Detection of Copy number variation in Holstein cattle genome by using 50K

بررسی تنوع ساختار کروموزومی در ژنوم گاو­های هلشتاین با استفاده از بسته نشانگری 50K

مریم نصرتی*1، مجتبی طهمورث­پور²، محمد­رضا نصیری³

¹ دانشجوی دکتری رشته ژنتیک و اصلاح نژاد دام گروه علوم دامی، دانشکده کشاورزی، دانشگاه فردوسی مشهد.

² استاد رشته ژنتیک و اصلاح نژاد دام گروه علوم دامی، دانشکده کشاورزی، دانشگاه فردوسی مشهد.

³ دانشیار رشته ژنتیک و اصلاح نژاد دام گروه علوم دامی، دانشکده کشاورزی، دانشگاه فردوسی مشهد

تاریخ دریافت: 16/07/1391، تاریخ پذیرش: 30/04/1392

چکیده

تنوع ساختار کروموزومی در مکانیزم­های بیولوژیکی از اهمیت خاصی برخوردار است. به منظور تعیین تعداد و توزیع این تنوع در ژنوم سه کروموزم 6، 14 و 20 که حضور جایگاه صفات کمی موثر بر تولید در آن تایید شده است٬ مورد بررسی قرار گرفت. به این منظور از 580 راس گاو هلشتاین نمونه خون گرفته شد و پس از استخراج DNA٬ تعیین ژنوتیپ با استفاده از بسته نشانگری 50K گاوی شرکت ایلومینا صورت گرفت. پس از تصحیح داده­ها برای شدت سیگنال و نواحی غنی از GC، تعداد 383 نمونه برای آنالیز نهایی باقی ماند. داده­ها بر اساس اسمبلی UMD3.1 ژنوم گاو برای کروموزم­های 6، 14 و 20 آنالیز شد. پس از اعمال کلیه فیلترها تعداد 199 تنوع ساختار کروموزومی (132 حذف و 67 اضافه) با متوسط 5/0 برای هر فرد و میانگین طول kb 3/147 و میانه kb 4/139 شناسایی شد. نسبت حذف به اضافه برابر با 97/1 و کروموزم­های 6 و 20 به ترتیب دارای بیشترین و کمترین تنوع ساختار کروموزومی بودند. آنالیز­های بیوانفورماتیکی مشخص نمود که 77 ژن با این نواحی تنوع ساختار کروموزومی در ارتباط هستند. نتایج این پژوهش نشان داد تنوع ساختار کروموزومی بخش قابل توجهی از این سه کروموزم که حاوی تعداد قابل توجهی جایگاه صفات کمی هستند را پوشش می­دهد. به دلیل اثر این تنوع بر ایجاد تغییر در ساختار و دز ژن­ها، به نظر می­رسد تنوع ساختار کروموزومی می­تواند بر واریانس فنوتیپی صفات کمی موثر باشد لذا احتمالا این تنوع قابلیت استفاده در برنامه­های اصلاح­نژادی را دارد.

کلید واژه: گاو هلشتاین، تنوع ساختارکروموزومی، جهش تک نوکلئوتیدی، ژنوم.

مقدمه

گونه گاو در حدود 10000 سال پیش در مناطقی از آسیا و خاور نزدیک اهلی شد (Gotherstrom et al. 2005). بدلیل اهمیت آن در تولید شیر، گوشت و فعالیت­های کشاورزی مطالعه برای پرورش و اصلاح­نژاد آن گسترش یافت. ژنوم گاو از 29 جفت کروموزوم اتوزوم و یک جفت کروموزوم جنسی تشکیل شده است که در حدود Gbp 87/2 طول دارد. تاکنون 22000 ژن در آن شناسایی شده است (Bae et al 2010). بر اساس مطالعات مختلف، جایگاه بسیاری از صفات کمی[1] مانند رشد، تولید شیر و ترکیب آن و ماربلینگ روی کروموزوم 14، 6 و 20 شناسایی شده است (Plante et al, 2001; Miyata et al, 2007; Mehar et al, 2004  Marques et al, 2008;). لذا مطالعه روی تنوع ژنومی در این کروموزم­ها از اهمیت خاصی برخوردار است.

انواع تنوع ژنومی شامل حذف، اضافه، جایگزینی، بازترتیبی، معکوس­شدن و تنوع ساختار کروموزومی^[2] (CNV) است (liu 2011). تنوع ساختار کروموزومی شامل حذف، اضافه یا دو برابر شدن قطعه­ای از DNA به طول kb 1 تا چندین مگا جفت باز است. مطالعات نشان می­دهد که این تنوع می­تواند منجر به تغییر در دز ژن، توالی­های کد کننده و تنظیم بیان ژن شود (Aboura et al 2009). لذا تاثیر آن بر تنوع فنوتیپی بیش از جهش­های تک نوکلئوتیدی می­باشد (Li et al, 2010). در پستانداران این تنوع % 5-4/0 کل تنوع ژنوم را شامل می­شود (Fontanesi et al, 2010). اولین مطالعات بر روی تنوع ساختار کروموزومی در انسان و در سال 2006 صورت گرفت (Roden et al. 2006) از آن زمان تاکنون 29000 تنوع ساختار کروموزومی در انسان شناسایی شده است که 9000 مورد آن در نزدیکی یا داخل یک ژن قرار دارند (Conrad et al, 2009; Redon et al, 2006 ). ٪12 تنوع ژنوم انسان مرتبط با تنوع در ساختار کروموزومی است و تقریبا˝40 درصد این ساختار­ها حداقل با یک ژن همپوشانی دارد (Li et al 2010). به علاوه، این نوع تنوع با بیماری­های از قبیل شیزوفرنی، دیابت نوع اول و سرطان و ... مرتبط است (Kijas et al 2011; Hastings et al, 2009; Mills et al 2011 ). با این حال، مطالعه روی نحوه گسترش، توزیع و نقش تنوع ساختار کروموزومی در حیوانات اهلی در مراحل ابتدایی است. این امر می­تواند به دلیل کمبود ابزار­های ژنومی در حیوانات اهلی باشد. اولین مطالعه برای شناسایی تنوع ساختار کروموزومی گاو توسط Liu et al. (2008) با روش aCGH[3] صورت گرفت. آنها توانستند 25 تنوع ساختار کروموزومی را در سلول­های جنسی شناسایی کنند (Liu et al 2008). پس از آن مطالعات روی سایر حیوانات مزرعه­ای مانند جوجه گوشتی(Wang et al 2010)، گوسفند (Fontanesi at al 2011) و بز (Fontanesi et al 2010) صورت گرفت. با توسعه تکنولوژی، ساخت چیپ­های شناسایی جهش­های تک نوکلئوتیدی ژنوم، شناسایی تنوع ساختار کروموزومی با دقت و سرعت بیشتری انجام گرفته است.

مطالعات اخیر نشان می­دهد تنوع ساختار کروموزومی با تنوع فنوتیپی برخی صفات مرتبط است. مثلا˝ تاج نخودی در طیور ناشی از تنوع ساختار کروموزومی در اینترون یک ژن SOX5 می­باشد (Wright et al 2009). در گوسفند دو برابر شدن در ژن ASIP منجر به تنظیم رنگدانه در پوشش بدن می­شود (Norris and Whan, 2008). رنگ سفید غالب در پوشش بدن خوک ناشی از دو برابر شدن در ژن Kit می­باشد (Giuffra et al, 2002). تاخیر در پر درآوری جوجه­ها به دلیل دوبله ناقص در ژن­های PRLR و SPEF2 می­باشد (Elferink et al, 2008). دو برابر شدن kb 6/4 در اینترون 6 ژن stx17 منجر به خاکستری شدن رنگ بدن در اسب با افزایش سن می­شود(Rosengren et al, 2008). حذف ناحیه بین ژنی بطول kb 7/11 در ژنوم بز منجر به حذف شاخ می­شود (Pailhoux et al, 2001). با توجه به پوشش قابل توجه این تنوع در ژنوم و اثر آن بر تنوع فنوتیپی برخی صفات، اهمیت مطالعه بیشتر روی این نوع تنوع آشکارتر می­شود. در این پژوهش تنوع ساختار کروموزومی در 580 گاو هلشتاین با استفاده از بسته نشانگری 50K گاوی روی کروموزوم­های 6، 14 و 20 مورد بررسی قرار گرفت.

مواد و روشها

نمونه­گیری و تعیین ژنوتیپ

نمونه خون از 580 گاو نر هلشتاین دارای شجره از موسسه[4]ANAFI تهیه شد. استخراج DNA از خون با استفاده از کیت Wizard® Genomic DNA Purification kit (Promega Corporation, Madison, WI) در آزمایشگاه ژنتیک مرکز ژنومیک حیوانات اهلی، دانشگاه بولونیا کشور ایتالیا انجام شد. در این پژوهش بسته نشانگری 50K گاوی نوع دو شرکت ایلومینا[5] (Illumina, Inc.,USA) برای تعیین ژنوتیپ 54604 SNP در سراسر ژنوم استفاده شد. چیپ مورد نظر بر مبنای پروتکل Infinium HD Assay شرکت ایلومینا طراحی شده است. مفهوم Infinium بر اساس هیبریداسیون مستقیم قطعات کل ژنوم به پرایمر­های 50 مری متصل به آرایه دانه[6] می­باشد (and Gunderson, 2007 Steemers). نمونه­های DNA با غلظت ng 400- 200 با محلول 1/0 نرمال NaoH دناتوره شده و سپس با محلول MA2 (کیت ایلومینا) خنثی شده تا برای تکثیر آماده شود. در مرحله بعد محلول MSM[7] که حاوی مستر میکس است به DNA اضافه شده و سپس پلیت در آون هیبریداسیون در دمای C° 37 به مدت 24-20 ساعت انکوبه شد تا تکثیر صورت گیرد. این روش موجب تکثیر DNA بطور یکنواخت تا چندین برابر و بدون اریب (خطا) خواهد شد. DNA توسط سیستم آنزیمی تحت کنترل به قطعات کوچکتر بریده شد. DNA هضم شده با 2-پروپانول 100% مخلوط و با سانتریفیوژ در دمای 4 درجه سانتیگراد رسوب داده شد و دوباره با محلول بافر هیبریداسیون سوسپانسیون شد. در مرحله بعد نمونه های DNA برروی Beadchips قرار داده شد و به مدت 24-16 در دمای 48 در آون هیبریداسیون نگهداری شد. در این مرحله از طریق سیستم مویرگی موجود در اطراف چیپ و تزریق محلول­های هیبریداسیون، ابتدا DNA دناتوره شده و سپس هیبرید می­شود. پس از هیبریداسیون، شستشو Beadchips برای حذف DNA هیبرید نشده انجام شد. نمونه­ها برای بسط تک بازی و رنگ آمیزی آماده شد. به دلیل اینکه طول پرایمر­های (یک جفت) متصل به آرایه دانه تا یک نوکلئوتید قبل از محل جهش است پس از اتصال DNA تک رشته (بعنوان الگو) به پروب 50 مری (بعنوان پرایمر)، بسط تک بازی در انتهای ˊ3 پروب انجام می­شود. بدین منظور محلول TEM در اطراف Beadchips رها شده تا با استفاده از نوکلئوتید­های نشاندار (فلورسنس) تکثیر صورت گیرد. در این محلول A و T به رنگ قرمز و C و G به رنگ سبز نشاندار شده است. پس از این مرحله DNA الگو توسط محلول فرمامید %95 بر 1 میکرومول EDTA حذف شد. در این حالت پرایمر بسط یافته متصل به آرایه دانه، تحت فرآیند­های مختلف انجام گرفت تا برای اسکن آماده شود. Beadchips با استفاده از iScanReader  یا Bead Array reader تحت لیزر قرار گرفت تا فلورسنس تک باز انتهای پرایمر­های بسط داده شده در آرایه دانه برانگیخته شود. اگر لوکاس مورد نظر فاقد جهش ( A/T یا C/G ) باشد رنگ قرمز یا سبز ساطع می­کند اما اگر جهش صورت گرفته باشد یعنی در مقابل A مثلا C باشد رنگ زرد (ترکیب قرمز و سبز ) ساطع می­گردد. نور ساطع شده ثبت شد و داده­ها بدست آمده از این تصویر با Illumina’s BeadStudio v1.0 تصحیح شد. بدین معنی که گراف تشکیل شده از SNP ها برای کلیه نمونه­ها کنترل شد و دسته بندی[8] و نرمال سازی[9] داده­ها انجام گرفت. بر اساس مطالعات  Diskin et al. (2008) گاهی در هنگام هیبریداسیون بدلیل نوسان در غلظت DNA نمونه­های مختلف و محتوی GC متفاوت، اتصال پروب­ها بطور یکنواخت صورت نمی­گیرد این پدیده را امواج ژنومیکی[10] می­نامند که بر بازخوانی ژنوتیپ­ها اثر می­گذارد. این پدیده احتمالا˝ بر صحت تعیین تنوع ساختار کروموزومی نیز موثر است. بدین منظور GenCall Score نمونه­ها بررسی شد. این پارامتر که توسط BeadStudio بدست می­آید یک کمیت متریک برای نشان دادن قابلیت اطمینان[11] ژنوتیپ­های خوانده شده است که حد آستانه آن 15/0 است. ژنوتیپ­ها با GenCall Score کمتر از 15/0 بدلیل عدم اطمینان در تعیین ژنوتیپ صحیح حذف شد. پس از حذف نمونه­ها ناصحیح 472 نمونه باقی ماند که پس از انتخاب آیتم­ها مورد نیاز برای محاسبه CNV، فایل شدت سیگنال در فرمت متنی که همان فایل ورودی نرم افزار PennCNV است تهیه شد. کلیه مراحل تعیین ژنوتیپ با استفاده از کیت شرکت ایلومینا و براساس پروتکل Infinium HD Assay انجام شد. اطلاعات بیشتر در وب سایت شرکت ایلومینا (http://www.illumina.com) در دسترس می­باشد.

آنالیز با PennCNV و کنترل کیفیت

نرم افزار­های متعددی برای شناسایی تنوع ساختار کروموزومی بر اساس داده­های SNP وجود دارد. متداول­ترین آنها PennCNV می­باشد که از طریق وب سایت http://www.neurogenome.org/cnv/penncnv قابل دسترسی می­باشد. فایل ورودی نرم افزار PennCNV که همان فایل شدت سیگنال[12] است، حاوی اطلاعات نام SNP و موقعیت آن، پارامتر­های لگاریتم نسبت شدت سیگنال[13] (LRR) و نسبت شدت سیگنال نسبی دو آلل SNP[14] (BAF) می­باشد. با توجه به نحوه تعیین ژنوتیپ SNP­ها، از شدت سیگنال ساطع شده آلل A و B (مقادیر  X و Y) برای تهیه فایل­های LRR و BAF استفاده می­شود. به این ترتیب که  LRR کل شدت سیگنال نرمال شده برای هر دو آلل SNP می­باشد که در زمان حذف، کاهش و در زمان اضافه شدن، افزایش می­یابد. نحوه محاسبه آن به این صورت است اگر X + Y = R باشد آنگاه (R_expected / R_observed ) Log₂= LRR است که R_expected از طریق درون­یابی خطی دسته­های ژنتیکی SNP نمونه­ها به دست می­آید.  BAF نرمال شده، نسبت شدت سیگنال نسبی آلل A و B است که از طریق محاسبه (π/2) / (Y/X) arc-tan = θ به دست می­آید. در شروع آنالیز، فایل شدت سیگنال ورودی به فایل­های کوچکتر شکسته شد که هر فایل حاوی اطلاعات فوق برای هر فرد به طور مجزا است. فایل فراوانی آللی B در جمعیت (PFB) بر اساس BAF هر مارکر در جمعیت محاسبه شد. محل و موقعیت SNP ها روی کروموزم از فایل PFB اخذ می­شود لذا در صورت تغییر در اسمبلی ژنوم تعیین محل جهش­ها به راحتی امکان پذیر است. فایل GC مدل بر اساس محتوی GC یک مگا جفت باز از ژنوم ساخته شد. فایل HMM مدل HMM[15] را برای نرم افزار PennCNV فراهم می­کند و مقدار شدت سیگنال مورد انتظار برای CNV­های مختلف را به برنامه القاء می­کند. با توجه به اینکه مدل HMM برای همه ژنوم­ها تقریبا یکسان است از فایل hh550.hmm که برگرفته از پانل Illumina HumanHap550 انسانی است استفاده شد. به این ترتیب تنوع ساختار کروموزومی با استفاده از مدل زنجیره مارکوف در نرم افزار PennCNV محاسبه شد (Wang et al, 2007). پارامتر cn[16] گزارش شده توسط نرم­افزار PennCNV در کروموزوم اتوزوم برای نواحی که فاقد تکرار هستند برابر 2 (موجود دیپلوئید) برای نواحی که حذف صورت گرفته برابر 1 یا صفر بسته به میزان حذف و برای نواحی دو یا سه برابر شده معادل به ترتیب 3 و 4 است. پس از محاسبه تنوع ساختار کروموزومی فیلتر­های کنترل کیفیت نرم­افزار PennCNV اعمال شد. نمونه­های با انحراف استاندارد LRR کمتر از 03/0، BAF برابر با حداقل 01/0 و waviness factor value بین 05/0 تا 05/0- انتخاب شدند. تصحیح برای محتوی GC با استفاده از فایل GC مدل انجام شد. پس از اعمال فیلتر­های مورد نظر تعداد 383 نمونه باقی ماند. داده­ها بر اساس اسمبلی UMD3.1 ژنوم گاو برای بررسی تنوع ساختار کروموزومی سه کروموزم 14، 6 و 20 آنالیز شد.

ارزیابی نواحی تنوع ساختار کرموزومی

به منظور تایید نواحی شناسایی شده, چهار ناحیه تنوع و یک ناحیه کنترل انتخاب و آزمایش Quantitative PCR در سه تکرار و پنج نمونه برای هر CNVR انجام شد. ناحیه کنترل قسمتی از ژن RPP30 روی کروموزم 26 گاوی (bp 12893408-12893277) بود که در مطالعات انسانی بعنوان ژن مرجع در نظر گرفته شده است (Wang et al 2010) و در مطالعات مختلف بر روی ژنوم گاو تاکنون تنوع ساختار کروموزومی در این ناحیه شناسایی نشده است (Liu et al 2010; Bae et al 2010; Fadista et al 2010) در مطالعه Seroussi et al. (2010) برای بررسی تنوع ساختار کروموزومی ژنوم گاو این ناحیه بعنوان ژن مرجع برای آزمایش PCR کمی در نظر گرفته شده است. پرایمر­ها با نرم افزار Primer version 3.0 برای نواحی مورد نظر طراحی شد که طولی کمتر از kb 150 داشت (جدول 4). شرایط واکنش به شرح ذیل بود: 2 میکرولیتر DNA، 10 میکرولیتر محلول X 2 UltraSYBR، 4/0 میکرولیتر پرایمر­های رفت (X 10) و 4/0 میکرولیتر پرایمر­های برگشت (X 10) در حجم نهایی 20 میکرولیتر در شرایط دمایی 10 دقیقه C°95 در 40 سیکل PCR با مراحل C°95 بمدت 15 ثانیه، C°60 بمدت یک دقیقه تکرار شد. پرایمر­ها با منحنی دمای ذوب برای بررسی حضور دایمر پرایمر کنترل شد. آنالیز­های PCR کمی با روش ∆∆C_t انجام شد. متوسط C_tبرای نمونه­هایهدف (سه تکرار) محاسبه شد و ∆C_t نمونه هدف از اختلاف متوسط C_t هر ناحیه تنوع در نمونه­های که حضور تنوع در آن از طریق نرم افزار PennCNV تایید شده است با ناحیه ژن مرجع به­دست آمد. ∆C_t نرمال از اختلاف متوسط C_t در ناحیه مورد نظر در نمونه­ای فاقد تنوع و ناحیه ژن مرجع محاسبه شد. ∆∆C_t از اختلاف بین ∆C_t نمونه­های هدف و∆C_t نمونه­های نرمال محاسبه شد. کمیت نسبی از رابطه ^-∆∆ct2 بدست آمد. نرم افزار PennCNV تعداد کپی­ها را بر اساس موجود دیپلوئید (که دارای یک جفت کرموزم همولوگ است) محاسبه می کند. لذا، برای این که بتوان نتایج PCR کمی را با نتایج نرم افزار PennCNV مقایسه کرد بایستی مقدار کمیت نسبی بدست آمده از آزمایش PCR کمی را در عدد 2 ضرب کرد. از این رو تعداد کپی هر ناحیه مورد آزمون از رابطه ^-∆∆ct2 * 2 یا ^1+∆∆ct2 محاسبه شد. برای اطلاعات بیشتر به راهنمای نرم افزار PennCNV به قسمت مربوط به نحوه محاسبه تنوع ساختار کروموزومی در موجود دیپلوئید توسط نرم افزار (De novo CNV ) مراجعه نمائید

نتایج و بحث

شیوه­های متعددی برای شناسایی تنوع ساختار کروموزومی وجود دارد. از آن جمله می­توان شناسایی بر اساس SNP array ,Comparative Genomic Hybridization (CGH) array وNext-Generation Sequencing را نام برد. در مقایسه با دو روش دیگر روش SNP array ارزان­تر و پوشش وسیع­تر و متراکم­تری در ژنوم دارد (Hou et al, 2012). در این پژوهش از تکنیک SNP array استفاده شد و بررسی­های ذیل انجام شد.

شناسایی تنوع ساختار کروموزومی

پس از اعمال کلیه فیلتر­ها تعداد 199 جایگاه تنوع ساختار کروموزومی با متوسط 5/0 جایگاه برای هر فرد و میانگین طول 3/147 و میانه 4/139 کیلو باز شناسایی شد. از این تعداد 132 مورد حذف صورت گرفت که نسبت حذف به اضافه برابر با 97/1 بود. در بین کروموزوم­ها، کروموزوم 6 بیشترین تنوع و طول ساختار کروموزومی را داشت ولی با توجه به طول کروموزوم­ها, کروموزم 14 دارای بیشترین درصد تنوع ساختار کروموزومی به میزان ٪4/5 بود (جدول 1). اولین مطالعه روی تنوع ساختار کروموزومی ژنوم گاو در سال 2008 با شناسایی 25 تنوع در 16 کروموزوم به روش aCGH انجام شد(liu et al 2008). در سال 2010 در مطالعات Bae et al.  (2010) با استفاده از بسته نشانگری 50K گاوی تعداد 855 تنوع در کل ژنوم گاو شناسایی شد. در مطالعه آنها متوسط و میانه تنوع ساختار کروموزومی به ترتیب 8/149 و 5/171 بود که با نتایج این پژوهش مطابقت داشت. Wang et al. (2010) با روش aCGH تعداد 96 تنوع ساختار کروموزومی در ژنوم طیور شناسایی کردند که 16 مگا جفت باز و معادل %34/1 ژنوم طیور بود که از این 96 تنوع 46 جایگاه در نواحی غیر کد کننده بود. در مطالعه Fontanesi et al (2010) با روش aCGH روی ژنوم بز تعداد 161 تنوع ساختار کروموزومی با متوسط 9/17 تنوع به ازاء هر فرد شناسایی شد. علاوه بر این نتایج این پژوهش نشان داد که تقریبا ٪60 تنوع­ها طولی کمتر از kb 200 داشتند (جدول 2).

جدول 1 - توزیع تنوع ساختار کروموزومی (CNV) در کروموزوم­های 6، 14 و 20 با نرم افزار PennCNV.

Table1-Copy number variation on BTA6, BTA14, BTA20 with PennCNV.

اندازه کروموزم از سایت www.ensembl.org بدست آمد.

جدول 2- توزیع نواحی تنوع ساختار کروموزومی (CNVR) در کروموزوم­های 6، 14 و 20.

Table 2- Copy number variation region (CNVR) distribution on BTA6, BTA14 and BTA20.

اعداد بر اساس درصد می­باشد.

نواحی تنوع ساختار کروموزومی

نواحی تنوع ساختار کروموزومی با استفاده از یکی کردن نواحی از تنوع که با هم همپوشانی داشتند ساخته شد (Redon et al 2006). به طور کلی تعداد 41 ناحیه تنوع ساختار کروموزومی در این مطالعه شناسایی شد که شامل 3/12 مگا جفت باز با میانگین و میانه به ترتیب  kb303 و kb146 بود (جدول 2). این میزان ٪6/0 توالی کروموزوم­های اتوزومی و ٪5/0 کل ژنوم گاو را در بر می­گیرد. بیشترین تعداد و طول نواحی تنوع ساختار کروموزومی روی کروموزوم شش مشاهده گردید. Liu et al. (2010) 200 ناحیه تنوع ساختار کروموزومی با پوشش 07/1 درصد کل ژنوم در نژاد­های مختلف گاو شناسایی کردند که با 400 ژن مختلف همپوشانی داشت. Hou et al. (2011) در بررسی تنوع ساختار کروموزومی گاو، تعداد 682 ناحیه تنوع به طول کلی 8/139 مگاجفت باز (%6/4 ژنوم) شناسایی کردند. در مطالعه Hou et al. (2012) تعداد 3346 ناحیه تنوع ساختار کروموزومی با طول کلی 7/142 مگا جفت باز در اسمبلی Btau_4.0 ژنوم گاو و تعداد 3438 ناحیه تنوع ساختار کروموزومی با طول کلی 9/146 مگا جفت باز در اسمبلی UMD3.1 ژنوم گاو شناسایی کردند که به طور کلی %7/4 کل ژنوم را شامل شد. در مطالعه­ای دیگر روی ژنوم گاو 368 ناحیه تنوع ساختار کروموزومی شناسایی شد (Bae et al 2010). در پژوهش Fontanesi et al (2010) روی ژنوم گوسفند، با روش aCGH، 135 ناحیه تنوع ساختار کروموزومی با طول 8/10 مگا جفت باز شناسایی شد. میزان تنوع شناسایی شده و به طبع طول آن در پژوهش­های مختلف متفاوت است. در واقع تعداد تنوع بستگی به عوامل متعددی از قبیل روش مورد استفاد، تعداد افراد، تعداد کروموزوم­های مورد بررسی و تراکم چیپ مورد استفاده دارد. لذا با توجه به این که در این پژوهش فقط سه کروموزوم مورد بررسی قرار گرفته است تعداد کل تنوع­ها و درصد پوشش ژنوم با سایر مطالعات متفاوت است، اما میانگین و میانه تنوع با سایر مطالعات مطابقت دارد.

ارزیابی نواحی تنوع ساختار کروموزومی

به طور کلی طول ناحیه تنوع ساختار کروموزومی ژنوم گاو در مطالعات مختلف متفاوت است و از kb 32 تا Mb 6/5 متغیر است. مقدار گزارش شده در این مطالعه در داخل این دامنه قرار دارد ( Mb 1- kb 74). Hou et al. (2011) دلیل این تنوع را در استفاده از روش­های مختلف شناسایی تنوع ساختار کروموزومی یعنی aCGH و بسته نشانگری K 50 گاوی اذعان کردند. بسته نشانگری K 50 با تراکم بالای SNP برای مطالعات ارتباطی در ژنوم گاو طراحی شده است، لذا توزیع SNP­ها در همه قسمت­های ژنوم یکنواخت نیست. شناسایی این تنوع با نرم افزار PennCNV نسبت به تراکم پایین SNP­ها و توزیع غیر­یکنواخت آن بخصوص در نواحی حاوی تنوع ساختار کروموزومی حساس است. لذا در اغلب موارد فقط تنوع­های بلند شناسایی می­شود. علاوه­بر­این بسته نشانگری K 50 برخلاف aCGH فاقد پروب اختصاصی برای نواحی تنوع ساختار کروموزومی است. از این رو نتایج پژوهش­های اخیر با مطالعات قبلی (با روش aCGH) متفاوت است و تنوع زیادی بین آنها وجود دارد. به منظور تایید تنوع ساختار کروموزومی از بین 41 CNVR شناخته شده برای چهار ناحیه و یک کنترل، آزمایش PCR کمی انجام شد(جدول 4). برای هر ناحیه از نمونه­ای که تنوع ساختار کروموزومی توسط نرم افزار PennCNV در آن تایید شده بود به عنوان نمونه هدف و در نمونه­هایی که حضور تنوع تایید نشده بود به­عنوان نرمال استفاده شد. حضور تنوع ساختار کروموزومی در CNVR7 روی کروموزوم 20 و CNVR3 روی کروموزوم 14 تایید شد(p<0.05). نتایج واکنش PCR کمی این پژوهش در %50 نواحی، تنوع ساختار کروموزومی را تایید کرد (جدول 5). در مطالعه Fadista et al. (2008) نیز بر روی خوک %50 نواحی تایید شد. این مقدار در مطالعه Hou et al. (2011) در گاو هلشتاین %60 بود که بیشتر از نتیجه این پژوهش می­باشد. همچنین مقدار تایید شده در این پژوهش از مقدار گزارش شده توسط Fadista et al. (2011) (%66) وHou et al. (2012) (%77) در گاو هلشتاین کمتر بود. این کاهش می­تواند به دلیل تعداد کم نواحی انتخاب شده یا به دلیل خطا در برآورد به دلیل پوشش نه چندان متراکم و غیر یکنواخت SNP­ها چیپ مورد استفاده نیز باشد که باعث می­شود طول تنوع­ها بیش­تر از مقدار واقعی برآورد شود.

ارزیابی بیوانفورماتیکی نواحی تنوع ساختار کروموزومی

بررسی بیوانفورماتیکی نشان داد 77 ژن در نواحی تنوع ساختار کروموزومی واقع شده است (جدول3). برخی از این تنوع­ها در نواحی اگزون ژن قرار داشت. بسیاری از مطالعات حضور تنوع ساختار کروموزومی را در نواحی ژنی تایید می­کند(Kijas et al, 2011; liu et al, 2008; liu et al, 2010; Fadista et al, 2010 ). در مطالعه liu et al. (2010) 400 ژن در نواحی تنوع ساختار کروموزومی شناسایی شد که اغلب آنها با صفات بیولوژیکی مهمی از قبیل تولید شیر، ایمنی زایی و تولید مثل در ارتباط بودند. Fadista et al. (2010) تعداد 304 ناحیه تنوع ساختار کروموزومی در ژنوم گاو شناسایی کردند که %30 آنها با ژن­های پاسخ به محیط همپوشانی داشتند. برخی از ژن­ها شناسایی شده در این پژوهش در مطالعات مختلف به عنوان ژن کاندیدا در تولید و رشد شناسایی شده­اند. به عنوان مثال ژن تیروگولوبولین (TG) روی کروموزوم 14 قرار دارد. مطالعات نشان می دهد برخی ژنوتیپ­های آن منجر به افزایش سطح ماربلینگ عضله در گاو­های گوشتی می­شود (Anton et al, 2008; Fortes et al., 2009). ژن دی­آسیل گلیسرول آسیل­ترانسفراز 1 (DGAT1) که بر روی کروموزوم 14 قرار دارد ارتباط معنی­داری با ترکیب شیر و کیفیت آن دارد (Strucken et al, 2010; Marques et al 2011; Bouwman et al, 2011). با توجه به همپوشانی این نوع تنوع با نواحی ژنی و طول قابل ملاحظه آن, در صورت واقع شدن در نواحی کد کننده یا نواحی تنظیمی به راحتی سطح بیان ژن را تحت تاثیر قرار می­دهد. شناسایی این تنوع در ژنوم حیوانات اهلی در سال 2008 از ژنوم گاو شروع شده است و بررسی ارتباط آن با صفات تولیدی در حیوانات اهلی به تازگی در حال شکل­گیری است. اما به نظر می­رسد این نوع تنوع می­تواند افق جدیدی را در مطالعات اصلاح­نژادی باز کند.

جدول 3- همپوشانی نواحی ساختار کروموزومی با نواحی ژنی مرجع.

Table3- Coverage of reference gene with CNVR.

 جدول4- توالی پرایمر­ها برای ارزیابی با qPCR.

Table4- the primer sequence of qPCR.

جدول 5-نتایج PCR کمی برای CNVR هر سه کروموزوم.

Table-5 qPCR results for CNVR in 3 chromosomes.

نتیجه گیری

در این پژوهش 199 تنوع ساختار کروموزومی و 41 ناحیه با طول کلی 12 مگا جفت باز در سه کروموزوم شناسایی شد (%5/0). نتایج به دست آمده نشان داد، تنوع ساختار کروموزومی ­بخش قابل توجهی از ژنوم گاو را شامل می­شود. با توجه به پوشش وسیع و تقریبا˝ یکنواخت این تنوع در سراسر ژنوم و در بر گرفتن بخشی از ژن­ها توسط آن، می­توان از این تنوع در مطالعات ارتباطی استفاده کرد. اما قدم اول شناسایی محل درست و تعداد دقیق این تنوع است. استفاده از تعداد دام بیشتر و چیپ های متراکم­تر در این مطالعات می­تواند تعداد تنوع ساختار کروموزم و دقت ارزیابی را افزایش دهد. بر این اساس پیشنهاد می­شود برای بررسی بیشتر تاثیر این تنوع بر صفات تولیدی اولا˝ از پانل­های متراکم­تر SNP با تعداد دام بیشتر استفاده شود، ثانیا˝ برای تایید و شناسایی نواحی از تنوع که مستقیما˝ بر تنوع فنوتیپی صفات تولیدی موثر است، مطالعات ارتباطی[17] انجام شود. مطالعات ارتباطی کل ژنوم به منظور شناسایی نواحی ژنومی موثر بر بیمار­ها (انسان) و صفات تولیدی (دام) با پانل­های متراکم SNP انجام می­شود. به این ترتیب که ارتباط تمامیSNP­های ژنوم با صفت تولیدی مورد مطالعه بررسی می­گیرد و سپس SNP­های که ارتباط آن با صفت مورد بررسی معنی­دار شده است بعنوان جهش­های موثر بر صفت در برنامه­های اصلاح نژادی مورد توجه قرار می­گیرد. این مطالعات به شیوه­های متعددی انجام می­گیرد. قدیمی­ترین روش آن استفاده مستقیم از خود SNP­ها در آنالیز­ها بود پس ازآن به دلیل تراکم بالای SNP­های ژنوم و وقت­گیر بودن بررسی تک تک آنها، استفاده از قطعات بزرگتر که حاوی چندین SNP و به طبع اطلاعات بیشتری هستند رایج شد. امروزه استفاده از تنوع ساختار کروموزومی نیز در این نوع مطالعات جایگاهی خاصی دارد. با توجه به این که تنوع­های ساختار کروموزومی حداقل یک کیلو باز طول دارند و می­توانند بطور همزمان حاوی چندین  TagSNP باشند لذا حامل اطلاعات بیشتری هستند و علاوه بر راحتی آنالیز­ها، قدرت شناسایی نواحی مرتبط با صفات کمی نیز در آنها بیشتر است، از این رو، این امکان وجود دارد که تنوع ساختار کروموزومی در این مطالعات جایگزین TagSNP­ها شود.

تشکر و قدردانی

نمونه­ها و اطلاعات مورد استفاده در این پژوهش از مرکز ANAFI تهیه شد. به این وسیله مولفان از مسئولین این مرکز تشکر و قدردانی می­نمایند.