Document Type : Research Paper
Authors
Abstract
Keywords
بر همکنش فرم نوترکیب تیوردوکسین ردوکتاز وابسته به NADPH (NTR ) از گیاه برنج با تیوردوکسین(Trx) از دو منشا گیاهی و باکتریایی
هدیه اسلامپناه1، آذر شاه‌پیری*2، احسان شیخ الاسلام3
3 و1 کارشناس ارشد گروه بیوتکنولوژی کشاورزی، دانشکده کشاورزی، دانشگاه صنعتی اصفهان.
2 استاد‌یار گروه بیوتکنولوژی کشاورزی، دانشکده کشاورزی، دانشگاه صنعتی اصفهان.
تاریخ دریافت: 31/05/1391، تاریخ پذیرش: 06/04/1392
چکیده
حفظ تعادل شرایط اکسیداسیون- احیا (ردوکس) در سلول برای انجام متابولیسمهای مختلف سلولی و فعالیت مسیرهای انتقال پیام بسیار حیاتی است. در موجودات زنده مکانیسمهای مختلف مولکولی در حفظ این تعادل نقش دارند. سیستم تیوردوکسین وابسته بهNADPH سیستمی متشکل از تیوردوکسین ردوکتاز وابسته بهNADPH ، تیوردوکسین و NADPH میباشد که نقش مهمی در انتقال الکترون از NADPH به باندهای دیسولفیدی در بسیاری از پروتئینهای سلولی دارد و بدین ترتیب با تنظیم تبادلات تیول-دی سولفید درحفظ تعادل ردوکس سلولی دخالت دارد. در تحقیق حاضر توالی ژن کدکنندهی یکی از ایزوفرمهای NTRاز گیاه برنج که قبلا OsNTRB نامیده شده بود، در ناقل بیانی pET28a به همراه شریک الحاقی His6-tag همسانه‌‌‌‌‌سازی و پلاسمید نوترکیب به میزبان بیانی اشرشیا کلی ((E.coli سویه Rosetta (DE3) منتقل شد. مقدار قابل توجهی از فرم نوترکیب این پروتئین پس از القا محیط کشت باکتری با IPTG تولید و با استفاده از کروماتوگرافی جذبی خالصسازی شد. بیان هترولوگ و خالصسازی فرم نوترکیب OsNTRB امکان بررسی برهمکنش این پروتئین را با دو تیوردوکسین موجود از دو منشا مختلف گیاه جو (HvTrxh1) و باکتری اشرشیاکلی ( (EcTrxفراهم ساخت. نتایج نشان داد فرم نوترکیب OsNTRB در محیط این ویترو فعال بوده و در حضور NADPH میتواند هر دو تیوردوکسین گیاهی و باکتریایی را احیا نماید. با این حال سرعت برهمکنش آن با تیوردوکسین HvTrxh1 بسیار بالاتر از EcTrxبوده و تفاوت قابل توجهی نشان داد.
واژه های کلیدی: برنج ، تیوردوکسین ردوکتاز، تیوردوکسین، پروتئین نوترکیب.
مواد و روش ها
آنالیز توالی
توالی آمینواسیدی OsNTRB واقع بر لوکوس Os02g48290 مرتبط با گیاه برنج، درپایگاه اطلاعاتیRice genome annotation (http://rice.plantbiology.msu.edu) مورد جستجو قرار گرفت . توالی پروتئینی دیگر NTRهای گیاهی با استفاده از نرم‌افزار BlastP در پایگاه اطلاعاتی NCBI بهدست آمد. همردیفسازی NTRهای گیاهی با استفاده از نرم‌افزارClustalW2 انجام شد.
بیان هترولوگ NTR در باکتری E. coli
پس از تایید توالی، پلاسمیدهای نوترکیب به باکتری E. coli سویه Rosetta (DE3) منتقل شدند. با توجه به وجود ژن مقاوم به آنتی بیوتیک کانامایسین بر روی پلاسمید pET28a و همچنین مقاومت باکتریهای Rosetta (DE3) به آنتی بیوتیک کلرامفنیکل، سویههای Rosetta (DE3) حاوی پلاسمیدهای نوترکیب بر روی محیط کشت حاوی 50 میکروگرم بر میلی‌لیتر کانامایسین و 5 میکروگرم بر میلی‌لیتر کلرامفنیکل قادر به رشد بودند. به منظور تولید پروتئین از این سویههای نوترکیب، سلولهای باکتری در دمای 37 درجه سانتیگراد در محیط کشت LB حاوی این دو آنتیبیوتیک رشد داده شدند. وقتی 650 A به 6/0 رسید، 100 میکرومولار IPTG به عنوان القا کننده به محیط کشت اضافه شد و کشت باکتریایی به مدت 4 ساعت دیگر ادامه یافت. سپس سلولهای باکتری با استفاده از سانتریفیوژ رسوب داده شد و در دمای 20- درجه سانتیگراد نگهداری شدند.
جداسازی فاز محلول و خالصسازی با استفاده از کروماتوگرافی جذبی
خالصسازی پروتئین با استفاده از کروماتوگرافی جذبی انجام شد. بدین منظور پروتئین محلول استخراج شده از ستونهای His-Trap HP (ساخت شرکت GE Healthcare ) که از قبل با استفاده از بافر A بارگذاری (ایمیدازول 10 میلی مولار، کلرید سدیم 500 میلی مولار و 30 میلی مولار تریس- اسید کلریدریک، 8 =PH) به تعادل رسیده بودند، عبور داده شدند. جهت شستشوی پروتئین های باند شده غیر اخنصاصی میزان 10 میلی‌لیتر از مخلوط بافر B فیلتر شده سرد شامل (ایمیدازول 400 میلیمولار، کلرید سدیم 500 میلیمولار و 30 میلیمولار تریس- اسید کلریدریک، 8 =PH) و بافرA فیلتر شده سرد با نسبت 10% بافرB و 90% بافر A بر روی ستون بارگذاری گردید و اجازه داده شد تا از ستون خارج گردد. سپس جهت جداسازی پروتئین هدف 10 میلی‌لیتر بافری حاوی 40% بافر B و 60 % بافرA بر روی ستون بارگذاری گردید و هر میلی لیتر خروجی ستون در لولههای اپندورف 5/1 میلیی لیتری لوله های اپندورف بر روی یخ در دمای C°4 نگهداری شدند. کیفیت خلوص پروتئین خارج شده در ویال‌‌ها با استفاده از SDS-PAGE مورد ارزیابی قرار گرفت. غلظت پروتئین نوترکیب His6-ONTRB با استفاده از روش تعیین جذب در طول موج 280 نانومتر و قانون بیر- لمبرت تعیین شد.
بارگذاری نمونهها بر روی ژل SDS-PAGE
به منظور ردیابی پروتئین نوترکیب مورد نظر، نمونهها بر روی ژل SDS-PAGE بارگذاری شدند. بافر بارگذاری X5 (313 میلیمولار تریس- اسید کلریدریک (8/6 pH=) ،SDS 10 درصد، گلیسرول 50 درصد، برومو فنول بلو 05/0 درصد) و 4 میکرولیتر دیتیوتریتول (DTT) X20 با هریک از نمونهها مخلوط گردید و به مدت 10 دقیقه در C°95 جوشانده شدند. سپس نمونهها به مدت 15 دقیقه سانتریفوژ گردیدند و 14 میکرولیتر از هر نمونه در چاهکها تزریق شد. رنگ آمیزی ژل با استفاده از روش کوماسی بلو 250R- صورت گرفت (Sambrook et al., 2001).
تعیین سرعت واکنشOsNTRB با Trxدر حضور NADPH
مخلوط واکنش در حجم 300 میکرولیتر شامل 100 میلی مولار پتاسیم فسفات (5/7(pH= ، 2/0 میلی مولار EDTA، 1/.0 میلیگرم بر میلی‌لیتر بوین سرم آلبومین (BSA)، 200 میکرومولار DTNB، 200 میکرومولار NADPHو غلظت 5 میکرومولار از هر کدام از پروتئین های نوترکیب (Shahpiri et al.2008) HvTrxh1 و EcTrx (خریداری شده از شرکت سیگما) بود. واکنشها با اضافه کردن 40 نانومولار OsNTRBآغاز شد و مقدار جذب نوری در طول موج 415 نانومتربه مدت 30 دقیقه با اسپکتروفتومتر (Beckman DU 530) اندازه گیری و ثبت شد. لازم به ذکر است یک واکنش حاوی تمام ترکیبات ذکر شده در واکنش بدون حضور تیوردوکسین به عنوان واکنش کنترل در نظر گرفته شد.
نتایج
آنالیز توالی آمینواسیدی OsNTRB
توالی آمینواسیدی OsNTRB از 331 آمینواسید تشکیل شده است و دارای وزن مولکولی 67/34 کیلودالتون 18/6= pI میباشد. OsNTRB با یکی از ایزوفرمهای NTR از گیاه جو (HvNTR2) که به عنوان یک ایزوفرم میتوکندریایی/ سیتوپلاسمی قبلا مشخصهیابی شده است (Shahpiri et al., 2008)، دارای 91 % شباهت در توالی آمینواسیدی است. در توالیOsNTRB همانند دیگر ایزوفرمهای NTR از نوع میتوکندریایی/ سیتوپلاسمی، موتیف‌های متصل شونده به FAD به صورت توالی GXGXA و TXXXXVFAAGD و موتیف متصل شونده به NADPH با توالی GXGXXA مشاهده میشود. منطقه جایگاه فعال نیز حاوی دو سیستئن با توالی CAVC میباشد (شکل 1).
بیان هترولوگ OsNTRB در باکتری E. coli و خالصسازی پروتئین نوترکیب
توالی ژن کد کننده‌‌ی OsNTRB که از بافت ساقه گیاه برنج جداسازی و در پلاسمید pJET همسانه سازی شده بود (Eslampanah et al., 2012) و ناقل بیانی pET-28a(+)، هریک تحت واکنش هضمی با دو آنزیم برشی HindIII و EcoRI هضم و خالصسازی شدند (شکل 2). پس از اتصال قطعهOsNTR به ناقل بیانی (شکل 2) و تایید توالی ژنی همسانه‌‌‌‌‌سازی شده، دستواره مورد نظر به میزبان بیانی Rosetta (DE3) که از سویههای باکتری اشریشیا کلی است، منتقل گشت. پس از القای باکتری ها با IPTG، فاز محلول پروتئین از باکتری‌ها استخراج شد و آنالیز کل پروتئین محلول بر روی ژل SDS-PAGE صورت گرفت. قابل ذکر است که نمونه کنترل بدون تلقیح IPTGدر کنار نمونه اصلی در نظرگرفته شد (شکل 3).
|
OsNTRB MEGSAGAPLRTRVCIIGSGPSAHTAAIYAARAELKPVLFEGWLANDIAAGGQLTTTTDVE 60
HvNTR2 MEGSAAAPLRTRVCIIGSGPAAHTAAIYAARAELKPVLFEGWMANDIAAGGQLTTTTDVE 60
*****.**************:*********************:*****************
OsNTRB NFPGFPEGILGGELMDRCRAQSLRFGTSIISETVTAVDFSARPFRVASDSTTVLADAVVV120
HvNTR2 NFPGFPTGIMGIDLMDNCRAQSVRFGTNILSETVTEVDFSARPFRVTSDSTTVLADTVVV120
****** **:* :***.*****:****.*:***** **********:*********:***
|
|
OsNTRB ATGAVARRLHFAGSDAYWNRGISACAVCDGAAPIFRNKPIAVIGGGDSAMEESNFLTKYG180
HvNTR2 ATGAVARRLYFSGSDTYWNRGISACAVCDGAAPIFRNKPIAVIGGGDSAMEEGNFLTKYG180
*********:*:***:************************************.*******
OsNTRB SHVYIIHRRNTFRASKIMQARALSNPKIQVFWDSEVVEAYGGEGGGPLAGVKVKNLVTGK240
HvNTR2 SQVYIIHRRNTFRASKIMQARALSNPKIQVVWDSEVVEAYGGAGGGPLAGVKVKNLVTGE240
*:****************************.*********** ****************:
|
OsNTRB ISDLQVSGLFFAIGHEPATKFLGGQLELDADGYVATKPGSTHTSVKGVFAAGDVQDKKYR300
HvNTR2 VSDLQVSGLFFAIGHEPATKFLNGQLELHADGYVATKPGSTHTSVEGVFAAGDVQDKKYR300
:*********************.*****.****************:**************
OsNTRB QAITAAGSGCMAALDAEHYLQEVGAQEGKAD 331
HvNTR2 QAITAAGSGCMAALDAEHYLQEVGAQVGKSD 331
************************** **:*
شکل 1- همردیف سازی توالی آمینو اسیدی دو NTR توع سیتوزول/ میتوکندری از گیاه برنج ((OsNTRB و جو(HvNTR2 ). جعبه 1 و4: موتیف اتصال FAD جعبه 3: موتیف اتصال NADP جعبه 2: موتیف مربوط به دو سیستئین در جایگاه فعال NTR.
Figure 1- Multiple alignment between cytoplasmic/mitochondrion type NTRs from rice (OsNTRB) and barley (HvNTR2). FAD-binding motifs (Box1 and Box4), NADP-binding motif (Box 3), and two Cys residues in the active site motif (Box 2).
برهمکنش OsNTRB با دو تیوردوکسین گیاهی و باکتریای
شکل 2- آماده سازی قطعه OsNTRB و ناقل بیانی pET-28aبه منظور همسانه سازی قطعه ORF در وکتور بیانی. 100 bp DNA Ladde :L :A ستون 1: قطعه ژن کد کننده OsNTRBبه طول bp1008 جدا شده از پلاسمید OsNTRB/pJET پس از برش با آنزیمهای HindIII و EcoRI. M :B: نشانگر مولکولی III، ستون 1 : پلاسمید pET-28a استخراج‌شده از باکتری DH5α ستون 2:پلاسمید بیانی pET-28a به طول bp5379 هضم شده با دو آنزیم برشیEcoR I & Hind III. C: تایید همسانه سازی ژن در پلاسمید pET-28a با استفاده از هضم آنزیمی pET-OsNTRB با آنزیم های HindIII و EcoRI M: نشانگر مولکولی III ستون 2: قطعه OsNTRB به طول bp1008 جدا شده از پلاسمید pET-OsNTRB پس از برش با آنزیمهای HindIII و EcoRI 100 bp DNA Ladder : L
Figure 2- Preparation fragment containing gene encoding OsNTRB and Linear vector pET-28a. A: DNA Ladder 100 bp plus (L), Double digestion of pJET- OsNTRB with restriction enzymes Hind III & EcoRI (Lane 1). B: Molecular Marker III (M), Extracted Plasmid pET28a (Lane 1), Digested pET-28a with two restriction enzymes Hind III and I EcoRI (Lane 2). C: Confirmation if cloning of gene in pET28a by cutting of pET-OsNTRB with EcoRI and HindIII. Molecular Marker III (M), Double digestion of pET-OsNTRB with restriction enzymes Hind III & EcoRI (Lane 1), DNA Ladder 100 bp plus (L).
شکل3- بررسی بیان و خالص سازی پروتیئن نوترکیب OsNTRB بر روی ژل SDS-PAGE. M: مارکر پروتئینی چاهک1: پروتئین محلول استخراج شده بدون تلقیح IPTG چاهک2 : پروتئین محلول استخراج شده پس از 4 ساعت تلقیح IPTG چاهک 3: پروتین نوترکیب خالص شده His-OsNTRB
Figure 3- Analysis of expression and purification of recombinant OsNTRB by SDS-PAGE. Protein marker (M), Total soluble protein extracted from E. coli before addition of IPTG (lane1), Soluble extracted protein from E. coli 4 hours after addition of IPTG (lane 2), Purified His-OsNTRB (lane 3).
بحث
منابع
Arner ESJ, Zhong L, Holmgren A (1999). Preparation and assay of mammalian thioredoxin and thioredoxin reductase. Methods in Enzymology 300: 226–239.
Buchanan BB, Schürmann P, Ricardo A, Jacquot JP (2002). The ferredoxin/thioredoxin system: from discovery to molecular structures and beyond. Photosynthesis Research 73: 215–222.
Chae HZ, Kang SW, Rhee SG (1999). Isoforms of mammalian peroxiredoxin that reduce peroxides in presence of thioredoxin. Methods in Enzymology 300: 219-226.
Dai S, Saarinen M, Ramaswamy S, Meyer Y, Jacquot JP, Eklund H (1996). Crystal structure of Arabidopsis thaliana NADPH dependent thioredoxin reductase at 2.5A resolution. Journal of Biological Chemistry 264: 1044–1057.
Eslampanah H, Shahpiri A (2012). Molecular cloning and characterization of two isoforms of cytoplasmic/mitochondrial type NADPH-dependent thioredoxin reductase from rice (Oryza sativa L. ssp. indica). Australian Journal of Crop Science 6: 1045-1050
Gelhaye E, Rouhier N, Navrot N, Jacquot JP (2005). The plant thioredoxin system. Cellular and Molecular Life Sciences 62: 24–35.
Holmgren A (1977). Bovine thioredoxin system. Journal of Biological Chemistry 252: 4600-460.
Holmgren A (1985). Thioredoxin. Annual Review of Biochemistry 54: 237-271.
Laloi C, Rayapuram N, Chartier Y, Grienenberger JM, Bonnard G, Meyer Y (2001). Identification and characterization of a mitochondrial thioredoxin system in plants. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 98: 14144–14149.
Marcos A, Oliveira KF, Discola A, Alves SV, Francisco edrano JM, Beatriz G, Luis N (2010) Insights into the specificity of thioredoxin reductase-thioredoxin interactions. A structural and functional investigation of the yeast thioredoxin system. Biochemistry 49: 3317–3326.
Meyer Y, Reichheld JP, Vignols F (2005). Thioredoxins in arabidopsis and other plants. Photosynthesis Research 86: 419-33.
Miranda-Vizuete A, Damdimopoulos AE, Gustafsson J, Spyrou G (1997). Cloning, expression, and characterization of a novel Escherichia coli thioredoxin. Journal of Biological Chemistry 272: 30841–30847.
Mustacich D, Powisi G (2000(. Thioredoxin reductase. Biochemical Journal 346: 1-8
Renard M, Alkhalfioui F, Schmitt-Keichinger C, Ritzenthaler C, Montrichard F (2011). Identification and characterization of thioredoxin h isoforms differentially expressed in germinating seeds of the model legume Medicago truncatul. Plant Physiol 155: 1113-1126
Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T (2001). Molecular cloning: A laboratory manual. 3rd ed. New York: Cold Spring Harbor Laboratory pp. A843–A854.
Shahpiri A, Svensson B, Finnie C (2008). The NADPH dependent thioredoxin reductase/thioredoxin system in germinating barley seeds: gene expression, protein profiles, and interactions between isoforms of thioredoxin h and thioredoxin reductase. Plant Physiology 146: 789–799.
Waksman G, Krishna TSR, Williams CH, Kuriyan J (1994). Crystal structure of Escherichia coli thioredoxin reductase refined at 2 A ° resolution. Implications for a large conformational change during catalysis. Journal of Molecular Biology 236: 800–816.
Wang PF, Veine DM, Ahn SH, Williams CH Jr (1996). A stable mixed disulfide between thioredoxin reductase and its substrate, thioredoxin: preparation and characterization. Biochemistry 35: 4812-4819.
Interaction of recombinant form of NADPH-dependent thioredoxin reductase from rice with thioredoxin from two plant and bacterial sources
Eslampanah H.1, Shahpiri A.*2, Shaykholeslam Esfahani E.3
1,3 Department of Biotechnology, College of Agriculture, Isfahan University of Technology, Isfahan, Iran.
2 Assistant professor Department of Agricultural Biotechnology, College of Agriculture, Isfahan University of Technology, Isfahan, Iran.
Abstract
Maintaining redox homeostasis in the cell is critical for different cellular metabolisms and signal transduction pathways. In plants different molecular mechanisms are involved in maintaining cellular redox homeostasis. NADP/thioredoxin system, consisting of NADPH, NADP-thioredoxin reductase (NTR) and thioredoxin plays important role as electron donor to disulfide bonds in many cellular proteins. In this study, the gene encoding one of NTR isoform from rice, namely OsNTRB was cloned in pET28a as fusion with His6-tag and transferred to Roseta (DE3), a strain of Escherichia coli. Considerable amount of His-OsNTRB was produced after induction of bacteria culture with IPTG and purified using affinity chromatography. Heterologous expression and purification of recombinant form of OsNTRB enabled us to study the interaction of this protein with thioredoxin from barley (HvTrxh1) and E. coli (Ec Trx). The results showed that recombinant form of OsNTRB is active and can reduce both HvTrxh1 and EcTrx in vitro. However the rates of reaction with these two Trx were significantly different.
)
