Phylogenetic analysis and sequencing of inclusion body gene of two Iranian isolates of Carnation etched ring virus

آنالیز فیلوژنتیکی و تعیین ترادف ژن اینکلوژن بادی دو جدایه ایرانی ویروس خراشک حلقوی میخک (Carnation etched ring virus)

مهناز آشنائی*¹، بهروز جعفرپور²، سعید ملک زاده شفارودی³

^1و2 به ترتیب دانشجوی کارشناسی ارشد و استاد گروه گیاهپزشکی، دانشکده کشاورزی، دانشگاه فردوسی مشهد.

³ استادیار گروه بیوتکنولوژی و به نژادی گیاهی، دانشکده کشاورزی، دانشگاه فردوسی مشهد.

تاریخ دریافت: 18/05/1391، تاریخ پذیرش: 24/02/1392

چکیده

ویروس خراشک حلقوی میخک (Carnation etched ring virus, CERV)، عضو جنس Caulimovirus و خانواده ی Caulimoviridae است. این ویروس به عنوان دومین ویروس مهم میخک پس از ویروس ابلقی میخک محسوب می شود. به منظور شناسایی ویروس مذکور، در طی بازدید از گلخانه­های میخک استانهای خراسان رضوی (مشهد) و مرکزی (محلات)، نمونه‌‌های مشکوک به آلودگی جمع‌آوری گردید. تشخیص اولیه CERV با استفاده از آزمون سرولوژیکی الایزای غیر مستقیم صورت گرفت. استخراج DNA از برگهای تازه نمونه­های آلوده، با استفاده از بافرCTAB  انجام شد. در آزمون PCR پس از به کار‌بردن جفت آغازگرهای اختصاصی قطعه ای به اندازه 1500 جفت‌ باز، واقع در ناحیه اینکلوژن بادی تکثیر شد. ترادف های بدست آمده، همراه با تعدادی از ترادف های کائولیموویروس های موجود در بانک ژن مقایسه شد. دندروگرام با استفاده از ترادف ژن اینکلوژن بادی با نرم افزار MEGA5 و به روش Neighbor joining ترسیم گردید. نتایج حاصل از آنالیزهای فیلوژنی نشان داد که جدایه محلات بیشترین نزدیکی را با جدایه هند (AJ853858) به میزان 4/99% دارد. از طرفی شباهت دو ایزوله ایرانی به یکدیگر 2/92% و با سایر جدایه های موجود در بانک ژن بین 90 تا 4/99% است. در بررسی تغییرات آمینواسیدی جدایه ها، بیشترین تغییرات در جدایه هلند مشاهده گردید. اگرچه تفاوت قابل ملاحظه ای به میزان 9/92-6/60% در سطح توالی های آمینواسیدی مربوط به ناحیه اینکلوژن بادی در بین کائولیموویروس­ها وجود داشت.

واژه‌های کلیدی:. آنالیز فیلوژنتیکی، واکنش زنجیره ای پلیمراز، ویروس خراشک حلقوی میخک.

مقدمه

ویروس خراشک حلقوی میخک (Carnation etched ring virus, CERV)، عضو جنس Caulimovirus می باشد. عضو تیپ این جنس ویروس موزاییک گل کلم است. ویروس های جنس کائولیموویروس دارای پیکره ایزومتریک به قطر 40-50 نانومتر با ضریب رسوب S 200-250 هستند و شامل یک ملکول DNA دو رشته ای به وزن 106×5 دالتون (بطول 8/7-8 کیلو جفت باز) که 17% از وزن پیکره را شامل می شود. از دیگر مشخصات این جنس تولید اندامک های درون سیتوپلاسمی است که بطور مشخص نوعی پروتئین کد شده توسط ویروس می باشد. این اندامک ها در بافت های آلوده تولید شده و اغلب شامل پیکره های ویروس می باشند (Raikhy et al., 2006; Fujisawa et al., 1971). ژنوم کامل ویروس خراشک حلقوی میخک به طول 7932 نوکلئوتید و محتوی CG 4/36% بوده و هفت قالب خواندنی باز را کد می کند(Hull et al., 1986) .

ORF VI در تشکیل ماتریکس پروتئینی اندامک­های درون سلولی[1] و تاثیر بر دامنه میزبانی و گستردگی علائم نقش دارد. این اینکلوژن بادی ها همان ویروپلاسم^[2] هستند که شامل پیکره های بالغ ویروس بوده که در ماتریکسی با تراکم الکترونی بالا قرار گرفته اند (Lawson & Hearon, 1980; Buchen-osmond, 2006) و در کائولیموویروس ها این ساختارها لوله ای شکل می باشند (Chenault & Melcher, 1994). گاه اندازه این ویروپلاسم ها تا 5/4 میکرومتر می رسد و با افزایش سن آلودگی بزرگتر می شوند. وجود این ماتریکس با تراکم الکترونی بالا حاصل فعالیت ریبوزومی می باشد (Lawson & Hearon, 1980). اغلب فرم های ابتدایی تر آنها شامل نواحی کوچک با تراکم الکترونی بالا و حاشیه مشخص بوده که همراه با ریبوزوم ها و پیکره های ویروسی هستند، حال آن که اینکلوژن بادی های ویروس خراشک حلقوی میخک بیشتر شامل پیکره های ویروسی بوده و کمتر شامل ماتریکس تیره می باشد (Rubio-Huertos & Castro, 1972). تجزیه و تحلیل رایانه ای نشان داده که ششمین ORF برای کد کردن پروتئین های بزرگتر از 10 کیلو دالتون توسط رشته مثبت ژنوم ویروس بکار می رود (Raikhy et al., 2006). ORF VI حداقل ناحیه حفاظت شده را (37-5% مشابهت در سطح آمینواسید) در بین دیگر ORF ها دارد و احتمال می رود که میزان تنوع در جدایه های ویروس در ارتباط با تشکیل اینکلوژن بادی ها باشد (Hull & Donson, 1981). همچنین احتمال می­رود یک آنالوژی بین ژن ORF VI در Caulimovirus  با برخی ویروس های جانوری بر روی میزبان، وجود داشته باشد (Sanger et al., 1991).

این ویروس در ایران تا کنون از استان های مرکزی، خراسان رضوی و شمالی گزارش شده است (Ashnayi et al., 2012; Bayat, 2008). تنها دو گزارش از توالی نوکلئوتیدی کامل این ویروس از هلند و هند در بانک ژن به ثبت رسیده است (Raikhy et al., 2006). از آنجا که تا کنون مطالعه ای در مورد بررسی تنوع در جدایه های ایرانی این ویروس و مقایسه آن با دیگر جدایه ها انجام نشده است، لذا در مقاله حاضر تلاش ما در جهت تعیین میزان شباهت در بخشی از ترادف مربوط به ژن تولیدکننده اینکلوژن بادی و مقایسه تفاوت های آمینواسیدی در این ناحیه از چهار جدایه ویروس می باشد.

مواد و روش ها

نمونه برداری و شناسایی ویروس ها

طی بازدید ازگلخانه های میخک استان های خراسان رضوی (چناران) و مرکزی (محلات) در پاییز و زمستان سال 1389، نمونه برداری از گیاهان میخک که دارای علائمی نظیر نقاط یا خطوط نکروز، کلروز و ابلقی بودند، انجام شد. نمونه ها در شرایط خنک به آزمایشگاه منتقل و تا زمان انجام آزمایش ها در دمای 4 درجه سانتی گراد و به منظور ماندگاری طولانی مدت در دمای 20- درجه سانتی گراد نگهداری شدند. جهت شناسایی سرولوژیکی ویروس از آزمون الایزای غیر مستقیم[3] استفاده گردید.

آزمون الایزای غیر مستقیم

جهت بررسی وجود ویروس در نمونه ها آزمون سرولوژیکی Indirect-ELISA به روش(Martin, 1990) با استفاده از آنتی سرم چند همسانه ای CERV (تهیه شده از موسسه DSMZ، آلمان) انجام شد. نتایج بر اساس تغییر رنگ حفرات با استفاده از دستگاه الایزا خوان (ELISA Reader, AWARNESS Tech. Inc., Stat fax-2100 USA) و در طول موج 405 نانومتر مورد ارزیابی قرار گرفتند. با توجه به میزان جذب عصاره برگ سالم (کنترل منفی) و با استفاده از فرمول  آستانه جذب گیاهان سالم تعیین گردیده و ارقام بالاتر از این مقدار به عنوان نمونه آلوده مشخص گردید. در این فرمول  میانگین جذب شاهدهای منفی بوده و SD انحراف معیار استاندارد بین جذب نوری آن چاهک است.

شناسایی مولکولی ویروس با استفاده از واکنش زنجیره ای پلیمراز[4]

پس از تایید آلودگی نمونه ها در آزمون الایزای غیرمستقیم، ابتدا دی. ان. ای کل گیاه استخراج و به عنوان DNA الگو مورد استفاده قرار گرفت. استخراج DNA به روش ژانگ و همکاران و با استفاده از بافرCTAB^[5]  (Zhang et al., 1998) با اندکی تغییرات انجام شد.

برای تشخیص CERV در آزمون PCR، از یک جفت آغازگر اختصاصی IBU / IBD (جدول 1) که مبتنی بر ترادف نوکلئوتیدی ژن کدکننده اینکلوژن بادی بودند، استفاده شد. واکنش PCR در حجم 25 میکرولیتری شامل یک میکرولیتر از DNA به غلظت 200 نانوگرم بر میکرولیتر، یک میکرولیتر از هر یک از آغازگرها (به غلظت 10 پیکومولار)، 5/2 میکرولیتر از بافر PCR (X10)، یک میکرولیتر MgCl₂ (25 میلی مولار)، 5/0 میکرولیتر از مخلوط نوکلئوتید‌تری‌فسفاتها  (dNTPs)(10 میلی مولار) و 3/0 میکرولیتر آنزیم  Taq DNA Polymerase (جنت بایو^[6]،کره) با غلظت 5 واحد در میکرولیتر انجام گرفت. برنامه دمایی واکنش زنجیره‌ای پلیمراز شامل یک مرحله واسرشت‌سازی اولیه به مدت 120 ثانیه در دمای 94 درجه سانتی‌گراد، 34 چرخه شامل دمای 94 درجه سانتی‌گراد به مدت 30 ثانیه، 57 درجه ‌سانتی‌گراد به مدت 60 ثانیه، 72 درجه سانتی‌گراد به مدت 120 ثانیه و یک مرحله نهایی به مدت 10 دقیقه در 72 درجه بود. محصول PCR، در ژل آگارز 5/1 درصد و بافر 1X TAE، در حضور نشانگر Gene Ruler™ 100bp DNA Ladder, Fermentase)) الکتروفورز شد و نتایج با دستگاه Gel documentation مشاهده شد. محصول PCR جهت تعیین ترادف به شرکت Macrogen (کره جنوبی) ارسال و با دستگاه Automatic Sequencer ABI 3730XL تعیین ترادف گردید.

آنالیز توالی

نتایج حاصل از تعیین ترادف با استفاده از نرم افزار DNA Baser مورد بررسی قرار گرفتند. توالی نهایی با برنامه ^[7]BLAST در پایگاه اطلاعاتی NCBI بررسی شد. آنالیز فیلوژنتیکی بر ‌اساس ژن اینکلوژن بادی (IB) پس از هم ‌ردیف‌سازی چند‌‌گانه[8] توالی‌های نوکلئوتیدی جدایه‌های CERV با برخی جدایه های موجود در بانک ژن (جدول2 ) با استفاده از نرم‌افزار Mega5 نسخه β و به روش Neighbor joining، با 1000 تکرار در ارزیابی Bootstrap انجام شد. سپس با استفاده از نرم افزار DNAMAN درصد شباهت در سطح توالی نوکلئوتیدی و آمینواسیدی به همراه ماتریس فاصله تعیین گردید.

جدول 1- ترادف آغازگرها جهت تکثیر ژن کدکننده اینکلوژن بادی ویروس CERV

Table 1- Sequences of primers used for amplification of inclusion body gene of CERV.

جدول 2- شماره دسترسی، اسامی جدایه ‌هایی از ویروس‌های  Caulimoviridae و ناحیه ی ژنوم در GenBank.

Table 2- Accession number, strains of virus from Caulimoviridae and region of genome deposited in GenBank.

نتایج و بحث

شناسایی ویروس در آزمون الایزای غیر مستقیم

از بین نمونه های مثبت در دو منطقه که از نظر جغرافیایی و آب و هوایی کاملا متمایز بودند، دو نمونه با بیشترین غلظت ویروس (OD=2.5)، به عنوان نماینده ای از دو منطقه (استان خراسان رضوی و مرکزی) جهت انجام مطالعات تکمیلی انتخاب شدند.

واکنش زنجیره ای پلیمراز (PCR)

به منظور شناسایی سریع و دقیق علاوه بر روش سرولوژیکی، از واکنش زنجیره ای پلیمراز استفاده گردید. DNA کل از نمونه های آلوده به ویروس، استخراج شده و با استفاده از آغازگرهای IBD و IBU (جدول 1) قطعه ای در حدود bp 1500 مربوط به ژن کدکننده اینکلوژن بادی در جدایه های دارای آلودگی از محلات (CERV-M) و چناران (CERV-Ch) تکثیر گردید که با نتایج ریخی و همکاران (Raikhy et al., 2006) یکسان بود (شکل1). شناسایی ویروس خراشک حلقوی میخک با استفاده از واکنش زنجیره ای پلی مراز با موفقیت صورت گرفت. آغازگرهای اختصاصی IBU/IBD قادر به شناسایی ویروس CERV در عصاره گیاه آلوده بوده و کاملاً اختصاصی عمل کردند، بطوری که با وجود استخراج DNA کل از بافت گیاه، پرایمرهای مربوطه باعث تکثیر ترادف‌های مشابه در گیاه نشدند. عدم تکثیر هیچ قطعه‌ای در نمونه شاهد منفی، این مطلب را تایید کرد

.

شکل 1- الکتروفورز محصول PCR بر روی ژل آگارز 5/1% و مشاهده باندی در محدوده تقریبی bp1500 مربوط به ژن کدکننده اینکلوژن بادی ویروس CERV، M-سایز مارکر bp100، N- شاهد منفی، 1- جدایه محلات، 2- جدایه چناران، 3- شاهد مثبت.

Figure 1- Gel electrophoresis of PCR products in agarose gel (1.5%) showing amplification of ~1.5 kb for inclusion body (IB) gene of CERV. Lane M, 100bp marker, lane N, negative control, lane 1, Mahallat isolate, lane 2, Chenaran isolate, lane 3, positive control.

آنالیز فیلوژنتیکی

پس از اخذ توالی، از هر دو خوانش رفت و برگشت مربوط به هر جدایه با استفاده از نرم افزار DNA Baser، دو توالی نهایی با شماره های دسترسی JX442756 و JX430793 به ترتیب مربوط به بخشی از ژن کد کننده اینکلوژن بادی در پایگاه اطلاعاتی NCBI به ثبت رسیدند. همردیف‌سازی چند‌گانه با استفاده از برنامه  ClastalW، به ترتیب برای توالی‌های نوکلئوتیدی و توالی‌های آمینواسیدی جدایه های مورد بررسی (جدایه چناران و محلات) با سایر جدایه‌های مربوط به این ویروس (جدایه هلند و هند) و برخی دیگر از ویروس‌های خانواده Caulimoviridae انجام گرفت (جدول 2). علاوه بر مقایسه توالی نوکلئوتیدی (nt) کدکننده بین جدایه‌های مختلف CERV با هم و با دیگر کائولیموویروس‌ها، مقایسه در سطح توالی‌های آمینواسیدی (aa) نیز انجام گرفت (جدول 3).

جدول 3- درصد شباهت نوکلئوتیدی (اعداد بالای قطر) و آمینواسیدی (اعداد زیر قطر) بین ترادف‌های ژن اینکلوژن بادی مربوط به جدایه‌های ایرانی CERV با دیگر کائولیموویروس ها.

Table 3- Percent nucleotide (above diagonal) and amino acid (below diagonal) sequence similarities between inclusion body gene of different caulimoviruses inclusive of Iranian isolate.

ترادف مربوط به این ژن در دو جدایه ایرانی این ویروس (JX442756 و JX430793) به میزان 2/92% شباهت در سطح نوکلئوتیدی و4/98% شباهت در سطح آمینواسیدی با یکدیگر نشان دادند. جدایه های ایرانی به میزان 4/90-90% (در سطح نوکلئوتیدی) و 8/93-2/92% (در سطح آمینواسیدی) با جدایه هلند و به میزان 4/99-1/99% (در سطح نوکلئوتیدی) و 100-4/98% (در سطح آمینواسیدی) با جدایه هند شباهت نشان دادند. زمانی که ORF VI جدایه های ویروس CERV با دیگر Caulimovirus مقایسه شد، بیشترین شباهت را در دو سطح آمینواسیدی (4/30%) و نوکلئوتیدی (4/52-9/51%) با ویروس موزاییک گل کلم (‌Cauliflower mosaic virus, CaMV) نشان دادند. مقایسه Caulimovirus های مختلف با یکدیگر نشان داد که بیشترین میزان شباهت در هر دو سطح (آمینواسیدی و نوکلئوتیدی) بین دو ویروس DMV و MiMV (به ترتیب 4/50 % و 2/63%) وجود دارد. همچنین کمترین میزان تشابه آمینواسیدی به مقدار 6/13% بین SVBV و CaMV و نیز SVBVو FMV نشان داده شد. نتایج مطالعات قبلی (Ashnayi et al., 2010) بر روی نواحی حفاظت شده از ژنوم ویروس نظیر ژن پروتئین پوششی و ژن پروتئین حرکتی نشان داد که در این نواحی میزان مشابهت بین کائولیموویروس ها خصوصا در سطح آمینواسیدی رقم قابل ملاحظه ای (1/53-1/60%) بوده، حال آنکه در ژن کدکننده اینکلوژن بادی (ORF VI) این مقدار تنها 1/7- 4/30% می باشد که این مطلب با نتایج (Raikhy et al., 2006; Hull & Donson, 1981) مطابقت دارد. آنالیز فیلوژنتیکی بر‌اساس ژن اینکلوژن بادی (IB) پس از هم ‌ردیف‌سازی چند‌‌گانه توالی‌های نوکلئوتیدی جدایه‌های CERV با برخی از ویروس‌های Caulimoviridae با استفاده از نرم‌افزار MEGA 5 و به روش Neighbour joining، با 1000 تکرار در ارزیابی Bootstrap انجام شد (شکل 2). درخت فیلوژنتیکی ترسیم شده، دو گروه اصلی را تشکیل داد. گروهI  شامل تمام ویروس‌های جنس Caulimovirus بوده و گروه II شامل ویروس‌های جنس Soymovirus می‌باشد. در میان گروه I ویروس موزاییک گل کلم Cauliflower mosaic virus,CaMV) ) بیشترین نزدیکی را با جدایه‌های CERV نشان دادند که با نتایج ریخی و همکاران (Raikhy et al. 2006) مطابقت دارد.از بین دو جدایه ی ایرانی ویروس، جدایه محلات بیشترین شباهت را (100% شباهت در سطح آمینواسیدی و 4/99% شباهت در سطح نوکلئوتیدی) با جدایه هند نشان داد و احتمال آن می رود که این جدایه از کشور هند منشاء گرفته باشد. همچنین در بین جدایه های ویروس، بیشترین تغییرات آمینواسیدی و کمترین شباهت در جدایه هلند مشاهده گردید.

هم ترازی چندگانه بین توالی آمینواسیدی جدایه های ایرانی با دو جدایه هند و هلند، نشان دهنده تغییراتی در موقعیت های خاصی از ژن اینکلوژن بادی بوده و نشان می دهد در بین جدایه های CERV بیشترین تغییرات آمینواسیدی مربوط به جدایه هلند و کمترین این تغییرات مربوط به جدایه هند می باشد (جدول 4). وجود این تغییرات آمینواسیدی احتمالا بدلیل وقوع موتاسیون در توالی نوکلئوتیدی می باشد، که البته گاهی این موتاسیون بصورت حذف یا افزودن یک یا چند نوکلئوتید بوده، که چنانچه مضربی از سه نوکلئوتید باشد، قاب خواندنی دست نخورده مانده و یک یا چند اسید آمینه افزوده[9]یا حذف[10] می شود (Raikhy et al., 2006; Nassaj Hoseini & Shamsbakhsh, 2010). بطوری که وقوع دو موتاسیون از نوع insertion در دو موقعیت از جدایه محلات ویروس CERV قابل تشخیص است (شکل 3). اولین موقعیت بصورت) E[11] (T[12] در موقعیت 377 و 378 ژن و دومین موقعیت بصورت (ET) در فاصله 437 و 438 ژن مشخص شد.

شکل 3- هم‌ ردیف‌سازی چند‌گانه ترادف‌های آمینواسیدی ژن اینکلوژن بادی جدایه‌های CERV که توسط نرم افزار Bioedit ترسیم شده است.

Figure 3- Multiple alignment of amino acid sequences drawn on the basis of inclusion body gene of isolates of CERV by Bioedit software.

مطالعه حاضر که اولین مطالعه مولکولی بر روی تنوع این ویروس در ایران می‌باشد، به هدف بررسی، بر روی بخشی از ژن کدکننده اینکلوژن بادی که باعث تنوع در این گروه می شود، انجام گرفت. مطالعات قبلی (Ashnayi et al., 2010) نشان داد که حفاظت شدگی بالایی در ناحیه پوشش پروتئینی جدایه های CERV وجود دارد، این در حالی است که در مطالعه حاضر ژن کدکننده اینکلوژن بادی، حفاظت شدگی پایینی در ترادف این ژن آشکار کرد که این مطلب با نتایج ریخی و همکاران (Raikhy et al., 2006) مطابقت نشان داد.