Generation of Arabidopsis early flowering plants by destruction of CLF transcripts via RNA silencing

ایجاد گیاهان زودگلده آرابیدوپسیس از طریق خاموش کردن ژن CLF به روش RNA silencing

ندا دیدار¹، مقصود پژوهنده* ²، فاطمه محمودی³

¹ دانشجوی کارشناسی ارشد بیولوژی سلولی و مولکولی، دانشگاه شهید مدنی آذربایجان

² عضو هیأت علمی گروه بیوتکنولوژی کشاورزی، دانشگاه شهید مدنی آذربایجان

³ عضو هیأت علمی گروه بیولوژی سلولی و مولکولی، دانشگاه شهید مدنی آذربایجان

تاریخ دریافت: 30/01/1391، تاریخ پذیرش: 30/03/1392

چکیده                                                                                                  

کنترل زمان گلدهی نیازمند فعالیت متوالی ژن­های مختلفی است که خود تحت کنترل فاکتورهای محیطی و درونی می­باشند. برخی از این ژن­ها از قبیل Curly Leaf (CLF) نقش مهارکنندگی در آغاز گلدهی دارند. بنابراین، با خاموش کردن این قبیل ژن­ها می­توان آغاز گلدهی در گیاهان را تسریع کرد. در این تحقیق، از تکنیکRNA Silencing  برای خاموش کردن ژن CLF در گیاه آرابیدوپسیس جهت بررسی قابلیت­های این روش در تولید گیاهان زودگلده استفاده شد. ابتدا، برای تولید ساختار­ سنجاق سری (Hairpin)، قطعه­ای از ژن CLF آرابیدوپسیس به روش PCR تکثیر و در دو مرحله، در دو جهت سنس و آنتی­سنس در وکتور pFGC5941 همسانه سازی شد. در مرحله­ بعد، وکتور حاصل به روش آگروباکتریوم، به گیاه آرابیدوپسیس انتقال ­یافت. همانطور که انتظار می­رفت، گلدهی در گیاهان تراریخته­ بدست آمده، زودتر از گیاهان طبیعی صورت گرفت. در تایید نتایج بدست آمده، آزمایش RT-qPCR نشان داد که در مقایسه با گیاهان طبیعی، بیان ژن CLF در گیاهان تراریخته کاهش و برعکس، بیان ژن FT که یک ژن محرک گلدهی است، افزایش یافته است. نتایج این تحقیق نشان می­دهد که از RNA Silencing، می­توان به عنوان یک روش جدید و سریع  به منظور ایجاد گیاهان زودگلده استفاده کرد.

کلمات کلیدی: Arabidopsis thaliana، گلدهی، CLF، گیاه تراریخته­ زودگلده،RNA Silencing

مقدمه

گیاهان گلدار طی چرخه­ زندگی خود از چندین مرحله­ نموی مانند جوانه­ زنی، رشد رویشی، گلدهی، لقاح، نمو جنینی و بلوغ دانه عبور می­کنند (Weidong et al., 2000) که در این میان، آغاز گلدهی (انتقال از فاز رویشی به فاز زایشی) مرحله­ مهم و حیاتی برای گیاه می­باشد (Kim et al., 2003). تحقیقات ژنتیک مولکولی در گیاه مدل آرابیدوپسیس منجر به کشف تعداد زیادی از ژن­ها شد که در پاسخ به عوامل محیطی و درونی باعث تنظیم زمان گلدهی می­شوند. این ژن­ها شبکه­ تنظیمی پیچیده­ای را تشکیل می­دهند که با دو مسیر وابسته به عوامل محیطی (دوره­ی نوری[1] و بهاره کردن[2]) و مستقل از عوامل محیطی (خودمختار[3] و وابسته به جیبرلین) زمان گلدهی را کنترل می­کنند (Blazquez et al., 2001). یکی از ژن­های کلیدی در این شبکه، [4]FLC می­باشد که یک فاکتور رونویسی MADS-box را کد می کند. این فاکتور مستقیماً به لوکوس [5]FT (ژنی مهم در مسیر دوره­ نوری که در پاسخ به افزایش طول روز باعث آغاز گلدهی می­شود) (Kardailsky et al., 1999)، متّصل شده و از طریق ممانعت از بیان آن گلدهی را به تأخیر می­اندازد (Sheldon et al., 1999). بیان ژن FLC نیز به نوبه­ خود توسّط فعال کننده­ها و مهار کننده­های متعددی کنترل می­شود. برای مثال، فعال شدن مسیرهای خودمختار و بهاره کردن در پاسخ به سرما، باعث مهار بیان ژن FLC، و در نتیجه شروع گلدهی می­شود (Michaels et al., 2001). در غیاب مسیر بهاره کردن نیز کمپلکس مهم دیگری بنام CLF-PRC2 بیان FLC و همچنین FT را مهار می­کند (He, 2009). در این شبکه­ پیچیده­ تنظیمی، CLF یک همولوگ گیاهی E(z) شناخته شده در Drosophila می­باشد که در کمپلکس PRC2 نقش کلیدی داشته و یک هیستون متیل ترانسفراز است که با عملکرد خود، بیان FT و FLC را مهار می­نماید و این کار را به روش اپی­­ژنتیک و با انتقال سه گروه متیل بر روی لیزین 27 هیستون H3 (H3K27me3)، در کروماتین آنها انجام می­دهد (Czermin et al., 2002).

محققان با بررسی گیاهان جهش یافته­ آرابیدوپسیس توانسته­اند عملکرد دقیق برخی از ژن­های درگیر در مسیر گلدهی را تعیین کنند. تحقیقات انجام شده روی گیاهان جهش یافته­ clf، نشان داد که در غیاب این ژن، بیان ژن­های FT و FLC افزایش یافته و گلدهی گیاه تسریع می­یابد. این فنوتیپ نشان می­دهد که کمپلکس CLF-PRC2 اثر مهار کنندگی قوی­تری روی بیان FT نسبت به FLC دارد. بنابراین FT توانسته در گیاه جهش یافته­ clf با بیان قوی خود باعث تسریع گلدهی شود (Jiang et al., 2008; Pazhouhandeh et al., 2011). بنابراین، ژن CLF یک نقش کلیدی در آغاز گلدهی دارد و از طریق دستکاری بیان این ژن و در نتیجه، دستکاری زمان گلدهی، می­توان اهداف مختلف تحقیقاتی و اقتصادی را دنبال کرد.

اکثر محصولات مهم کشاورزی و گیاهان دارویی و زینتی به نحوی وابسته به گلدهی می­باشند، به گونه­ای که گلدهی یا هدف اولیه محصول است و یا تولید یک محصول مستلزم گلدهی آن می­باشد. بنابراین، با داشتن شرایط آب و هوایی مناسب، تسریع گلدهی در چنین گیاهانی می­تواند نتیجه­ بسیار مطلوبی داشته باشد. تا به حال کارهای زیادی در کنترل زمان گلدهی از طریق مهندسی شرایط محیطی و یا بکارگیری تنظیم کننده­های رشد انجام شده است. از آنجا که این ابزار باعث افزایش هزینه­های تولید شده و همچنین استفاده از ترکیبات شیمیایی محدود شده است، لذا روش­های جایگزین برای مهندسی گلدهی (شامل بیوتکنولوژی) آغاز شده­اند که مستلزم فهم مکانیسم­های مولکولی وابسته به آن می­باشد (Nocker, 2001). در این تحقیق، امکان تولید گیاهان زودگلده از طریق خاموش کردن ژن CLF در گیاه آرابیدوپسیس، با استفاده از تکنیکRNA Silencing  یا RNA Interference مورد بررسی قرار گرفته است.

مواد و روش­ها

همسانه سازی قطعه­ای از ژن CLF در وکتور pFGC5941:  جهت ساخت وکتور حاوی ساختار سنجاق سری، ابتدا یک قطعه از cDNA ژن CLF آرابیدوپسیس تالیانا به طول 400 جفت باز با استفاده از یک جفت آغازگر اختصاصی تکثیر گردید (شکل-A1 و A-3). برای همسانه سازی این قطعه در دو جهت، به ترتیب جایگاه­های برشی XbaΙ-XhoI و BamHI-NcoI در آغازگرها تعبیه شد. توالی آغازگر مستقیم (Forward: AAT CTA GAC TCG AGA TGG CGT CAG AAG CTT CGC C) و آغازگر معکوس (Reverse: AAC CAT GGG GAT CCT AGG ACG TAA GGA AAT TTT GAC) بود.  واکنش PCR با 30 چرخه °C 92 به مدت 20 ثانیه، °C 50 به مدت 20 ثانیه و °C 74 به مدت 30 ثانیه انجام شد. محصول PCR پس از برش با آنزیم­های NcoI و XhoI و خالص سازی با استفاده از ژل آگارز با دمای ذوب پایین، در بین جایگاه­های برشی NcoI و XhoI وکتور pFGC5941 همسانه سازی شد. این وکتور که حاوی ژن مقاومت به کانامایسین به عنوان انتخابگر در باکتری و ژن مقاومت به علف کش Basta به عنوان انتخابگر در گیاه می­باشد، دارای دو MCS (Multiple Cloning Site) است که توسط اینترون CHS (Chalcone Synthase) از هم جدا شده­اند (شکل 2). بنابراین، در این مرحله، قطعه­­ تکثیر شده در جهت سنس، در بالادست اینترون CHS و پایین­دست پروموتر35S  CaMV قرار گرفت (شکل-B1). در مرحله­ دوّم، پس از تایید همسانه سازی این قطعه در جهت سنس با استفاده از واکنش PCR با جفت آغازگر (pFGC-F-2587: 5′-AAT CCC ACT ATC CTT CGC AAG ACC-3′ وpFGC-R-2917: 5′-CTT TCT ACC TTC CCA CAA TTC GTC G-3′، شکل B-3)، قطعه­ ­400 جفت بازی با استفاده از آنزیم­های XbaI و BamHI، در جایگاه MCS دوّم وکتور حاصل از مرحله­ اوّل، همسانه سازی شد. با این عمل، قطعه­ مذکور در جهت آنتی­سنس (خلاف جهت قطعه­ وارد شده در مرحله­ اوّل) و در پایین­دست اینترون CHS وارد گردید (شکل-C1). همسانه سازی مرحله­ دوّم نیز به روش PCR و با استفاده از یک جفت آغازگر متصل شونده به وکتور در نواحی بالا دست و پایین دست محل همسانه سازی (pFGC-F-3505: 5′-CAG ACA GAT GTT TCC CAG CGA G-3′ وpFGC-R-4291: 5′-AAA CCG GCG GTA AGG ATC TGA G-3′، شکل C-3) تایید گردید. انتقال وکتور طرّاحی شده به گیاه آرابیدوپسیس: وکتور نوترکیب  pFGC5941 حاصل که حاوی ساختار سنجاق سری قطعه­ 400 جفت بازی از cDNA ژن CLF می­باشد، به روش شوک الکتریکی به باکتریAgrobacterium tumefaciens ، استرین LBA4404، منتقل شد. کلنی­های بدست آمده، پس از تایید به روش PCR، برای انتقال ساختار سنجاق سری به گیاهان آرابیدوپسیس به روش Floral dip (Bent, 2006)  استفاده ­شدند (شکل D-1). برای این کار، تک کلنی­های آگروباکتریوم حاوی وکتور نوترکیب در 3 میلی­لیتر محیط LB مایع حاوی آنتی­بیوتیک­های کانامایسین (mg/l 30) و ریفامپیسین (mg/l 100) کشت و به مدّت یک شب در انکوباتور شیکردار با سرعت rpm 200 و دمای ^оC 28 رشد داده شدند. سپس، 100 میکرولیتر از کشت باکتری­ها به 25 میلی­لیتر از محیط LB مایع حاوی همان آنتی­بیوتیک­ها انتقال یافت و به مدّت یک شب در شرایط قبلی رشد داده شدند. در مرحله­ بعد، کشت­های آگروباکتریوم به مدّت 10 دقیقه و با سرعت rpm 4000 سانتریفیوژ شد و رسوب سلول­های باکتری در 25 میلی­لیتر از محیط ­کشت مایع دوباره غوطه ور شد. در نهایت، از غلظت­های باکتری با OD₆₀₀ برابر 5/0-4/0 برای ترانسفورماسیون گیاهان آرابیدوپسیس استفاده شد. بدین ترتیب که، گیاهان آرابیدوپسیس (اکوتیپ کلمبیا) در گلخانه نگهداری شدند تا به فاز گلدهی وارد شوند. سپس، گل­های گیاه آرابیدوپسیس درون محلول آگروباکتریوم حاوی وکتور نوترکیب یک دقیقه فرو برده شد و به مدّت دو روز توسّط پلاستیکی تیره رنگ پوشانده شدند. بذرهای گیاهان آرابیدوپسیس ترانسفورم شده جمع آوری و در محیط انتخابی (MS[6]+ Basta[7] 10 mg/l) کشت و گیاهان ترا­ریخته انتخاب و گزینش شدند (شکل A-4 و B-4).

شکل 1- مراحل ایجاد سازه­ RNAi و انتقال آن به گیاه آرابیدوپسیس به منظور خاموشی ژن .CLF (A تکثیر یک قطعه 400 جفت بازی از ابتدای ژن CLF توسّط آغازگرهای حاوی جایگاه­های برشی آنزیمی. (B همسانه سازی این قطعه در وکتور pFGC5941 در جهت سنس. (C همسانه سازی همین قطعه در وکتور pFGC-insert در جهت آنتی­سنس. (D  انتقال این سازه­ نهایی به آرابیدوپسیس.

Figure 1- Steps of making RNAi construct and transformation to Arabidopsis in order to extinction of CLF gene. A) 400 bp fragment amplification from the beginning of CLF gene with primers containing enzyme cutting sites. B) Cloning of this fragment into pFGC5941 vector in sense direction. C) Cloning of this fragment into pFGC-insert in antisense direction. D) Transformation of final construction into Arabidopsis.

شکل 2- نقشه­ی وکتور pFGC5941 حاوی اینترون CHSA مابین دو MCS که برای ایجاد سازه­ RNAi مناسب است.

Figure 2- pFGC5941 vector map containing CHSA intron between two MCSs that is suitable for creation of RNAi construction.

بررسی گیاهان تراریخته: زمان گلدهی گیاهان تراریخته­ نسل دوّم و مقایسه­ آنها با گیاهان شاهد با تعیین تاریخ دقیق شروع گلدهی و تعداد برگ در زمان گلدهی بررسی شد (شکل B-5 و C-5).

استخراج DNA و تایید حضور فیزیکی ساختار سنجاق سری در ژنوم: برای استخراج DNA ژنومی از روش CTAB استفاده گردید (Clarke, 2009). برای این منظور، حدود ۲۰۰ میلی‌گرم از برگ­های گیاه درون هاون چینی همراه با 500 میکرولیتر از بافر CTAB به خوبی ساییده شد. در ادامه همه­ محتویات هاون به تیوب استریل 5/1 میلی­لیتری منتقل شده و به مدّت 20 دقیقه در دمای °C۶5 قرار گرفت. سپس یک حجم از کلروفورم به نمونه­ها اضافه و به مدّت 5 دقیقه ورتکس انجام گرفت. پس از 5 دقیقه سانتریفیوژ در دمای اتاق با سرعت rpm 13000، فاز رویی به تیوب جدید منتقل شده و DNA به روش اتانول رسوب داده شد. رسوب حاصل پس از خشک شدن در دمای آزمایشگاه، در 50-30 میکرولیتر آب مقطر استریل حل گردید. برای تایید حضور ترانس­ژن مورد نظر در گیاهان تراریخته­ آرابیدوپسیس، پس از استخراج DNA ژنومی از بافت­های گیاهان گزینش شده،  واکنش PCR با استفاده از جفت آغازگرهای اختصاصی متصل شونده به وکتور با 30 چرخه °C 92 به مدت 20 ثانیه، °C 50 به مدت 20 ثانیه و °C 74 به مدت 30 ثانیه،  انجام گرفت.

شکل 3- نتیجه­ الکتروفورز محصولات PCR بر روی ژل آگارز 1%. A) تکثیر قطعه­ 400 جفت بازی از ابتدای ژن CLF (1) و M، مارکر DNA. (B تایید همسانه سازی در جهت سنس به وسیله­ آغازگرهای (pFGC-R-2917 و pFGC-F-2587): تکثیر قطعه­ 330 جفت بازی از روی وکتور pFGC خالی (c) و قطعه­ 730 جفت بازی از روی وکتورهای نوترکیب حاصل از مرحله­ اوّل همسانه سازی (1و2) نشان دهنده­ همسانه سازی موفّق قطعه­ 400 جفت بازی در جهت سنس می­باشد. (C تایید همسانه سازی در جهت آنتی­سنس به وسیله آغازگرهای (pFGC-F-3505 و pFGC-R-4291): تکثیر قطعه­ 786 جفت بازی از روی وکتور pFGC خالی (c) و قطعه­ 1186 جفت بازی از روی وکتورهای نوترکیب حاصل از مرحله­ دوّم همسانه سازی، (1و2) نشان دهنده­ همسانه سازی موفّق قطعه­ 400 جفت بازی در جهت آنتی­سنس می­باشد..

Figure 3- Electrophoresis result of PCR production on 1% agarose gel. A) 400 bp fragment amplification from the beginning of CLF gene (1) DNA ladder (M). B) Confirmation of cloning in sense direction by pFGC-R-2917 and pFGC-F-2587 primers: Amplification of 330 bp and 730 bp fragments respectively from pFGC-Ø (c) and recombination vectors have been obtained from first cloning (1and 2), illustrating successful cloning of 400 bp fragment in sense direction. C) Confirmation of cloning in antisense direction by pFGC-F-3505 and pFGC-R-4291 primers: Amplification of 786 bp and 1186 bp fragments respectively from pFGC-Ø (c) and recombination vectors have been obtained from second cloning (1and 2), illustrating successful cloning of 400 bp fragment in sense direction.

شکل 4- گزینش گیاهان تراریخته­ آرابیدوپسیس در محیط انتخابی MS+Basta (مقاومت روی T-DNA). (A گیاهان نسل اوّل. (B گزینش گیاهان تراریخته­ نسل اوّل. (C گیاهان نسل دوّم بدست آمده از بذرهای گیاه منتخب نسل اوّل.

Figure 4- Selection of transgenic Arabidopsis plants by the selection medium MS+Basta (resistance on T-DNA). A) T1 plants. B) Selection of T1 transgenic plants. C) Obtained T2 plants from seeds of selected T1 plant.

استخراج RNA، سنتز cDNA و PCR کمی: استخراج RNA کل از بافت­های مختلف گیاهان آرابیدوپسیس تراریخته­ نسل دوّم با روش تریزول (Trizol، میکروژن) انجام شد (Pazhouhandeh et al., 2011). برای این کار 2/0 گرم بافت گیاهی در ازت مایع خرد شده و در یک میلی­لیتر تریزول ذوب شد. سپس، 200 میکرولیتر کلروفورم اضافه شده و پس از مخلوط شدن، نمونه­ها به مدّت 15 دقیقه با سرعتrpm  15000 در °C 4 سانتریفیوژ شدند. پس از انتقال فاز رویی به تیوب جدید، RNA با استفاده از ایزوپروپانول رسوب داده شد. کیفیت و کمیت نمونه­ها با دو روش الکتروفورز ژل آگارز (1%) و اسپکتروفوتومتر بررسی شدند. سنتز cDNA با استفاده از 4 میکروگرم ازRNA استخراج شده از گل­ها و با استفاده از آغازگر dT و آغازگر تصادفی هگزامر و بر اساس روش ذکر شده برای کیت RT Superscript III (شرکت Invitrogen) ساخته شد. سپس برای بررسی میزان بیان ژن­های CLF، FT و FLC، PCR کمی با آغازگرها و روش توصیف شده توسّط Pazhouhandeh و همکاران (2011) انجام گرفت (شکل 6).

شکل 5- (A گیاهان تراریخته­ آرابیدوپسیس نسل دوّم (Line1, Line2, Line3) و گیاه تیپ وحشی (WT). (B مقایسه­ تعداد برگ­های گیاهان تراریخته و تیپ وحشی در زمان گلدهی. (C مقایسه­ سن گیاهان تراریخته و تیپ وحشی در زمان گلدهی.

Figure 4- A) T2 transgenic Arabidopsis (Line1, Line2, Line3) and wild type plant (WT). B) The comparison of leaves number in transgenic and wild type plants at flowering time. C) The comparison of transgenic and wild type plants age at flowering time.

شکل 6- مقایسه­ سطوح mRNAهای CLF (A)، FLC (B) و FT (C) گیاهان تراریخته­ بیان کننده­ CLF hp با گیاهان موتانت clf و گیاهان تیپ وحشی با استفاده از RT-PCR کمی.

Figure 6- Comparison of CLF (A), FLC (B) and FT (C) mRNA levels in CLF hp transgenic plants with the clf mutant and wild type plants by the qRT-PCR technique.

نتایج و بحث

این تحقیق به منظور بررسی امکان تسریع گلدهی از طریق خاموش کردن بیان ژن CLF با استفاده از تکنیک RNA Silencing انجام گرفت. برای این کار، ابتدا قطعه­ کوچکی از ژن CLF به گونه­ای در وکتور pFGC5941 همسانه سازی شد که بتواند در سلول­های گیاه هدف، یک RNA دو رشته­ای (dsRNA) تولید کند. این مولکول از نظر توالی با ژن هدف CLF همولوگ است و RNAهای کوچک حاصل از آن (siRNA) می­توانند منجر به تجزیه­ mRNAهای ژن CLF شوند (شکل 1). برای این منظور قطعه 400 جفت بازی از ژن CLF گیاه مدل آرابیدوپسیس به کمک PCR تکثیر (شکل A-3) و در دو جهت سنس و آنتی­سنس درون وکتور pFGC5941 به کمک جایگاه­های برشی در پایین­دست پروموتر CaMV 35S همسانه سازی ­شده و همسانه سازی صحیح این قطعه در دو جهت سنس و آنتی­سنس، با استفاده از PCR تایید گردید (شکلB-3 و C-3). وکتور حاصل، به کمک آگروباکتریوم و به روش Floral dip به گیاه آرابیدوپسیس انتقال ­یافته و گیاهان تراریخت روی محیط MS حاوی Basta گزینش شدند (شکل 4). انتظار می­رود در گیاهان تراریخت پس از رونویسی قطعه­ انتقال یافته، مولکول­های سنجاق سری dsRNA^­­ از طریق اتصال توالی­های تکرار معکوس تولید ­شوند. این ساختار سنجاق سری در گیاه توسط اندونوکلئازهایی به نام Dicer شناسایی و به siRNA می­شکنند. یک رشته از این RNAهای دو رشته­ای کوچک، درون کمپلکس RISC (RNA Induced Silencing Complex) جای می­گیرد تا اینکه mRNA رونویسی شده از ژن CLF را شناسایی کرده و با آن جفت شود. این کمپلکس با خاصیت RNase H خود باعث خرد شدن mRNA ژن CLF و در نتیجه، خاموشی آن در سطح پس از رونویسی می­شود (Tehseen et al., 2010) (شکل D-1). وقوع این پدیده در گیاهان تراریخت بطور غیر مستقیم به اثبات رسید، به طوری که بر اساس نتایج آزمون  RT-PCR کمی، سطوح رونوشت­های ژن CLF در گیاهان تراریخت حاصل بطور معنی داری نسبت به گیاهان تیپ وحشی کاهش یافته بود (شکلA-6). همچنانکه انتظار می­رفت، گیاهان تراریخته­ نسل دوّم سریعتر از گیاهان تیپ وحشی وارد مرحله­ گلدهی شدند (شکل A-5). همچنین، تعدادی از گیاهان تراریخته­ نسل دوّم قادر به رشد نبودند که می­تواند به دلیل خاموش شدن شدید ژن CLF در این گیاهان باشد. به نظر می­رسد در گیاهان زودگلده حاصل، بیان ژن CLF بطور نسبی کاهش یافته است و حتی تفاوت در زمان گلدهی لاین­های مختلف حاصل را نیز می­توان به تفاوت در میزان خاموشی CLF نسبت داد. این موضوع با استفاده از آزمون RT-PCR کمی تایید شد، بطوریکه بیان CLF در لاین دوّم که گلدهی آن سریعتر از همه­ لاین­ها صورت گرفت، نسبت به بقیه­ لاین­ها کاهش بیشتری نشان داد. کاهش بیان این ژن به اندازه­ای در مکانیسم شروع گلدهی نقش اساسی دارد که مسیرهای موثر دیگر در این مکانیسم توان جبران کمبود بیان این ژن را ندارند. همچنان که انتظار می­رفت،  RT-PCR کمی روی گیاهان تراریخته نشان داد که بیان FT در این گیاهان به شدت افزایش یافته است (شکل C-6). می­توان گفت که برطرف شدن مهار متیلاسیون از روی کروماتین FT در اثر کاهش بیان CLF (که یک متیل ترانسفر­از است) به وسیله­­ ساختار سنجاق سری ایجاد شده، باعث افزایش بیان FT شده است.

ایجاد صفت زود­گلدهی علاوه بر اینکه می­تواند منجر به تولید میوه­ نوبر با ارزش اقتصادی بالاتر شود، در برخی مناطق نیز می­تواند برای انجام کشت دوّم در یک فصل زراعی (به دلیل کوتاه بودن دوره­ رشد گیاه) کاربرد داشته باشد. در تحقیقاتی با استفاده از انتقال ژن FT در آرابیدوپسیس، اطلسی و ارکیده گیاهان زودگلده ایجاد شده است (Huang et al., 2012 و تحقیق چاپ نشده نویسنده). در تحقیقی دیگر در گیاه زینتی Gloxinia با خاموش کردن miR159 در این گیاه فنوتیپ زودگلده و با بیان کردن زیاد آن صفت دیرگلدهی را بدست آوردند (Li et al., 2013). بیان بیش از حد miR171 نیز در جو سبب دیرگلدهی این گیاه شد (Curaba et al., 2013). همزمان با بیان بیشتر ژن SOC1 در ارکیده باعث تولید گیاهان زودگلده شدند (Ding et al., 2013). بیان بیشتر ژن Long Vegetative Phase One (LOV1) متعلق به آرابیدوپسیس نیز در یک تک لپه ای باعث تاخیر در گلدهی آن شد (Xu et al., 2012). پژوهش حاضر به نوبه­ خود جزو اوّلین پروژه­های تحقیقاتی در راستای کاربردی کردن RNA Silencing در ایران می­باشد و نتایج این تحقیق روی گیاه مدل آرابیدوپسیس نشان داد که می­توان برای زودگلده کردن دیگر گیاهان مهم از نظر اقتصادی و کشاورزی از این تکنولوژی استفاده کرد. همچنین، گیاهان ترا­ریخت ایجاد شده، می­توانند برای کشف وظایف دیگر CLF در گیاه و بررسی جنبه­های مختلف این ژن مورد استفاده قرار گیرند.

سپاسگزاری

با تشکر از آزمایشگاه گروه بیوتکنولوژی کشاورزی دانشگاه شهید مدنی آذربایجان خصوصا آقای دکتر محمد احمدآبادی بخاطر مشاوره های ارزشمندشان و همچنین از همکاری انیستیو بیولوژی سلولی و مولکولی گیاهی (IBMP) استراسبورگ فرانسه. این مقاله برگرفته از پایان نامه کارشناسی ارشد خانم ندا دیدار می­باشد که توسط معاونت پژوهشی دانشگاه شهید مدنی آذربایجان حمایت مالی شده است.