهش بیان ژن IFS در گیاهچه­های تیمار شده سویا با غلظت­های مختلف عصاره مخمر در دو زمان 8 و 16 ساعت به صورت نیمه کمی مورد سنجش قرار گرفت. همانطور که در شکل 3 مشاهده می­شود درحالیکه هیچ باندی مبنی بر بیان این ژن در گیاه شاهد (غلظت صفر عصاره مخمر) مشاهده نشد، بیان آن در حضور غلظت­های مختلف الیسیتور به طور چشمگیری افزایش یافته است. افزایش بیان این ژن در زمان 16 ساعت تیمار در مقایسه با زمان 8 ساعت تقریباً دو برابر است. این ترکیب تاکنون برای تحریک مواد موثره در گونه­های گیاهی متعددی از قبیل Orthosphomaristatus (Mizukam et al., 1992)، حسن یوسف (Coleus blumei) (Szabo et al., 1999) و همچنین ریشه­های موئی گیاه مریم گلی (Salvia miltiorrhiza) مورد استفاده قرار گرفته است (Yan et al., 2006). آزمایشات انجام شده روی بذرهای گیاه Lupinus albus تیمار شده با عصاره مخمر نشان داد که محتوی ایزوفلاون در بذرهای این گیاه افزایش یافته است (Gagnon & Ibrahim, 1997). مطالعات مرتبط با گیاهان کامل و کشت سلول گیاهی نشان داد که مواد شیمیایی محرک مشتق شده از قارچ­ها که الیسیتور نامیده می­شوند می­توانند پاسخ­های دفاعی موثری را در برابر تنش­ها القا کنند (Dixon & Lamb, 1990; Bell et al.,  1981; Hahlbrock & Scheel, 1989; Vance, 1980; Cassab & Varner, 1988; Boller, 1991). هنگامی که گیاهان مورد تهاجم و حمله میکروارگانیسم­ها قرار می­گیرند به طور کلی یک پاسخ دفاعی موثر نشان می­دهند که منجر به بیان آنزیم­های تولید کننده متابولیت­های ثانویه مانند [*]PAL می­شوند (Dixon & Lamb, 1990; Hahlbrock & Scheel, 1989).  PAL اولین آنزیم در مسیر بیوسنتز فنیل پروپانوئیدها می­باشد که به همراه TAT[†] در تولید سینامیک اسید نقش دارد (Tanner, 2004). بنابراین دلیل افزایش محتوی فلاونوئیدی و آنتوسیانین (شکل4 و 5) در گیاهچه­های تیمار با این الیسیتور، احتمالاً به دلیل افزایش بیان آنزیم­های درگیر در مسیر بیوسنتز آن­ها  می­باشد. بنابراین، افزایش بیان ژن IFS در مسیر فنیل پروپانوئیدی خود می­تواند دلیلی بر اثبات این فرضیه باشد. مطالعات انجام شده توسط Naoumkina و همکاران (2007) نشان داد که این الیسیتور در گیاهان می­تواند بر روی کل مسیر بیوسنتزی فلاونوئیدها تاثیر ­گذارد (Naoumkina et al.,  2007). لذا بنظر می­رسد، افزایش محتوی پروتئین کل در هر دو زمان اعمال تیمار به دلیل افزایش بیان ژن­های درگیر در سیستم­های آنتی­اکسیدان از قبیل ژن­های درگیر در مسیر فنیل پروپانوئیدها می­باشد. مشخص شده است که ترکیبات فنولیکی نقش مهمی در حفاظت گیاهان در مقابل عوامل تنش­زای زنده و غیر­زنده بازی می­کند. این ترکیبات رنج  وسیعی از فعالیت­های بیولوژیکی مانند اثرات ضد قارچی، ضد باکتریایی، ضد ویروسی و ضد التهابی  دارند (Soobrattee et al., 2005). بنابراین می­توان نتیجه گیری نمود که افزایش محتوی فلاونوئید کل پاسخی برای کاهش اثرات تنش حاصله از اعمال الیسیتور می­باشد. برای اثبات این تئوری در این آزمایش، فعالیت برخی از آنزیم­های مهم سیستم آنتی­اکسیدان مورد آنالیز قرار گرفت. ثابت شده است که تنش­های زنده و غیر­زنده سبب افزایش میزان رادیکال­های آزاد (از قبیل گونه­های فعال اکسیژن ) می­شوند. رادیکال­های آزاد اثرات مخرب بر روی ملکول­های آلی بر جای می­گذارند و سبب ایجاد عوارض و پی­آمدهای خطرناکی بر گیاهان می­شوند. گیاهان در برابر این رادیکال­ها، دارای مکانیسم­های دفاعی آنتی­اکسیدانی می­باشند. آنزیم سوپر اکسید دیسموتاز که در واکنش تبدیل آنیون­های سوپراکسید به پراکسیدهیدروژن نقش اساسی بازی می­کند (Hollosy, 2002) در تمامی غلظت­ها و در هر دو زمان اعمال تیمار به طور معنی­داری فعالیت آن در مقایسه با نمونه شاهد افزایش یافته است (شکل 6) که این افزایش در زمان 8 ساعت تیمار در مقایسه با زمان 16 ساعت بارزتر می­باشد. از طرف دیگر، سایر آنزیم­های آنتی­اکسیدان از قبیل کاتالاز و پراکسیداز که در جاروب نمودن H₂O₂ نقش عمده­ای دارند فعالیت آن­ها نیز نسبت به نمونه شاهد افزایش معنی­داری را در حضور تمامی غلظت­ها و زمان­های اعمال تیمار در سطح 5 درصد نشان می­دهند (شکل 7 و 8). نکته قابل توجه افزایش بارزتر فعالیت این آنزیم­ها مشابه آنزیم سوپر اکسید دیسموتاز در زمان 8 ساعت در مقایسه با زمان 16 ساعت تیمار می­باشد. نظر به افزایش بیشتر میزان بیان ژن IFS، محتوی فلاونوئیدی و آنتوسیانینی در زمان 16 ساعت تیمار در مقایسه با 8 ساعت پیشنهاد می­شود که کاهش فعالیت آنزیم­های آنتی­اکسیدان آنزیمی در زمان 16 ساعت تیمار به دلیل فعال­تر شدن سیستم آنتی­اکسیدان غیر آنزیمی است. همانطور که در تمامی شکل­ها به وضوح قابل مشاهده است در شرایط انجام آزمایش­ها، سیستم آنتی­اکسیدان آنزیمی و غیر آنزیمی به طور همزمان و هماهنگ جهت کاهش اثرات تنش وارد عمل می­شوند. اهمیت این تحقیق علاوه بر اینکه نخستین گزارش در ارتباط با اثرات این الیسیتور بر روی بیان این ژن و ارتباط آن با سیستم آنتی­اکسیدان در گیاهچه­های سویا می­باشد می­تواند در بیان ژن­های کلیدی مهم و کلون نمودن آن­ها و همچنین افزایش تولید مواد موثره این گیاه از قبیل ترکیبات ایزوفلاونوئیدی بسیار حائز اهمیت باشد.

تشکر و قدردانی

 این تحقیق با حمایت مالی دانشگاه تحصیلات تکمیلی صنعتی و فناوری پیشرفته، پژوهشگاه علوم و تکنولوژی پیشرفته و علوم محیطی، کرمان با قررداد شماره 4036/1 انجام شده است. بنابراین مجری و همکاران مراتب سپاس و قدردانی خود را از آن دانشگاه محترم اعلام می­دارند.