CTCF binding protein and epigenetic regulations of genome

پروتئین اتصالی CTCF و تنظیمات اپیژنتیکی ژنوم

محمدرضا محمدآبادی*¹، محمود امیری رودبار²، حمیده عادل دوست³

¹ دانشیار گروه علوم دامی دانشگاه شهید باهنر کرمان

² دانشجوی دکتری گروه علوم دامی دانشگاه شهید باهنر کرمان

³ دانشجوی دکتری گروه علوم دامی دانشگاه کردستان

تاریخ دریافت: 13/10/1391، تاریخ پذیرش: 24/3/1392

 چکیده

پروتئین CTCF یک پروتئین متصل شونده به مولکول DNA است، که توالی آن کاملا حفاظت شده می­باشد و در  تنظیمات بیان ژنی، جدا کننده­های کروماتین، نقشه­گذاری ژنومی، غیر فعال سازی کروموزوم X، ساختارهای سطح بالاتر کروماتینی و پردازش متفاوت mRNA نقش ایفا می­کند. این خصوصیات چند کاره­ای CTCF، موجب پیشنهاد نقش حیاتی آن در رشد و نمو و بیماری­ها شده است. پروتئین CTCF تنها پروتئین شناخته شده­ای در مهره­داران است که در عملکرد جدا کننده­ها دخیل می­باشد. مطالعات اخیر نشان دادند که، CTCF می­تواند به عنوان یک عامل وراثتی در تنظیمات اپیژنتیکی باشد، که ارتباطات بین متیلاسیون DNA، ساختارهای سطح بالاتر کروماتینی و بیان ژن طی فرایند نمو را تنظیم می­کند. هدف این مطالعه مروری بر نقش CTCF در این منظرهای مهم تنظیم ژنومی می­باشد. تمام یافته­ها نشان می­دهند که CTCF می­تواند به عنوان یک استاد بافنده ژنوم پستانداران در نظر گرفته شود.  

واژه­های کلیدی: CTCF، اپیژنتیک، غیر فعال سازی کروموزوم X، جداکننده­ها، سرطان.

مقدمه                        

ژنوم یوکاریوت­های عالی به طور پیچیده­ای در چندین سطوح به صورت ساختارهای متفاوت فضایی بسته بندی شده اند. در داخل هر کروموزوم، DNA به دور هیستون­ها پیچیده شده و ساختار فیبر­های نوکلئوزومی را تشکیل می­دهد. حلقه­ها و تاخوردگی­های بعدی به طور ماهرانه­ای داخل ساختارهای سطح بالاتر قرار گرفته­اند. اگرچه ساختار هندسی دقیق کروموزوم مشخص نشده است، ولی شواهد نشان می­دهد که ساختار کروماتین اثر مشخصی روی چگونگی رونوشت از DNA در تنظیم فرآیند­های سلولی دارد. این ارتباط پیچیده ساختار و عملکرد، در سطح فیبرهای nm 10 بهتر شناخته شده­اند، و در این سطح است، که دسترسی فاکتورهای تنظیمی به کروماتین با استفاده از ایجاد ساختارهای فضایی اپیژنتیکی قابل توارث (مانند تغییرات هیستونی و متیلاسیون DNA)، تنظیم می شوند. این ساختارهای فضایی بطور پویایی در سرتاسر طول عمر موجود زنده در طی نمو و یا پاسخ به عوامل محیطی، ایجاد شده­اند (Bernstein et al., 2007).

همچنین شواهد نشان می­دهند که حالت­های فضایی قطعات ژنومی در داخل فضای سه بعدی هسته، در عملکرد ژنوم نقشی اساسی دارد. در داخل هسته هر کروموزوم قلمروی فضایی خود را دارا می­باشد. کروماتین­ها به صورت الگوهای فشرده و یا غیر فشرده می­باشند که با فعالیت رونویسی ارتباط دارند (Fraser and Bickmore, 2007). در سال­های اخیر، با استفاده از تکنیک­های تصویر برداری پیشرفته به همراه روش­های ملکولی جدید، وجود شبکه­های پیچیده و وسیعی از ساختار­های تنظیمی با ارتباطات حلقه­های درون کروموزومی با دامنه­ی بلند[1] و بین کروموزومی[2] که در گذشته چندان جدی گرفته نمی­شدند را آشکار نمود. این نواحی تنظیمی با دامنه­ی بلند با بسیاری از فرآیند­های بیولوژیکی مانند بیان ژن به صورت تک آللی (Apostolou and Thanos, 2008)، غیر فعال سازی کروموزوم X (Bacher et al., 2006)، تنظیم بیان ژن­ها طی فرآیند نمو (Spilianakis et al., 2005) در ارتباط هستند. امروزه زمینه تحقیقات رونویسی از حالت مطالعه رونویسی در جایگاه ژن معین در یک الگوی خطی، به مدل های سه بعدی تنظیم بیان ژنی تغییر یافته­اند. این پیچیدگی ارتباط ژنومی در داخل پستانداران که تحت عنوان کروماتین اینتراکتوم[3] بیان می­شود، باعث افزایش احتمال حضور فاکتورهایی شده است که به­عنوان یک میانجی در ارتباطات داخل و بین کروماتینی نقش دارند. پروتئین اتصالی (CCCTC-binding factor (CTCF)) می­تواند کاندیدایی برای ایفای این نقش باشد. الگوهای توزیع منحصر به فرد جایگاه­های اتصال و مکانیسم­های تنظیمی این پروتئین که از طریق آنالیز کل ژنوم در بین انواع مختلفی از سلول­ها مشخص شده، نشان از نقش سراسری و بسیار مهم و متفاوت از فاکتورهای تنظیمی ساده دارد. شواهد نشان می­دهند که CTCF می­تواند به عنوان عامل توارث تنظیمات اپیژنتیکی باشد، که ارتباطات پیچیده­ی بین متیلاسیون DNA، ساختار­های کروماتینی سطح بالاتر و تنظیمات بیان ژنی که در طی نمو ایجاد شده­اند را تنظیم کند (Phillips and Corces, 2009). با توجه به نقش بسیار مهم این پروتئین در بسیاری از فعالیت­های تنظیمی مانند فعال و سرکوب رونویسی (Lobanenkov et al., 1990; Vostrov and Quitschke, 1997)، جداکننده­ها (Bell et al., 1999)، نقشه گذاری (Ohlsson et al., 2001)، غیر فعال سازی کروموزوم X (Chao et al., 2002) و پیرایش متفاوت mRNA (Shukla et al., 2011) توجه به این پروتئین تنظیمی به خصوص طی ده سال گذشته بسیار افزایش یافته است. نقش بسیار مهم این پروتئین در ایجاد ساختارهای فضایی کروماتین باعث شده که از این پروتئین به عنوان استاد بافنده­ی ژنوم یاد شود (Phillips and Corces, 2009).

پروتئین CTCF

این پروتئین توسط ژن CTCF کد می­شود، که دارای یازده ناحیه­ی انگشت روی[4] ZFs)) جهت اتصال به توالی DNA هستند. پروتئین اتصالیCTCF  تقریبا در تمام سلول­های بدنی بیان می­شود و الگوی بیانی مشابه با ژن­های خانه­دار دارد. توالی ژن CTCF در یوکاریوت های عالی، به خوبی حفاظت شده است به طوری که در ناحیه 11 ZFs آن بین گونه های انسان، موش و جوجه (مرغ اهلی) % 100همسانی مشاهده می­گردد. در مقایسه بین CTCF جوجه و پستانداران، در پستانداران CTCF آنها دارای پنج اینترون تکامل یافته است، که انواع مختلفی از خانواده های توالی های تکراری Alu و LINE در آنها وجود دارد. این تفاوت ها باعث تغییر در قاب خواندن باز (ORF) نمی­شود، این نشان دهنده آن است که طی 300 میلیون سال تکامل بعد از جدایی این دو دسته، توالی ها به خوبی حفظ شده اند (Ohlsson et al., 2001). پروتئین CTCF برای اولین بار با توجه به توانایی آن در اتصال به توالی 50 تا 60 جفت بازی در داخل ناحیه تنظیمی نزدیک پروموتور ژن c-myc جوجه جداسازی و کلون شد (Lobanenkov et al., 1990). پس از مدت کوتاهی، این پروتئین در توالی پایین دست جایگاه شروع رونویسی[5] (TSS) ژن c-myc در انسان و موش شناسایی گردید (Filippova et al., 1996). در این دو مطالعه، CTCF به عنوان بازدارنده رونویسی ژن c-myc معرفی گردید. در راستای این تحقیقات، پروتئین منفی1[6] (NeP1) شناسایی گردید، که توانایی اتصال به عنصر خاموشی در فاصله 4/2 کیلو باز بالاتر از ژن لیزوزیم جوجه را دارا می­باشد. تحقیقات بعدی بر روی این پروتئین مشخص کرد که NeP1 همان CTCF است که به طور اختصاصی به عنصر F1 خاموش کننده ژن لیزوزیم جوجه متصل شده و با گیرنده هورمون تیروئید v-ERBA، در سرکوب بیان لیزوزیم اثر سینرژیستی نشان می­دهد (Burcin et al., 1997). همچنین، در مطالعات بعدی، CTCF همچنین از عصاره هسته سلول هلا (Hela) با توجه به توانایی اتصال به نواحی بالادستی TSS در β-پروتئین آمیلوئید[7] جداسازی گردید. در این تحقیقات مشخص گردید که CTCF قادر است به عنوان یک فاکتور فعال کننده رونویسی عمل کند (Vostrov and Quitschke, 1997). پس از آن، اولین ارتباط بین جدا­کننده­ها و CTCF بر اساس کشفیات اتصال CTCF به جداکننده 5´HS4 در بالادست توالی ژن β-گلوبین جوجه مشخص گردید. در موازات با این کشفیات چهار جایگاه اتصال CTCF در ناحیه­ی کنترلی نقشه­گذاری[8] (ICR) بین Igf2 و H19 پستانداران شناسایی گردید (Bell et al., 1999). این نتایج بر پایه آزمایشاتی که در آن اتصال CTCF به جایگاهش در ژن β-گلوبین دچار اختلال شده بود، بدست آمد. اما این اختلال تأثیری در عملکرد جداکننده مانع[9] در این ژن نداشت (Recillas-Targa et al., 2002). ساختار ژن  CTCF و جایگاه­های انگشت روی­ها در شکل 1 نشان داده شده است.

جایگاه­های اتصال CTCF

به دلیل اتصال به دامنه وسیعی از توالی های گوناگون که به خاطر استفاده ترکیبی از ZFs می­باشد، از آن به عنوان فاکتور چند کاره[10] یاد می­شود (Filippova et al., 1996). جایگاه اتصال CTCF در پروموتورها، جداکننده­ها و دیگر نواحی تنظیمی چندین ژن مشخص گردیده است، که دارای طولی حدود bp 50 می باشند. با استفاده از روش ایمونوپرسیپیتاسیون کروماتینی[11] (Chip) در ژنوم انسان 13804 جایگاه اتصال CTCF در فیبروبلاستهای IMR90 انسانی مشاهده گردید. در این سلول الگوی توزیع سراسری آن به صورت 46% اینترژنیکی، 22% اینترونی، 12% اگزونی، 20% در داخل محدوده 5/2 کیلو بازی پروموتورها قرار داشتند (Kim et al., 2007). در یک تحقیق دیگر، با استفاده از ترکیب تکنیک Chip با توالی یابی با توان عملیاتی بالا[12] (ChIP-Seq) تعداد 20262 جایگاه هدف CTCF در سلول­های CD4⁺ انسانی شناسایی گردید (Barski et al., 2007).

با توجه به این داده­ها، با استفاده از الگوریتم های جدید که قادر به تشخیص اتصالات با حساسیت بالا می باشند، تعداد جایگاه های اتصال به 26814 در ژنوم انسان افزایش یافت. که توزیع سراسر ژنوم آن به صورت 45% اینترژنیکی، 7% در '5UTR ، 3% اگزونی، 29% اینترونی، 2% '3UTR ، 13% در محدوده 5 کیلو بازی TSS بود (Jothi et al., 2008).

شکل 1- ساختار ژنی CTCF (a) جوجه (b) انسان. مربع­های سیاه: توالی­هایی هستند که ترجمه می­شوند؛ مربع تو خالی: توالی­هایی هستند که ترجمه نمی­شوند؛ خط: توالی­های شروع رونویسی هستند. اندازه­ی فواصل بین اگزون­ها با کیلو باز (kb) مشخص شده­اند. در پستانداران یازده ZFs از اگزون­های 2 (E2) تا اگزون 8 (E8) قرار گرفته است، که چندین ZFs به صورت خورد شده در دو اگزون مجاور قرار دارند (Ohlsson et al., 2001).

Figure 1- Genomic organization of the chicken (a) and human (b) CTCF genes. Filled boxes, protein coding exons; open boxes, untranslated exons; arrow , transcription start sites. Estimated sizes of introns are in kilobases. The eleven ZFs of mammalian CTCF are distributed in exons E2 to E8, with several ZFs being split across neighboring exons15 (Ohlsson et al., 2001).

با استفاده از Chip-seq در سلول بنیادی رویانی موش 39609 جایگاه اتصال (Chen et al., 2008)، و همچنین 19308 و 19572 به ترتیب در سلول­های هلا[13] و جورکات[14] شناسایی گردید (Cuddapah et al., 2009). با آنالیز اتصالات کروماتین[15] به وسیله­ی توالی یابی انتهای جفت شده­ی تگ[16] (PET) یا Chia-PET اینتراکتوم CTCF و کروماتین در سلول­های پلری پوتنت[17] بررسی شد، که در این آنالیز به ترتیب  1480 و 336 جایگاه اتصالات cis و trans مشاهده گردید. این نواحی اتصالی با حالت­های اپیژنتیکی، فعالیت­های پروموتور، اتصال به افزآینده و اشغال غشا هسته­ای همراه بودند (Handoko et al., 2011). به طور کلی در پستانداران توالی­های DNA اتصالی CTCF و نواحی کناری آنها به طور معنی­داری حفاظت شده هستند. جایگاه­های اتصال CTCF با توجه به میزان شبهات به توالی­های بسیار شناخته شده­ی اتصالی CTCF به سه دسته­ی با شباهت کم، متوسط و زیاد دسته بندی می­شوند (Essien et al., 2009).

قابلیت اتصال به توالی­های متفاوت با بکارگیری از دیگر پروتئین­های اتصالی منجر به ایجاد یک مدل کد-CTCF شده است، که موجب می­شود تا CTCF با استفاده از ترکیبات متفاوتی از ZFs به جایگاه­های متفاوتی متصل شده و باعث تشکیل ساختاری شده تا برای اتصال با الگوهای پروتئینی متفاوت مناسب باشد (Ohlsson et al., 2010).

 CTCF و سرطان

ZFs این پروتئین قابلیت اتصال به DNA و دیگر پروتئین­ها را دارا می­باشند اما در بررسی بر روی سرطان­هایی که در آنها جهش در CTCF رخ داده است، مشاهده گردید که ZFs این پروتئین قادر هستند فقط به DNA و یا فقط به پروتئین های دیگر متصل شوند. این پروتئین احتمالا باعث تنظیم در بیان چندین ژن مانند، MYC، ARF، PIM1، PLK و Igf2 که در ایجاد سرطان نقش مستقیمی دارند، می­شود. در سرطان های سینه، پروستات و ویلمز[18] در ناحیه انگشت روی، جهش های مشاهده گردیده است که باعث تغییر اسید آمینه می­شوند (Filippova et al., 2002). از CTCF به عنوان کاندید جدید از ژن باز دارنده سرطان (TSG) یاد می­شود، چون مطالعات نشان داده است، که این ژن از سه طریق با سرطان در ارتباط است:

1) جلوگیری از رشد سلول

2) قرار گرفتن در ناحیه کروموزومی q2216 که باعث ازبین بردن هتروزیگوسیتی در تومورهای سینه می شود

3) جهش های ویژه­ای در ژن CTCF که در ارتباط با سرطان های مشخص شده است (شکل 2).

به­طور کلی تشکیل تومور­های سرطانی یک فرآیند چند مرحله­ای بوده که ابتدا عوامل سلولی پیش برنده­ی سرطان، یا همان آنکوژن­ها[19] فعال می­گردند و سپس ­­TSGs غیر فعال می­شوند، و نتیجه­ی آن معمولا با بیان بیش از حد آنکوژن­ها و کاهش بیان TSGs­ همراه است.

شکل 2- در این شکل ساختار طبیعی پروتئین CTCF و انتهای NH₂ و COOH و همچنین نواحی اتصالی CTCF که شامل 10 ZFs کلاس C₂H₂ و یک ZFs کلاس C₂HC می­باشند نشان داده شده است. بخش بزرگ شده­ی جهش­های بی­معنی ایجاد کننده­ی سرطان که باعث تغییر در توالی اسید آمینه­ای ZF3 و ZF7 که جایگاه­های حیاتی برای شناسایی باز DNA یا ساختار ZFs می­باشند را نشان می­دهد (Filippova et al., 2002).

Figure 2- schematic drawing of the wild-type CTCF protein shows the NH2-terminal and COOH-terminal domains of CTCF and the DNA binding domain of CTCF composed of 10 C2H2-class and 1 C2HC-class ZFs. The enlarged diagrams indicate the tumor-specific CTCF missense mutations that result in amino acid substitutions within ZF3 and ZF7 at positions critical for DNA base recognition or ZF formation (Filippova et al., 2002).

با توجه به این که پیشرفت تومور ها با کاهش بیان TSG همراه است، ولی بطور باور نکردنی میزان CTCF در لاین­ سلول­های سرطان سینه افزایش می­یابد، که این افزایش باعث کاهش مرگ برنامه ریزی شده سلولی[20] می­گردد (Docquier et al., 2005). بیان نابجای CTCF در بسیاری از لاین­های سلول­های سرطانی و طبیعی موجب بازداشتن از تقسیم و تکسیر سلولی می­گردد (شکل 3). به طور کلی مشخص شده که، CTCF به صورت مستقیم در تنظیمات بیان بسیاری از فاکتورهای مهم دخیل در رشد، مرگ برنامه ریزی شده­ی سلولی، توقف تقسیم سلولی[21]، پیری سلول­ها[22] و تمایز نقش ایفا می­کند. توضیح چگونگی عملکرد CTCF می­تواند برای فهمیدن چگونگی توانایی CTCF در القاء توقف سیکل سلولی در بسیاری از سلول­های سرطانی مفید واقع شود (Fiorentino and Giordano, 2012).

نقش CTCF در جدا­کننده­ها

جدا­کننده­ها قطعاتی از توالی­های DNA هستند، که از تداخل نا­مناسب ناحیه­های کروماتینی مجاور جلوگیری می­کنند. به طور کلی جدا­کننده­ها به دو گروه تقسیم می­شوند:

1) جدا­کننده­های بازدارنده­ی توالی­های افزاینده[23] ( (EB، که بین توالی­ افزاینده و پروموتور قرار گرفته و از تأثیر افزاینده­ها بر پروموتور جلوگیری می­کند.

2) جداکننده­های مانع[24]، از گسترش ساختار­های هتروکروماتینی به مناطق یوکروماتینی که در بین دو جدا­کننده­ی مانع قرار دارند جلوگیری می­کنند (شکل 4).

از جدا­کننده­ها به عنوان یک مکانیسم بسیار مهم برای کنترل اپیژنتیکی بیان ژن، به­خصوص در نواحی نقشه گذاری شده، یاد می­گردد (Gaszner and Felsenfeld, 2006). اولین جدا­کننده EB که در پستانداران شناسایی گردید، توالی cHS4 بود، که در انتهای ′5 ناحیه­ی β-گلوبین جوجه قرار دارد (Chung et al., 1993). فعالیت EB در این جدا­کننده با اتصال محکم پروتئین CTCF همراه است (Bell et al., 1999). تنظیم جایگاه β-گلوبین که به خوبی مطالعه شده است، یک مثال بسیار عالی از نقش CTCF در تنظیم بیان ژن­ها در طی نمو می­باشد. در اینجا چندین ناحیه­ی اتصال برای CTCF وجود دارد که در نهایت باعث ایجاد ساختار فضایی ویژهای شده که در سلول­های مختلف متفاوت بوده، و بیان ژن­های موجود در ناحیه­ی β-گلوبین را تحت تأثیر قرار می­دهد (Phillips and Corces, 2009). این ساختار و تفاوت­های آن در سلول­های مختلف در شکل زیر به خوبی نشان داده شده است (شکل 5).

همچنین، با بررسی­هایی که برای یافتن جایگاه­های اتصال CTCF انجام گرفت، مشخص گردید که این پروتئین در ناحیه­ی نقشه گذاری شده­ی تنظیمی ICR که بین دو ژن Igf2 و H19 قرار دارد، متصل شده و در اینجا نیز در ایجاد EB نقشی کلیدی دارند (Bell and Felsenfeld, 2000). در این ناحیه از ژنوم، CTCF نقش بسیار مهمی در برقراری و نگهداری نقشه­گذاری و الگوی بیان ژن در طی نمو دارا می­باشد.

شکل 3- مکانیسم­های ملکولی ایجاد شده به دلیل بیان بیش از حد CTCF در سلول­های HeLa. بیان غیر معمول CTCF موجب توقف سیکل سلولی بدون مرگ سلولی برنامه ریزی شده در سلول­های HeLa می­شود. اتصال CTCF به cts1myc، cts2myc، ctsprb، ctsp16، ctsp14 و ctsp53 احتمالا بتواند دلیل ایجاد حالت شبه پیری­سلولی[25] را توضیح دهد. در حقیقت CTCF به عنوان یک فاکتور مثبت برای بیان ژن­های p14ARF، p16INK4a، TP53 و RB عمل کرده، که این­ها از بیان c-myc را جلوگیری به عمل می­آورند. افزایش تدریجی در پروتئین p53 به دلیل بیان p14ARF موجب مرگ برنامه­ریزی شده­ی سلولی و توقف تقسیم سلولی می­شود. اما خانواده­های پروتئین RB از مرگ برنامه ریزی شده­ی سلولی به دلیل حضور p53 جلوگیری می­نمایند. از p16INK4a و RB به عنوان فاکتورهای ایجاد کننده­ی پیری سلولی یاد می­شود. توقف سیکل سلولی به دلیل p53 می­تواند به دلیل جلوگیری از بیان c-myc ایجاد شود (Fiorentino and Giordano, 2012).

Figure 3- Molecular mechanisms engaged by CTCF over-expression in HeLa cells. Ectopic expression of CTCF induces cell cycle arrest without apoptosis in HeLa cells. Enforced CTCF-binding to cts1myc, cts2myc, ctsprb, ctsp16, ctsp14 and ctsp53 may explain this senescent-like phenotype. Indeed CTCF would act as positive transcriptional modulator of p14ARF, p16INK4a, TP53 and RB genes, whereas it would repress transcription of c-myc. Accumulation of p53 protein, enforced by p14ARF expression, would lead to eventual cell cycle arrest and apoptosis. However, RB family proteins overcome the p53-mediated apoptosis induction. In particular, RB and p16INK4a are well known positive factors of cellular senescence. Finally, p53-mediated cell cycle arrest could be enforced by c-myc repression (Fiorentino and Giordano, 2012).

شکل 4- انواع جداکننده­ها (A): جدا­کننده­های بازدارنده­ی توالی­های افزاینده، EB باعث اختلال در ارتباط بین پروموتور و افزاینده با توجه به جایگاهش می­شود. یک EB تنها زمانی که بین یک پروموتور و افزاینده قرار گیرد (مانند حالت پروموتور 1)، از فعالیت رونویسی جلوگیری می­کند؛ در دیگر حالت­ها (برای مثال پروموتور 2) فعالیت رونویسی را مختل نمی­کند. (B): جداکننده­های مانع، یک جدا کننده­ی مانع ژن را از پیشرویه ساختار­های هتروکروماتینی محافظت می­نماید (Gaszner and Felsenfeld, 2006).

Figure 4- Types of insulators: (A) enhancer-blocking insulator function. An enhancer-blocking insulator is expected to interfere with enhancer–promoter communication in a position-dependent manner. An enhancer-blocking insulator will block transcriptional activation only when it lies between a promoter and an enhancer (as in the case of promoter 1); in other situations (such as for promoter 2), activation is not blocked. (B) barrier insulator. A barrier insulator protects a gene from heterochromatic encroachment (Gaszner and Felsenfeld, 2006).

متیلاسیون ICR در نر­ها در طی گامتوژنز از اتصال CTCF به چهار جایگاه اتصال آن در این ناحیه جلوگیری می­کند. ولی در ماده­ها این ناحیه در طی گامتو­ژنز از متیلاسیون محافظت شده و در نتیجه پروتئین CTCF قادر به اتصال به این ناحیه می­باشد. این اتصال در حفظ نقشه­گذاری در مراحل بعدی و سلول­های بدنی بسیار حائز اهمیت است. با اتصال CTCF توالی افزاینده نمی­تواند بر روی پروموتور ژن Igf2 اثر بگذارد و در نتیجه بیان نخواهد شد، اما توالی افزاینده بر روی ژن H19 اثر کرده و باعث بیان آن می­شود. در آللی که منشأ پدری دارد، علاوه بر متیلاسیون ICR، پروموتور ژن H19 نیز متیله شده که از بیان آن جلوگیری شده اما توالی افزاینده به دلیل عدم اتصال CTCF بر روی ژن Igf2 اثر کرد و باعث بیان آن می­شود (شکل 6) (Pant et al., 2003). به طور کلی CTCF دارای چندین نقش در ناحیه­ی ICR H19/Igf2 می­باشد: 1) خنثی کردن اثر توالی افزآینده بر روی پروموتور آلل مادری ژن  Igf2، 2) شروع بیان ژن H19، 3) نگهداری الگوی متیلاسیون آلل­های والدینی در ناحیه­ی ICR موجود در بین این دو ژن و 4) ایجاد یک ساختار بلند کروماتینی.

شکل 5- ارتباطات درون کروموزومی با توجه به نوع سلول. (A) جایگاه­های اتصال CTCF در یک الگوی خطی برای جایگاه β-گلوبین. چهار ژن گلوبین (فلش­های سبز) در درون یک دسته­ ژن­های گیرنده­ی بویایی (فلش­های نارنجی) قرار گرفته­اند. سه جایگاه اتصال CTCF در بالا دست (5′HS85، 5′HS62/60 و 5′HS5) و یک جایگاه در kb 20 پایین دست ژن قرار گرفته­اند. (B تا D) ارتباطات درون کروموزومی در حالت سه بعدی، و الگوی بیان ژن گلوبین در سلولهای خونی اولیه (B)، سلولهای خونی تمایز یافته (C) و سلولهای مغزی غیر خونی(D) (Phillips and Corces, 2009).

Figure 5- Cell type-specific intrachromosomal interactions at a developmentally regulated locus. (A) CTCF binding sites in linear manner for β-globin locus. Four globin genes (green arrows) are embedded within a larger olfactory receptor gene cluster (orange arrows). Three CTCF-binding sites have been identified upstream (5′HS85, 5′HS62/60, and 5′HS5) and one 20 kb downstream (3′HS1) of the gene. (B to D) 3C-based intrachromosomal interactions, and globin gene expression profiles in erythroid progenitors (B), definitive erythroid cells (C), and non-erythroid brain cells (D) (Phillips and Corces, 2009).

شکل 6- A و B جایگاه H19/Igf2 موش را به صورت یک مدل خطی نشان می­دهد. ژن غیر کد کنده­ی H19 به صورت مادری بیان شده که در فاصله­ی kb 90 پایین دست ژن کد کننده­ی Igf2 قرار دارد که تنها به صورت آلل پدری بیان می­شود. ناحیه­ی کنترل نقشه گذاری (ICR) حدود kb 2 بالادست H19 قرار داشته و دارای چهار جایگاه اتصال CTCF می­باشد، و برای تنظیم کل جایگاه ضروری می­باشد. نواحی متیلاسیون افتراقی[26] ( (DMRs، مانند DMR1 در بالا دست پروموتورهای Igf2 (P1، 2 و 3) و DMR2 درون اگزون 6 Igf2 باهم به صورت کاملا هماهنگ شده، الگوهای بیانی با منبع آللی[27] با همکاری افزاینده­های موجود در فواصل kb 8 (Ee: افزاینده­ی بافت اندودرم و kb 25 (Em: افزاینده­ی بافت مزودرمی پایین دست ژن Igf2 را تنظیم می­کنند. –CH₃، متیلاسیون DNA. دایره­های سبز رنگ، افزاینده. C و D مدل­های سه بعدی الگوهای با منبع آللی برای اتصال CTCF، متیلاسیون DNA، و حلقه­های کروماتینی را نشان می­دهد (Phillips and Corces, 2009).

Figure 6- (A and B) Linear depiction of the mouse H19/Igf2 locus. The maternally expressed noncoding H19 gene is located approximately 90 kb downstream from the gene encoding Insulin-like growth-factor 2 (Igf2) that is expressed exclusively from the paternal allele. The imprinting control region (ICR) ~2 kb upstream of H19 contains four CTCF-binding sites and is essential for regulation of the entire locus. Differentially methylated regions (DMRs), such as DMR1 upstream of  Igf2 promoters (P1, 2, 3) and DMR2 within  Igf2 exon 6, act in concert to regulate reciprocal, allele-specific expression patterns from a shared set of downstream enhancers at 8 kb (Ee: endodermal tissue enhancer) and 25 kb (Em: mesodermal tissue enhancer) downstream of the H19 gene. −CH3, DNA methylation. Green ovals, enhancers. (C and D) Schematic 3D models illustrating allele-specific patterns of CTCF binding, DNA methylation, and chromatin looping (Phillips and Corces, 2009).

به طور کلی عملکرد CTCF در جداکننده ها تنها از طریق مکانیسم EB و نقش غیر مستقیم در جداکننده­های مانع مطرح می­شود (Phillips and Corces, 2009).

 CTCF پروتئین مهم در غیر فعال­سازی کروموزوم X (XCI)

XCI یک نمونه­ی بسیار جالب برای نشان دادن بیان ژن به­صورت تک آللی و تنظیمات اپیژنتیکی در پستانداران می­باشد. در پستانداران، جنس ماده دارای دو کروموزوم جنسی X می­باشد. متعادل کردن مقدار کروموزوم جنسی با استفاده از خاموش کردن یکی از دو کروموزوم جنسی در طی مراحل ابتدایی نمو انجام می­گیرد. مکانیسم XCI در موش به طور اساسی مورد مطالعه قرار گرفته است، که حالت ابتدایی XCI یعنی شکل نقشه گذاری شده، و حالت بعدی آن یعنی شکل تصادفی XCI را به خوبی نشان می­دهد. ncRNA Xist با هر دو شکل XCI در ارتباط بوده، و همان کروموزومی که از آن بیان می­شود را پوشانده و خاموش می­کند.

اگرچه جزئیات مکانیسم این دو حالت به خوبی روشن نشده، اما پژوهشگران بر این عقیده­اند که XCI تنها در مراحل ابتدایی نمو روی می­دهد. در طی XCI کروموزوم غیر فعال[28] (Xi) در اثر تنظیمات اپیژنتیکی به صورت ساختار­های هتروکروماتینی در آمده، و با استفاده از این تنظیمات در طی تقسیمات سلولی این ساختارها ثابت می­مانند. با وجودی که مطالعات بیشتر بر روی Xi نشان داد که تغییرات هیستونی زیادی در آن وجود دارد که شامل H3K27me3، H3K9me2، H3K9me3، H4K20me1 و H2AK119Ub به علاوه جایگزینی هیستون متفاوت[29] ماکرو H2A می­باشد. با این وجود، خالی از تغییرات هیستونی مانند H3K4me2/3 و لایزین استیله شده در هیستون­های H3 و H4 که با ساختارهای یوکروماتینی همراه است، می­باشد (Chow and Heard, 2009). انتهای ́5 Xist دارای ناحیه­ی متیلاسیون می­باشد که در تخمک متیله بوده ولی در اسپرم نمی­باشد (Ariel et al., 1995). همچنین عامل تنظیم کاهشی Xist یک ncRNA کننده­ی دیگری به نام Tsix می­باشد که آنتی­سنس Xist نامیده می­شود. این دو ژن در کنار هم بر روی کروموزوم X در ناحیه­ای به نام مرکز غیر فعال سازی X[30] (Xic) قرار گرفته­اند (شکل 7).

در این ناحیه چندین ژن دیگر وجود دارند که در XCI نقش دارند (Arthold et al., 2011). Tsix خود توسط یک ncRNA دیگر به نام Xite و نواحی تکراری DXPas34 کنترل می­شود، و هر دوی آنها در داخل Xic قرار دارند، که این نواحی در اسپرم بسیار بیشتر از تخمک متیله گردیده­اند (Payer and Lee, 2008).

شکل 7- عناصر موجود در مرکز غیر فعال سازی X (Xic). در این شکل، محل و مسیر رونویسی عناصر Xic نشان داده شده است (Payer and Lee, 2008).

Figure 7- Elements of the mouse X-inactivation center (Xic). Diagram depicting the location and transcriptional direction of Xic-elements (Payer and Lee, 2008).

در ناحیه­ی DXPas34 مناطقی برای متصل شدن پروتئین CTCF وجود دارد. اگر این مناطق متیله شوند، اتصال این پروتئین کاهش می­یابد، که نشان دهنده­ی نقش کلیدی و بسیار مهم آن برای تنظیمات اپیژنتیکی در  XCIاست (Chao et al., 2002). اتصال CTCF به نواحی غیر متیله در کروموزوم X فعال باعث می­گردد اولا، CTCF باعث جلوگیری از دسترسی Xist به توالی افزاینده­ی پایین دست آن یعنی DXPas34 ­شود (Chao et al., 2002). به علاوه، DXPas34 به کو­فاکتور CTCF یعنی Yy1 متصل شده و باهم یک کمپلکسی را تشکیل داده که باعث فعال شدن بیان ژن Tsix می­شود (Donohoe et al., 2007). ثانیا، CTCF برای جفت شدن کروموزوم X در اطراف ناحیه­های Tsix و Xite در شروع غیر فعال سازی تصادفی X نیاز است (Xu et al., 2007). در مقابل نقش مهم CTCF بر روی کروموزوم X فعال، CTCF همچنین به پروموتور Xist در Xi متصل شده و باعث فعال شدن آن می­شود (Pugacheva et al., 2005). در مجموع، CTCF به عنوان یک تنظیم کننده­ی چند منظوره در هر دو کروموزوم X فعال و غیر فعال می­باشد، و به عنوان یک فاکتور ترجمه کننده­ی اطلاعات نقشه گذاری با استفاده از توانایی آن در خواندن نشانه­های متیلاسیون محسوب می­گردد.

 کشف نقش CTCF در ایجاد ارتباط بین متیلاسیون و پیرایش متفاوت (Alternative splicing)

در سال­های اخیر توجه به ارتباط بین ساختار­های DNA و پیرایش mRNA های اولیه در حال افزایش است. بیش از 90% از ژن­های انسان تحت پیرایش متفاوت قرار گرفته و از هر mRNA اولیه دو یا چندین شکل متفاوت از  ­mRNA بالغ تولید می­شود (Pan et al., 2008)، و اختلال در این فرآیند با ایجاد چندین بیماری مختلف همراه است (Tazi et al., 2009). پردازش mRNA اولیه ژن CD45 یک مدل مناسب برای مطالعه فرآیند تنظیمی اسپلایسینگ متفاوت در یوکاریوت­ها می­باشد. در این ژن با توجه به مرحله نمو لیمفوسیت­ها[31] نحوه­ی اسپلایسینگ در اگزون 4 تا 6 آن متفاوت می­باشد، به طوری که در لمفوسیت­های ابتدایی شکل طویل­تر ژن که دارای اگزون 4 است بیان شده، و در لمفوسیت­های تمایز یافته­ی کامل، کوتاه­ترین شکل ژن که فاقد سه اگزون هستند بیان می­گردد. داخل اگزون 5 دارای جایگاه اتصال برای پروتئین CTCF می­باشد، که این جایگاه اتصال با توجه به مرحله نمو لمفوسیت­ها دارای الگوهای متیلاسیون متفاوتی هستند. با متیلاسیون جایگاه اتصال CTCF دیگر این پروتئین قادر به اتصال نبوده که این امر با افزایش سرعت رونویسی از ژن CD45 همراه است. در این شرایط یک فاکتور تنظیم اسپلایسینگ به نام ریبونوکلئو پروتئین نامتجانس L-شکل heterogeneous ribonucleoprotein L-like (hnRNPLL))) به اگزون­های 4 و 6 mRNA اولیه­ی در حال رونویسی متصل شده که در نهایت باعث حذف اگزون 4 تا 6 آن می­شود. هنگامی که جایگاه اتصال CTCF غیر متیله باشد، این پروتئین به این جایگاه متصل شده و از رونویسی سریع آن جلوگیری کرده و در این شرایط فاکتور تنظیمی hnRNPLL تنها به اگزون 4 متصل شده و در نهایت اگزون 5 آن در mRNA بالغ باقی می­ماند (شکل 8) (Shukla et al., 2011).

اگرچه مطالعه­ی عملکرد CTCF بیشتر به فعالیت خارج ژنی محدود بوده، اما یافته­ها نشان از وجود حدود 45-40% جایگاه اتصال در داخل ژن می­دهند (Jothi et al., 2008). بنابراین پیشنهاد می­شود که، جایگاه­های اتصال داخل ژنی CTCF باعث تأثیر در فرآیند پیرایش mRNA های اولیه می­شود. با این یافته بسیار مهم دو عقیده نقض شده است. اولی این است که، تا این زمان CTCF تنها در بین ژن­ها فعال بوده و در داخل ژن نقشی نداشت. دوم این که، این روش تنظیمی پیرایش نشان داد که متیلاسیون DNA بر خلاف روش­های تنظیمی شناخته شده­ی دیگر با استفاده از جلوگیری از اتصال CTCF باعث برداشتن مانع رونویسی آنزیم پلیمراز می­شود (Kornblihtt, 2012).

نقش CTCF در برقراری مجدد تنظیمات اپیژنتیکی[32]

در نمو طبیعی یا در برخی حالت­های بیماری، برخی از سلول­ها تحت برقراری مجدد تنظیمات اپی ژنتیکی قرار می­گیرند، که شامل برداشت تنظیمات اپی ژنتیکی به همراه برقراری مجدد اما متفاوت آن است. این تغییرات به طور ویژه­ای پس از لقاح اتفاق می­افتد، در این زمان بسیاری از تنظیمات اپی ژنتیکی گامت­ها پاک شده و با تنظیمات اپی ژنتیکی که برای مراحل ابتدایی نمو رویان مهم است، جایگزین می­شود. (Morgan et al., 2005). این مرحله ابتدایی نمو بسیار حساس بوده و به شدت تحت تاثیر عوامل محیطی قرار می­گیرند. این امر موجب شده تا رویان­های تولیدی در شرایط in vitro نسبت به رویان­های in vivo دارای کیفیت کمتری باشند (Wrenzycki et al., 2007). همچنین کیفیت رویان­های نموی در محیط­های مختلف در شرایط in vitro، متفاوت می­باشد (Zahmatkesh et al., 2013)، که این تفاوت را می­توان در تغییر الگوی بیان ژنهای مهم نموی مشاهده نمود (Wrenzycki et al., 2007).

شکل 8- مدل پیرایش متفاوت ژن CD45. (A) متیلاسیون اگزون 5 DNA از اتصال CTCF جلوگیری می­کند، که با عدم وجود مکث در کارRNA  پلیمراز II همراه است. با رونویسی سری اگزون 5  از mRNA بالغ حذف شده، حذف اگزون 4 و 6 با استفاده از اتصال hnRNPLL به این دو اگزون در pre-mRNA انجام می­شود (B) با نبود متیلاسیون، اتصال CTCF به اگزون 5 صورت گرفته و و باعث ایجاد مانع برای رونویسی Poll II شده که از اگزون 5 محافظت کرده و موجب حضور آن در RNA بالغ می­شود. اگزون­های 4 و 6 نیز توسط hnRNPLL از mRNA بالغ حذف می­شوند (Kornblihtt, 2012).

Figure 8- Model for the regulation of CD45 alternative splicing. (A) Methylation of exon 5 DNA prevents binding of CTCF. In the absence of internal pauses, fast elongation promotes exclusion of exon 5 from mature mRNA. Exclusion of exons 4 and 6 is promoted by binding of hnRNPLL to these exons in the pre-mRNA. (B) In the absence of methylation, CTCF binds to exon 5 DNA and creates a transient roadblock to pol II elongation that favors exon 5 recognition at the pre-mRNA level and its inclusion into mature mRNA. Inclusion of exons 4 and 6 remains inhibited by hnRNPL binding (Kornblihtt, 2012).

برقراری مجدد دیگری نیز در سلولهای زاینده اولیه (PGCs) اتفاق می­افتد، که نقشه گذاری­های والدینی در آنها پاک شده و توانایی توتیپوتنسی در آنها ایجاد می شود. این سلولها که تحت تنظیمات مجدد اپی ژنتیکی قرار گرفته­اند قادر به تمایز به دیگر سلولها هستند. بنابراین در طی چرخه­ی زندگی برقراری مجدد تنظیمات اپی ژنتیکی در طی دو مرحله اجرا می­شود که شامل گامتوژنز و پیش از لانه گزینی رویان، است (Morgan et al., 2005).

حدود 15700 ژن در طی مراحل پیش از لانه گزینی موش، به صورت یک الگوی منظم بیان می­شوند. با این وجود تعداد بسیار کمی از این ژن­ها ممکن است از نظر بیولوژیکی مهم باشند، و احتمالا در تنظیم بیان ژن­ها و یا در مسیر­های علامت دهی نقش دارند (Wrenzycki et al., 2005).

پروتئینCTCF از طریق مکانیسم­های تنظیمی مهم مرتبط با اپیژنتیک شامل، جداکننده­ها، نقشه­گذاری و غیرفعال سازی کروموزوم X نقش غیر قابل انکاری در برقراری این تنظیمات دارا می­باشد(Ohlsson et al., 2001). علاوه بر نقش بسیار مهم این ژن در تنظیم بیان چندین ژن مؤثر در فرآیند نمو، مانند Igf2/H19 و یا ژن­های Hox، وظایف دیگر این ژن در بسیاری از فرآیند­های نمو گوناگون مشخص گرید (Herold et al., 2012). مطالعات بیشتر به همراه تحلیل­های انجام شده بر روی این پروتئین نشان از یک نقش اساسی در ایجاد ساختارهای کروماتینی دارد که به نظر می­رسد به عنوان یک عامل توارثی در تنظیم مکانیسم اپی‌ژنتیکی بوده، و باعث ایجاد ارتباط بین متیلاسیون DNA، ساختار­های سطح بالاتر کروماتینی و تفاوت بیان ژن­های سلول­های مختلف می­گردد (Phillips and Corces, 2009). در موجود بالغ الگوی بیان و تغییرات پس از ترجمه­ این ژن در سلول­های مختلف متفاوت می­باشد، که این نشان از نقش مهم این ژن در ایجاد و نگهداری تمایز سلول­ها دارد (Torrano et al., 2005). در یک آزمایش برای بررسی نقش CTCF از موش­های ترانس­ژنتیک که از طریق مکانیسم RNAi میزان پروتئین CTCF را کاهش داده بودند، استفاده شد. این آزمایش نشان داد که در غیاب این پروتئین باعث افزایش متیلاسیون در ناحیه­ی ICR ژن H19 شده، که نشان دهنده­ی نقش حفاظتی این پروتئین در برابر متیلاسیون در طی رشد و تشکیل تخمک می­باشد. همچنین این تحقیق نشان داد که این پروتئین برای رشد طبیعی در طی پیش از لانه­گزینی ضروری می­باشد (Fedoriw et al., 2004). آنالیز آماری میکرو­اری[33] (SAM) که بین موش­های ترانس­ژن CTCF و موش­های غیر ترانس­ژن انجام گرفت، 1590 ژن افزایش بیان و 2282 ژن کاهش بیان نشان دادند. تعداد بسیار زیادی از این ژن­ها نقش مهمی در رشد رویان دارند، و نشان از این حقیقت است که اشکال در بیان این ژن باعث تأثیر بر روی مراحل بعدی نمو رویان می­گردد (Wan et al., 2008). در تحقیق دیگر که از موش­های ناک­اوت[34] شده، به طوری که توالی ژن CTCF آنها بر روی کروموزوم تغییر داده شده و بدین ترتیب پروتئین CTCF غیر طبیعی تولید می­کردند، استفاده شد. موش­های دارای ژنوتیپ CTCF(+/-) کاملا طبیعی بوده اما موش­هایی که در هر دو آلل ناک­اوت شده بودند ( (CTCF(-/-) قادر به لانه گزینی نبوده و در روز­های 5/4 و 5/5 رویانی و پس از تشکیل بلاستوسیست از بین می­روند. توانایی رشد موش­های CTCF(-/-) تا مرحله بلاستوسیست به دلیل وجود mRNA و پروتئین CTCF منبع مادری بوده که به تدریج تا مرحله بلاستوسیست تهی می­گردد (Moore et al., 2012). در تحقیقی دیگر، تغییرات بیان این ژن در طی مراحل پیش از لانه گزینی (از قبل بلوغ تا بلاستوسیست) مورد بررسی قرار گرفت. این تحقیق نشان داد که میزان mRNA در مرحله بلوغ نسبت به قبل از بلوغ به طور معنی داری کاهش می­یابد، اما در مراحل بعدی یعنی 2، 4،16-8 سلولی و بلاستوسیست میزان بیان نسبت به قبل بلوغ افزایش یافته است. این تغییرات بیان نشان از اهمیت پروتئین CTCF در مراحل ابتدایی دارد، به طوری که بلافاصله بعد از باروری بیان آن آغاز می­شود. شروع بیان ژن CTCF از ژنوم رویان و تغییر منبع CTCF از مادری به رویانی در مرحله دو سلولی با زمان فعال شدن کوچک ژنوم رویان گاو همراه می­باشد. علاوه بر این یک افزایش بیان نیز پس از مرحله 8 سلولی که با فعال شدن بزرگ ژنوم رویان گاو همراه است، مشاهده می­شود، اما این افزایش خیلی نبوده و مقدارش نسبتا کم است. همان طور که گفته شده است، پس از لقاح تخمک یک دمتیلاسیون سراسری ژنوم در گاو اتفاق می­افتد که تا مرحله بلاستوسیست ادامه دارد. احتمالا با افزایش در دمتیلاسیون میزان جایگاه­های اتصال برای پروتئین CTCF نیز افزایش یافته که نیاز به پروتئین CTCF بیشتری جهت اتصال به این جایگاه­های دمتیله می­باشد. به نظر می­رسد این افزایش بیان باعث افزایش در میزان پروتئین CTCF در رویان شده، بنابراین افزایش نیاز به این پروتئین مرتفع می­شود (Amiri-Roudbar, 2012).

نتیجه­گیری

شواهد نشان از نقش فراگیر CTCF در برقراری ارتباطات تنظیمی درون و بین کروموزومی دارد (Botta et al., 2010). با توجه به تغییر در مطالعات ژنومی به یک الگوی سه بعدی، به نظر میرسد که عملکردهای تنظیم ژنی CTCF که در دیگر فاکتورها نیز متداول است مانند نقش­های که در فعال و بازدارنگی بیان، جداکننده­ای و نقشه­گذاری دارد در برابر نقش این پروتئین در سازمان ­دهی سراسر ژنوم در درجه­ی دوم اهمت قرار گیرد (Phillips and Corces, 2009). نقش CTCF در تنظیمات ژنومی چنان گسترده است که می­توان یک الگوی تنظیمی کد-CTCF برای این پروتئین در نظر گرفت. به طوری که این کد-CTCF در هرجایگاه اتصال CTCF ساختار فضایی مختص به آن ناحیه را فراهم می­کند (Ohlsson et al., 2010; Phillips and Corces, 2009). یافته­های جدید نشان دادند که، CTCF عملکرد خود را از طریق ایجاد ارتباطات با دامنه­ی وسیع با توجه به نوع سلول انجام می­دهد. با وجود مطالعات گسترده طی دو دهه­ی گذشته، هنوز توضیح نقش این پروتئین در نمو و تمایز سلولی در مراحل اولیه می­باشد. با توجه به جایگاه­های بسیار زیاد اتصال برای CTCF و قرار گرفتن حدود 45% از این جایگاه­ها در داخل ژن­ها،  کشف نقش این پروتئین در پیراش متفاوت mRNA پنجره­ای جدید برای بررسی تنظیم ژنومی در نواحی اتصالی که در محدوده­ی داخل ژن­ها قرار گرفته فراهم شده است (Kornblihtt, 2012).

همچنان سوالات مهم زیادی درمورد چگونگی عملکرد این پروتئین بدون پاسخ مانده است. مشخص کردن ساختار سه بعدی نواحی ZFs موجب فهم بهتر از چگونگی استفاده از شکل فضایی CTCF و ZFs آن در اتصال به توالی­های متفاوت می­شود. دانستن این مطلب می­تواند ما را در درک بهتری از، خصوصیات مختص جایگاهی، ارتباط بین ساختار فضایی CTCF، تغییرات پس از ترجمه­ای که بر روی پروتئین­ها رخ می­دهد، همکاری با پروتئین­های تنظیمی دیگر، و چگونگی ارتباطات کروماتینی، یاری نماید (Phillips and Corces, 2009). تمام یافته­ها نشان می­دهند که CTCF می­تواند به عنوان یک استاد بافنده_­ی ژنومی در ایجاد ساختارهای سه بعدی تنظیمی ژنوم، در درون هسته­ی سلول­های پستانداران عمل کند.