Document Type : Research Paper
Authors
Abstract
Keywords
فلور قارچی همراه با علائم داخلی بیماری زوال انگور در استان کرمان
مریم عرب نژاد1، حمید محمدی2*، حسین معصومی3، همایون فرهمند4
1 دانش آموخته کارشناسی ارشد، بخش بیماری شناسی گیاهی، دانشکده کشاورزی، دانشگاه شهید باهنر کرمان
2 استادیار، بخش بیماری شناسی گیاهی، دانشکده کشاورزی، دانشگاه شهید باهنر کرمان
3 استاد، بخش بیماری شناسی گیاهی، دانشکده کشاورزی، دانشگاه شهید باهنر کرمان
4 استادیار، بخش علوم باغبانی، دانشکده کشاورزی، دانشگاه شهید باهنر کرمان
تاریخ دریافت: 19/12/1391، تاریخ پذیرش: 16/06/1392
چکیده
در طول بهار و تابستان سال 1391 برای شناسایی قارچ های بیمارگر و علائم بیماری همراه با زوال درختان انگور، از مناطق مختلف استان کرمان بازدید به عمل آمد و از شاخه و تنه درختان دارای علائم زوال، نمونه برداری شد. جداسازی عوامل قارچی از بافت های تغییر رنگ یافته چوب و با استفاده از محیط کشت عصاره مالت-آگار (Malt Extract Agar = MEA) حاوی 100 میلی گرم بر لیتر از سولفات استرپتومیسین (MEAS) انجام شد. جدایه های به دست آمده بر اساس ویژگی های ریخت شناختی و محیط کشت شناسایی شدند. شناسایی ریخت شناختی جدایه های Phaeoacremonium با تکثیر و تعیین ترادف بخشی از ژن بتا توبولین (b-tubulin gene) با استفاده از دو آغازگر T1 و Bt2b و شناسایی جدایه های Botryosphaeria با تکثیر و تعیین ترادف بخشی از ناحیه ITS (ITS1+ 5.8S+ ITS2) با استفاده از دو آغاز گر ITS4 و ITS5 مورد تایید قرار گرفت. در این مطالعه، 476 جدایه قارچی از درختان بیمار به دست آمد. دو گونه Phaeoacremonium aleophilum و Phaeomoniella chlamydospora به ترتیب با 103 و 50 جدایه دارای بیشترین فراوانی بودند. این نخستین گزارش از شناسایی مولکولی گونه های
Pm. aleophilum، Pa. chlamydospora، Pm. parasiticum و Botryosphaeria dothidea همراه با علائم متنوع داخلی زوال انگور در استان کرمان می باشد.
کلمات کلیدی: بتا توبولین، ITS، Vitis vinifera.
مقدمه
امروزه بیماری های شاخه و تنه درختان انگور از اهمیت خاصی در دنیا برخودارند هر چند که در بسیاری از موارد جنبه های مختلف سبب شناسی، همه گیر شناسی و فیزیولوژی این گونه بیماری ها به دلیل پیچیده بودن آنها مشخص نیست (Surico et al., 2000). به طور کلی، بسته به نوع عامل بیماری ممکن است دامنه گسترده ای از علائم داخلی و خارجی در درختان بیمار مشاهده گردد. از مهمترین بیماری های شاخه و تنه انگور می توان به بیماری پتری، بیماری اسکا، شانکرهای حاصل از اعضای خانواده Botryosphaeriaceae و سرخشکیدگی های ناشی از (Pers. : Fr.) Tul. & C. Tul. Eutypa lata اشاره نمود. از درختان انگور دارای علائم بیماری اسکا قارچ های مختلفی گزارش شده است در این میان بازیدیومیست هایی مانند
Fomitiporia mediterranea M. Fischer عامل پوسیدگی سفید معرفی شده اند (Fischer, 2006) در حالی که گونه های مختلف Phaeoacremonium W. Gams, Crous & M. J. Wingf. وPhaeomoniella chlamydospora (W. Gams, Crous, M.J. Wingf. & L. Crous & W. Gams به عنوان دو هیفومیست مهم به طور عمده باعث تغییر رنگ بافت چوب و آوند می شوند (Surico et al., 2006). علائم هوایی بیماری پتری به صورت کاهش رشد، کوتاه شدن فاصله میانگره ها و لکه های زرد رنگ در نواحی بین رگبرگی (Sidoti et al., 2000) و علائم درونی آن شامل ایجاد رگه های قهوه ای تا سیاه در بافت چوب، تغییر رنگ بافت آوندی و ایجاد نقاط سیاه قابل مشاهده است. معمولا گونه های مختلفی ازPhaeoacremonium وPa. chlamydospora همراه با این بیماری هستند (Mugnai et al., 1999; Edwards & Pascoe, 2004). گونه های Botryosphaeria Ces.&De Not. نیز به عنوان یکی از عوامل بیمارگر شاخه و تنه دارای دامنه میزبانی گسترده ای هستند و برخی از گونه های این جنس مولد بیماری های سرخشکیدگی و شانکر هستند (Michailides, 1991; Smith et al., 1994). اگر چه ممکن است گونه های مختلفBotryosphaeria از علائم متنوع داخلی جداسازی گردند ولی یکی از علائم ویژه آنها ایجاد نکروز گوه ای شکل است که در برش عرضی از شاخه و تنه درختان انگور بیمار به خوبی قابل مشاهده است (Larignon et al., 2001; Pillips, 2002). اولین گزارش از بیماری اسکای انگور در ایران مربوط به سال 2001 از خراسان شمالی (بجنورد) است. در این مطالعه دو گونه F. punctata وPa. chlamydospora به عنوان عوامل بیمارگر از درختان انگور با علائم شبیه به بیماری اسکا جداسازی و شناسایی گردید (Karimi et al., 2001). اگر چه اخیرا مطالعاتی روی بیماری های زوال انگور در ایران صورت گرفته است ولی هیچ گونه اطلاع دقیقی از قارچ های همراه با علائم مختلف داخلی بیماری های شاخه و تنه انگور در استان کرمان در دست نیست. بنابراین، هدف از این مطالعه جداسازی و شناسایی فلور قارچی همراه با بیماری زوال انگور با تاکید بر شناسایی مورفولوژیکی و مولکولی جدایه های Phaeoacremonium و Botryosphaeria و همچنین بررسی تنوع علائم داخلی و خارجی زوال انگور در استان کرمان می باشد.
مواد و روش ها
بازدید و نمونه برداری از باغ های انگور
در طول بهار و تابستان سال 1391 از 50 باغ و 185 درخت (بوته) انگور مربوط به مناطق مختلف استان کرمان شامل: خانوک، محی آباد، قوام آباد، حمیدیه، ماهان، عرب آباد، سیرجان، سیرچ، کرمان، بردسیر، جوپار، هوتک، چترود، گلباف، دلفارد و رابر بازدید به عمل آمد. از هر باغ حداقل سه تا پنج نمونه از شاخه ها و تنه اصلی درختان بیمار که دارای علائم هوایی بیماری شامل زردی برگ ها، کوتولگی و کاهش فاصله میانگره ها، ریزش برگ ها و کم برگی و علائم درونی شامل تغییر رنگ بافت چوب و آوندها به اشکال مختلف بودند، نمونه برداری و برای جداسازی عامل بیماری به آزمایشگاه منتقل شدند. سپس برش های عرضی و طولی از شاخه و تنه درختان آلوده تهیه و از نواحی تغییر رنگ یافته چوب و آوندها قطعاتی به اندازه چهار تا پنج میلی متر جدا و به مدت دو دقیقه در NaOCl نیم درصد، گندزدایی گردید. قطعات سترون شده سه مرحله و هر مرحله به مدت سه دقیقه با آب مقطر سترون شستشو و پس از خشک کردن روی دستمال کاغذی، روی محیط کشت PDA (39 گرم در لیتر، مرک آلمان) و محیط کشت MEA (20 گرم در لیتر، مرک آلمان) حاوی تتراسایکلین (100 میلی گرم در لیتر (Sigma-Aldrich, St Louis, Missouri ) قرار داده شدند. تشتک های پتری در تاریکی و در دمایC º25 نگهداری شدند (Chicau et al., 2000; Rego et al., 2000). جدایه های به دست آمده به روش تک اسپور یا نوک ریسه کردن خالص و با استفاده از ویژگی های ریخت شناختی و میکروسکوپی مورد شناسایی قرار گرفتند.
شناسایی جدایه ها بر اساس ویژگی های ریخت شناختی
جدایه های به دست آمده ابتدا بر اساس ویژگی های ریخت شناختی پرگنه ها و ساختار اندام باردهی شناسایی شدند. گونه های Phaeoacremonium بر اساس ویژگی های محیط کشت، تولید و یا عدم تولید رنگ دانه در سه محیط کشت PDA، MEA و Oat Meal Agar (30 گرم در لیتر، مرک، آلمان) شناسایی شدند. برای مطالعه و ارزیابی ویژگی های میکروسکوپی از قبیل اندازه و شکل کنیدیوم ها، اندازه و شکل فیالیدها، اندازه کنیدیوفورها و زگیل های روی ریسه از کشت های 16 روزه جدایه ها روی محیط کشت MEA استفاده شد (Mostert et al., 2006). در این مورد، شناسایی جدایه های Pa. chlamydospora بر اساس ساختار کنیدیوفور، تولید پیکنیدیوم روی محیط کشت آب-آگار 2% حاوی برگ میخک و یا قطعات اتوکلاو شده شاخه های انگور و ویژگی های پرگنه ها روی محیط کشت PDA و MEA (Crous & Gams, 2000) شناسایی شدند. شناسایی جدایه های Botryosphaeria نیز بر اساس ویژگی های رنگ و بافت پرگنه ها روی محیط کشت PDA و همچنین شکل، رنگ و اندازه اسپورها انجام گرفت (Phillips, 2002; Van Niekerk et al., 2004). برای تولید پیکنیدیوم و افزایش اسپورزایی در جدایه های Botryosphaeria، نخست جدایه ها به محیط کشت PDA حاوی قطعات اتوکلاو شده چوب انگور یا برگ کاج منتقل و در دمای C º25 (شرایط نوری مداوم) قرار گرفتند. میزان رشد جدایه ها نیز روی محیط کشت PDA و در سه دمای 25,20 و C º 30 و بعد از 24، 48 و 72 ساعت ارزیابی شد.
شناسایی مولکولی
برای شناسایی مولکولی جدایه ها ابتدا کل DNA از توده میسلیومی جدایه ها استخراج گردید. برای تولید توده میسلیومی، ابتدا جدایه ها روی محیط کشت MEA کشت و به مدت 20 روز (10 روز برای جدایه های Botryosphaeria) در دمای °C 25 نگهداری شدند. توده میسلیومی تولید شده از روی سطح محیط کشت خراشیده و استخراج DNA با استفاده از کیت Peq Gold Fungal DNA mini Kit (Rosh, Germany) و طبق دستور شرکت سازنده انجام شد. شناسایی مولکولی جدایه های Phaeoacremonium؛ بر اساس روش PCR و تکثیر بخشی از ژن بتا توبولین، با استفاده از آغازگرهایT1 (O’Donnell & Cigelnik, 1997) و Bt2b (Glass & Donaldson, 1995) انجام شد. شناسایی مولکولی جدایه های Botryosphaeria نیز بر اساس روش PCR و تکثیر بخشی از ناحیه ITS1-ITS2 و با استفاده از آغازگرهای ITS4 و ITS5 (White et al., 1990) انجام گردید. واکنش زنجیره ای پلی مراز در حجم 25 میکرو لیتر شامل 5/2 میکرولیتر بافر واکنش X 10، 8/ میکرولیتر کلرید منیزیم (MgCl2)، 5/ میکرولیتر دزوکسی نوکلئوتید تری فسفات (dNTPs)، 25/1 میکرولیتر از هر آغازگر، یک میکرولیتر از DNA ژنومی (DNA template)، 2/ میکرولیتر آنزیم Taq ،Taq DNA polymerase، ( سیناژن، ایران) و 5/17 میکرولیتر آب استریل (Chromasolv Plus, Sigma-Aldrich, Steinheim, Germany) بود که در دستگاه ترموسایکلر (Bio-Rad, USA) انجام شد. برنامه واکنش زنجیره ای پلی مراز شامل واسرشته سازی اولیه در دمای °C 94 به مدت سه دقیقه و 35 چرخه شامل واسرشته سازی DNA در دمای°C 94 به مدت 30 ثانیه، اتصال آغازگرها به رشته الگو در دمای°C 59 به مدت 45 ثانیه، گسترش رشته جدید در دمای°C 72 به مدت یک دقیقه و در پایان گسترش نهایی در دمای°C 72 به مدت 7 دقیقه بود. محصول واکنش زنجیره ای پلی مراز، روی ژل آگاروز یک درصد (UltraPure™ Agarose, Invitrogen, USA) مشاهده گردید. یک نشانگر 100 جفت بازی (GeneRulerTM DNA Ladder Mix, Fermentas, Lithuania) به عنوان نشانگر وزن مولکولی مورد استفاده قرار گرفت. محصول واکنش زنجیره ای پلی مراز با کیتHigh Pure PCR Product Purification Kit (Bioneer, Germany) خالص و جهت تعیین ترادف به شرکت ماکروژن (Seoul, South Korea) ارسال شد.
مقایسه توالی نوکلئوتیدی و آنالیز فیلوژنی جدایه های Phaeoacremonium
برای مقایسه توالی های به دست آمده از جدایههای Pm. aleophilum وPm. parasiticum، در آغاز ترادف های بدست آمده با برنامه Bioedit بررسی شدند و سپس با ترادف های مشابه موجود در بانک ژن در شبکه NCBI (http://ncbi.nlm.nih.gov/Blast) و جستجوی بلاست مقایسه و میزان شباهت هر جدایه با گونه های موجود در بانک ژن، تعیین گردید. ترادف های مربوط به ژن بتاتوبولین جدایه های KERPAL1، KERPAL2 و KERPAL3 از Pm. aleophilum (به ترتیب با شماره دسترسی JX133240، JX133241 و JX133242)، جدایههای KERPR1و KERPR2 ازPm. parasiticum ( به ترتیب با شماره دسترسی JX133243 و JX133244) و ترادف های انتخاب شده از بانک ژن با برنامه Clustal W همردیف سازی و آنالیز فیلوژنی جدایه ها با استفاده از نرم افزار MEGA 5(Tamura et al., 2011) انجام گرفت. درخت فیلوژنتیکی جدایه های مربوطه نیز به روش اتصال مجاور و با Bootstrape 1000 تکرار ترسیم گردید.
نتایج و بحث
نمونه برداری و نشانه های بیماری
در این مطالعه از 50 باغ و 185 درخت انگور نمونه برداری به عمل آمد. در بیشتر مناطق نمونه برداری شده، علائم هوایی در درختان بیمار به صورت سرخشکیدگی، کوچک بودن برگ ها، زرد شدن نواحی بین رگبرگی، کاهش رشد و در نهایت زوال مشاهده شد. چنین علائمی به عنوان علائم بیماری پتری در انگور گزارش شده است (Pascoe & Cottral, 2000; Sidoti et al., 2000). یکی از علائم هوایی که به ندرت در طول این بررسی مشاهده شد، وجود نقوش پوست ببری (زرد و قرمز شدن نواحی بین رگبرگی) روی برگ ها بود که در دو منطقه محی آباد و بردسیر مشاهده شد. چنین علائمی به عنوان یکی از مهمترین نشانه های بیماری اسکا در انگور شناخته می شود (Mugnai et al., 1999). یکی دیگر از علائم هوایی مشاهده شده، سبزخشک شدن تمام بخش های درختان انگور بود که در محی آباد روی چند درخت انگور مسن مشاهده شد که چنین علائمی اصولا به عنوان نشانه های بیماری سکته مو (آپوپلکسی) گزارش شده است (Mugnai et al., 1999). مطالعات نشان داده است که شرایط مختلف آب و هوایی می تواند در بروز علائم بیماری اسکا موثر باشد. معمولا در فصول گرم و خشک سال، علائم مشخصه بیماری اسکا به صورت نهفته (اسکای نهفته) باقی می مانند (Marchi et al., 2006) و از آنجایی که استان کرمان به عنوان یکی از استان های جنوب کشور دارای آب و هوایی نسبتا گرم و خشک است نادر بودن چنین علائمی دور از انتظار نیست. در طول این مطالعه، با برش عرضی از شاخه های درختان بیمار، اشکال مختلفی از تغییر رنگ بافت چوب به صورت نکروز گوه ای شکل، نقاط سیاه رنگ، نکروز مرکزی، پوسیدگی سفید چوب در ناحیه مرکزی، ایجاد رگه های قهوه ای و سیاه رنگ در چوب و نکروز به صورت نامنظم مشاهده شد (شکل 1). بر اساس مطالعات انجام شده؛ شش نوع از علائم متداول داخلی بافت چوب شامل رگه های قهوه ای، رگه های سیاه، نکروز گوه ای شکل، نکروز آبسوخته در بافت، پوسیدگی نرم بافت و نکروز داخلی بافت چوب همراه با بیماری های شاخه و تنه در انگور و همچنین درختان میوه دانه دار از جمله سیب و گلابی گزارش شده است (Van Niekerk et al., 2011). به طور کلی، نشانه های درونی مانند تغییر رنگ بافت آوندی، وجود نقاط سیاه رنگ و رگه های قهوه ای تا سیاهرنگ بیشتر در بیماری پتری انگور مشاهده می شود هر چند که اخیرا در اسپانیا، نکروز گوه ای شکل، نکروز مرکزی و نقاط سیاه رنگ در درختان دارای علائم بیماری اسکا و حتی آپوپلکسی نیز مشاهده شده است (Luque et al., 2009). اصولا تغییر رنگ بافت آوندها و ایجاد نقاط سیاه رنگ در بافت چوب به دلیل واکنش میزبان به وجود عامل بیمارگر و در نتیجه تولید تیلوز، ترشح صمغ و ترکیبات فنولی است (Mugnai et al., 1999; Del Rio et al., 2001). یکی از نکات قابل توجه در مطالعه حاضر، مشاهده چندین نوع نشانه های درونی به صورت همزمان در یک شاخه و یا تنه آلوده بود که نتایجی مشابه از سایر کشور ها از جمله اسپانیا نیز گزارش شده است (Luque et al., 2009; Kuntzmann et al., 2010). چنین حالتی ممکن است به دلیل آلوده شدن همزمان محل هرس توسط چندین گونه باشد و از آنجایی که بیشتر قارچ های بیمارگر شاخه و تنه انگور هوازاد هستند این امر به خوبی صورت می گیرد (Mugnai et al., 1999; Surico et al., 2006; Van Niekerk et al., 2006).
شکل1- علائم داخلی بیماری های شاخه و تنه انگور مشاهده شده در استان کرمان A: لکه های سیاه رنگ B: نکروز مرکزی C: بروز همزمان نکروز نامنظم و لکه های سیاه رنگ D: پوسیدگی چوب و تغییر رنگ بافت چوب E: نکروز گوه ای شکل در برش عرضی (a) و خط سیاهرنگ بر روی سطح چوب در زیر پوست (b) F: وجود رگه های سیاه رنگ.
Figure 1- Internal symptoms of grapevine trunk diseases observed in Kerman province: (A)- Black spots, B-Central necrosis, C- Co–occurrence of irregular necrosis and black spots, D-wood decay and wood discoloration, E-Wedge–shaped necrosis in cross section (a) and a dark stripe on the wood surface just below the bark (b), F- Black wood streaking.
جداسازی و شناسایی جدایه ها بر اساس خصوصیات ریخت شناختی و مولکولی جدایه های Pm. aleophilum و Pm. parasiticum
در این مطالعه؛ 133 جدایه Phaeoacremonium از درختان انگور بیمار جداسازی شد (جدول 1). از این تعداد، 103 جدایه از پراکندگی بیشتری برخوردار بودند به طوری که از بیشتر مناطق نمونه برداری جداسازی شدند. این جدایه ها روی محیط کشت PDA، در ابتدا به رنگ سفید و پس از 16 روز به صورت قهوه ای کمرنگ با بافتی متراکم مشاهده شدند. جدایه های یاد شده در محیط کشت PDA، MEA و OA رنگدانه زرد مشخصی تولید میکردند. بر اساس ویژگی های ریخت شناختی مشاهده شده و با کارگیری کلیدهای شناسایی موجود (Mostert et al., 2006)، جدایه های یاد شده Pm. aleophilum تشخیص داده شدند. 30 جدایه Phaeoacremonium باقی مانده نیز که از درختان انگور بیمار در ماهان، بردسیر، عرب آباد و سیرجان به دست آمده بودند روی محیط کشت PDA، ریسه های هوایی برجسته و بلند تولید کردند و فاقد رنگدانه زرد رنگ روی محیط کشت های به کار رفته بودند. از نظر ویژگی های میکروسکوپی بر روی ریسه ها زگیل های بزرگ مشاهده می شد که قطری بیش از سه میکرون داشتند. کنیدیوفورهای این جدایه ها بلند و منشعب بود و بر اساس ویژگی های گفته شده و با کارگیری کلیدهای شناسایی موجود (Mostert et al., 2006) این جدایه ها Pm. parasiticum تشخیص داده شدند. از بین جدایه های Phaeoacremonium بدست آمده، سه جدایهPm. aleophilum (جدایه های KERPAL2, KERPAL1 و KERPAL3) و دو جدایه از Pm. parasiticum (جدایههای KERPR1 و KERPR2) انتخاب و جهت تایید شناسایی با استفاده از روش PCR مورد بررسی قرار گرفتند. بر اساس نتایج به دست آمده، آغازگرهای T1 و Bt2b باندی حدود 750 جفت باز را برای هر پنج جدایه Phaeoacremonium تکثیر کردند (شکل 2). با تعیین ترادف قطعات ژنومی به دست آمده و جستجو در بانک ژن، سه جدایه KERPAL1، KERPAL2 و KERPAL3 با گونه Pm. aleophilum موجود در بانک ژن (JF275876, Martin et al., 2012) و دو جدایه KERPR1 و KERPR2 نیز با Pm. parasiticum موجود در بانک ژن (GQ144702, Sun & Ju, 2011) 100% شباهت نشان دادند. با توجه به نتایج به دست آمده از رسم درخت فیلوژنی سه جدایه Pm. aleophilum (KERPAL1-3 با شماره های دسترسی 2-JX133240) که در این مطالعه جداسازی و شناسایی شده بودند، با جدایه های Pm. aleophilum مربوط به بانک ژن شامل جدایههای SO-KD-5 (از کشور ترکیه و با شماره دسترسی HM245325)، Y86-15-1x و Pal-184 (از کشور اسپانیا به ترتیب با شمارههای دسترسی JQ044516 و JF275876) و P49 (از کشور الجزایر و با شماره دسترسی HQ605024) با Bootstarp 100 در یک گروه قرار گرفتند. در این رابطه، دو جدایه Pm. parasiticum (KERPR1 با شماره دسترسی JX133243 و KERPR2 با شماره دسترسی JX133244) نیز با جدایه های Pm. parasiticum برگرفته از بانک ژن شامل جدایه های MCCF66.07 (از کشور تایوان و با شماره دسترسی GQ144702)، CBS101007 (از آفریقای جنوبی و با شماره دسترسی AF246804) و P46(از کشور الجزایر و با شماره دسترسی HQ605022) با Bootstrap 100 نیز در یک گروه قرار گرفتند (شکل 4).
جدول 1- تعداد و فراوانی قارچ های جداسازی شده از علائم مختلف داخلی درختان انگور بیمار در استان کرمان.
Table 1- Number and frequency of fungi isolated from symptomatic tissues showing of diseased grapevines in Kerman province.
جدایه های Phaeomoniella chlamydospora
در بررسی انجام شده، 55 جدایه (6/11 درصد کل جدایه ها) از درختان بیمار با علائم سرخشکیدگی و نقوش پوست ببری روی برگ در برخی از مناطق نمونه برداری به دست آمد (جدول 1). جدایه های یاد شده روی محیط کشت آب- آگار 2%، ساختارهایی کلامیدوسپور مانند و روی محیط کشت آب- آگار دو درصد حاوی قطعات برگ میخک و چوب انگور اتوکلاو شده پس از حدود یک ماه، پیکنیدیومهای سیاه و براق شبیه به پیکنیدیوم های Phoma تولید کردند. با توجه به کلیدهای شناسایی (Crous & Gams, 2000)، این جدایه ها Pa. chlamydospora تشخیص داده شدند. گونه Pa. chlamydospora در ابتدا به عنوان Phaeoacremonium chlamydosporum معرفی و توصیف گردید در حالیکه مطالعات بعدی نشان داد که بر خلاف سایر گونه های Phaeoacremonium، این گونه قادر به تولید پیکنیدیوم و همچنین ساختارهای کلامیدوسپور مانند است که در مراحل بعد با بررسی های مولکولی و ریخت شناختی به جنس جدید Phaeomoniella منتقل و به عنوان گونه Pa. chlamydospora معرفی گردید (Crous & Gams, 2000).
جدایه های Botryosphaeria dothidea
از یک درخت انگور بیمار با علائم سرخشکیدگی در ماهان؛ دو جدایه قارچی به دست آمد که با توجه به سرعت رشد بسیار بالا و عدم تولید اسپور روی محیط کشت، در ابتدا به عنوان Botryosphaeria sp. در نظر گرفته شدند. هر دو جدایه پس از حدود 10 روز روی محیط کشت PDA حاوی قطعات چوب سترون شده انگور و برگ کاج، تولید پیکنیدیوم نمودند. با برش پیکنیدیوم ها، اسپورها به رنگ روشن، یک سلولی و کمی کشیده مشاهده شدند. با توجه به کلید های موجود و بر اساس شکل، اندازه و رنگ اسپورها هر دو جدایه به عنوان B. dothidea تشخیص داده شد.
شکل2- قطعه 750 جفت بازی تکثیر شده از ژن بتا توبولین در جدایه های Phaeoacramonium با استفاده از دو آغازگر T1 و Bt2b روی ژل آگاروز 1 درصد: 1 تا 3- جدایه های Pm. aleophilum، 4 تا 6- جدایههای Pm. parasiticum، 7- کنترل منفی 8- نشانگر مولکولی 100 جفت بازی.
Figure 2- A 750 bp amplified fragment from beta tubulin gene of Phaeoacremonium isolates using T1 and Bt2b primers on 1% agarose gel: lanes 1 to 3- Pm. aleophilum isolates, lanes 4 to 6- Pm. parasiticum isolates, lane 7- negative control, lane 8- DNA marker (100 bp).
شکل 3- قطعه 600 جفت بازی تکثیر شده از ناحیه ITS در جدایه های Botryosphaeria dothidea با استفاده از دو آغازگر ITS4 و ITS5 روی ژل آگاروز 1 درصد: 1- نشانگر مولکولی 100 جفت بازی، 2 و 3- جدایه های Botryosphaeria dothidea، 4 - کنترل منفی.
Figure 3- A 600 bp amplified fragment from ITS region of Botryosphaeria dothidea isolates using ITS4 and ITS5 primers on 1% agarose gel: lane 1- DNA marker (100 bp), lanes 2 and 3- Botryosphaeria dothidea isolates, lane 4- negative control.
با استفاده از آغازگرهای ITS4 و ITS5، باندی در حدود 600 جفت باز برای هر دو جدایه Botryospaheria به دست آمد (شکل 3). با تعیین ترادف قطعات ژنومی به دست آمده و جستجو در بانک ژن، هر دو جدایه BDGR1 و BDGR2 با جدایه ای از B. dothidea (AY786322, Phillips et al., 2005) که پیش از این در بانک ژن ثبت شده بود، 100% شباهت نشان دادند. به طور کلی در این مطالعه، 476 جدایه قارچ جداسازی و شناسایی گردید (جدول 1). از کل جدایه های بدست آمده، Pm. aleophilum با 6/21 % و dothidea B. با 4% کل جدایه ها به ترتیب دارای بیشترین و کمترین فراوانی بودند. همچنین جدایه هایی از Pa. chlamydospora، Pm. parasiticum، Paecilomyces variotii، Coniothyrium sp. Nattrassia mangiferae, ،Aspergillus sp. ،Penicillium sp. ، Phoma sp. ،Alternaria sp. و Fusarium sp. از قطعات بافت آلوده کشت داده شده، جداسازی گردیدند (جدول 1). با توجه به نتایج به دست آمده، دو گونه Pm. aleophilum و Pa. chlamydospora به ترتیب با 6/21 و 6/11 درصد بیشترین فراوانی را نشان دادند و Pm. aleophilum نسبت بهPa. chlamydospora از پراکندگی بیشتری برخوردار بود. نتایج مشابهی پیش از این از ایران (Mohammadi et al., 2013) اسپانیا (Armengol et al., 2001)، آرژانتین ( Dupont et al., 2002)، استرالیا (Pascoe & Cottral, 2000)، ایتالیا (Mugnai et al.; 1999) و آفریقای جنوبی (Groenewald et al., 2001) گزارش شده است. در آرژانتین گونه Pa. chlamydospra با فراوانی بیشتری از انگورهای جوان با علائم زوال جداسازی و گزارش شده است (Gatica et al., 2004) در حالیکه در کالیفرنیاPa. chlamydospora به طور غالب از انگورهای بیمار با علائم بیماری پتری و Pm. aleophilum و سایر گونههای Phaeoacremonium بیشتر همراه با علائم بیماری اسکا دیده شده است (.Eskalen et al., 2004). بر اساس یافته های این پژوهش Pm. aleophilum، از پراکندگی زیادی برخوردار بود به طوری که از همه مناطق نمونه برداری و از درختان بیمار با علائم سرخشکیدگی، زوال، نقوش پوست ببری بر روی برگ، زردی و کوتولگی برگ ها و حتی آپولکسی، جداسازی گردیدند. جدایه های یاد شده از بخش های داخلی آلوده چوب با علائم مختلف نکروز نامنظم (19 جدایه)، رگه های قهوه ای تا سیاه رنگ (28 جدایه)، پوسیدگی سفید چوب (5 جدایه)، نکروز منظم مرکزی (7 جدایه)، نقاط سیاه رنگ (10 جدایه) و نکروز گوه ای شکل (34 جدایه) جداسازی و شناسایی شدند (جدول 1). گونه Pa. chlamydospora نسبت به Pm. aleophilum از پراکندگی کمتری برخوردار بود و از علائم درونی نکروز گوه ای شکل (15 جدایه)، نقاط سیاه رنگ (6 جدایه)، رگه های قهوه ای تا سیاه رنگ ( 25 جدایه) و پوسیدگی سفید (15 جدایه) جداسازی گردید. تعداد و فراوانی قارچ های همراه با علائم داخلی چوب، در کشورهای مختلف متفاوت گزارش شده است. در مطالعه ای که در سال 2009 در شمال اسپانیا برای بررسی تنوع علائم داخلی و قارچ های همراه با زوال انگور انجام شد، تعداد 18 جدایه Pm. aleophilum از تمام علائم داخلی مشاهده شده در شاخه های آلوده شامل نکروز گوه ای شکل (2 جدایه)، نکروز مرکزی (11 جدایه)، نقاط سیاه رنگ (4 جدایه) و پوسیدگی سفید (یک جدایه) جداسازی گردید. در حالی که Pa. chlamydospora با فراوانی بیشتر (95 جدایه) از نقاط سیاهرنگ (61 جدایه)، نکروز گوه ای شکل (11 جدایه)، نکروز مرکزی (19 جدایه) و پوسیدگی سفید (4 جدایه) بدست آمده است (Luque et al., 2009). در مطالعه ای مشابه در فرانسه، گونه Pm. aleophiulum به تعداد اندکی و تنها از علائم داخلی به صورت نکروز مرکزی جداسازی شده است در حالیکه Pa. chlamydospora از بیشتر علائم داخلی قابل جداسازی بوده است (Kuntzmann et al., 2010). در کشور الجزایر Pm. aleophilum به عنوان گونه غالب همراه با زوال انگور از علائم داخلی نکروز گوه ای شکل جداسازی و گزارش شده است (Berraf-Tebbal et al., 2012). در پژوهش حاضر، جدایه های Pm. parasiticum از درختان بیمار با علائم هوایی سرخشکیدگی و زوال و از بافت های تغییر رنگ یافته داخلی چوب به صورت رگه های قهوه ای تا سیاهرنگ (14 جدایه)، نقاط سیاهرنگ (9 جدایه) و نکروز گوه ای شکل (7 جدایه) جداسازی شدند. این گونه نیز از علائم مختلف داخلی در انگور از جمله نکروز گوه ای شکل، نکروز مرکزی، لکه های سیاه رنگ و حتی نواحی پوسیده چوب جداسازی شده است (Berraf-Tebbal et al., 2012). در این مطالعه، علائم هوایی همراه با B. dothidea، به صورت سرخشکیدگی مشاهده گردیده است. با ایجاد برش عرضی از شاخه نمونه های بیمار، علائم درونی به صورت تغییر رنگ بافت چوب به صورت گوه ای شکل دیده شد که در ناحیه آلوده با برداشتن پوست شاخه در جهت طولی رگه هایی به شکل قهوه ای و سیاهرنگ مشاهده گردید (شکل 1). یکی از علائم ناشی از گونه های Botryosphaeria، تشکیل رگه های سیاه درست در زیر پوست شاخه های آلوده گزارش شده است (Larignon & Dubos, 2001)، از طرفی تغییر رنگ بافت چوب به صورت گوه ای شکل نیز یکی از علائم مشخصه اعضای Botryosphaeriaceae شناخته می شود (Mugnai et al., 1999). B. dothidea تاکنون از کشورهای مختلفی از جمله پرتقال، آمریکا، برزیل و آفریقای جنوبی گزارش شده است (Phillips, 2002; Phillips, 1998; Crous et al., 2001; Milholland, 1991; Urbez-Torres et al., 2007). این گونه اخیرا از درختان انگور بیمار در آذربایجان غربی و شرقی در ایران نیز گزارش شده است (Arzanlou et al., 2012). بر اساس اطلاعات موجود، این نخستین گزارش از جداسازی و شناسایی مولکولی قارچ های همراه با علائم مختلف درونی زوال انگور در استان کرمان می باشد. تاکنون هشت گونه از جنس Phaeoacremonium و سه گونه از خانواده Botryosphaeriaceae از درختان انگور در ایران گزارش شده است و از آنجایی که استان کرمان به عنوان پهناورترین استان کشور دارای آب و هوای متنوعی است، بررسی های بیشتر از مناطق مختلف برای جداسازی عوامل قارچی همراه با شاخه و تنه انگور لازم و ضروری به نظر میرسد.
سپاسگزاری
این تحقیق به عنوان بخشی از طرح پزوهشی به شماره 90001262 می باشد که توسط صندوق حمایت از پزوشگران و فناوران کشور ( Iran National Science Foundation: INSF) حمایت مالی شده است که بدین وسیله صمیمانه قدردانی می گردد.
شکل4- درخت فیلوژنی رسم شده با استفاده از توالی نوکلئوتیدی ژن بتاتوبولین جدایه های ایرانیPhaeoacremonium aleophilum وPhaeoacremonium parasiticum و گونه های مختلف Phaeoacremonium گرفته شده از بانک ژن با استفاده از نرم افزار MEGA 5. Wuestneia molokaiensis به عنوان Outgroup انتخاب شده است.
Figure 4- Phylogenetic tree based on the comparison of b-tubulin gene sequences between the Phaeoacremonium aleophilum and Phaeoacremonium parasiticum isolates from Iran and the other isolates of Phaeoacremonium species from GenBank using MEGA 5 software. Wuestneia molokaiensis was used as outgroup.
منابع
Armengol J, Vicent A, Torné L, Garcia-Figueres F, Garcia-Jimenez J (2001). Fungi associated with esca and grapevine declines in Spain: a three-year survey. Phytopathologia Mediterranea 40: 325–329.
Arzanlou M, Moshari S, Khodaie S (2012). Botryosphaeria dothidea associated with grapevine decline disease in Iran. Australasian Plant Disease Notes 7: 197–200.
Berraf-Tebbal A, Bouznad Z, Santos JM, Coelho MA, Peros JP, Phillips AJL (2012). Phaeoacremonium species associated with Eutypa dieback and esca of grapevines in Algeria. Phytopathologia Mediterranea 50: S86–97.
Chicau G, Aboim-inglez M, Cabral S, Cabral JPS (2000). Phaeoacremonium chlamydosporum and Phaeoacremonium angustius associated with esca and grapevine decline of Vinho Verde grapevines in northwest Portugal. Phytopathologia Mediterranea 39: 80–86.
Crous PW, Gams W (2000). Phaeomoniella chlamydospora gen. et comb. nov., a causal organism of Petri grapevine decline and esca. Phytopathologia Mediterranea 39: 112–118.
Crous PW, Kang J-C, Braun U (2001). A phylogenetic redefinition of anamorph genera in Mycosphaerella based on ITS rDNA sequence and morphology. Mycologia 93: 1081–1101.
Del Rio JA, Gonzalez A, Fuster MD, Botia J.M, Gomez P, Frias V, Ortuna A (2001). Tylose formation and changes in phenolic compounds of grape roots infected with Phaeomoniella chlamydospora and Phaeoacremonium species. Phytopathologia Mediterranea 40: S394–S399.
Dupont J, Magnin S, Desari C, Gatiga M (2002). ITS and b- tubulin markers help delineate Phaeoacremonium species, and the occurrence of Pm. parasiticum in grapevine disease in Argentina. Mycological Research 106: 1143–1150.
Edwards J, Pascoe L (2004). Occurrence of Phaeomoniella chlamydospora and Phaeoacremonium aleophilum associated with Petri disease and esca in Australian grapevines. Australasian Plant Pathology 33: 273–279.
Eskalen A, Latham SR, Gubler WD (2004). Spore release of Phaeomoniella chlamydospora associated with grapevine cordons in California. Phytopathology 94: S28.
Fischer M (2006). Biodiversity and geographic distribution of Basidiomycetes causing esca-associated white rot in grapevine: a worldwide perspective. Phytopathologia Mediterranea 45: S30–S42.
Gatica M, Cesari C, Escoriaza G (2004). Phellinus species inducing hoja de malvon symptoms on leaves and wood decay on standing grapevine. Phytopathologia Mediterranea 43: 59–65.
Glass NL, Donaldson GC (1995). Development of primer sets designed for use with the PCR to amplify conserved genes from filamentous ascomycetes. Applied and Environmental Microbiology 61: 1323–1330.
Groenewald M, Kang J-C, Crous PW, Gams W (2001). ITS and b-tubulin phylogeny of Phaeoacremonium and Phaeomoniella species. Mycological Research 105: 651–657.
Karimi MR, Mahmoodi B, Kazemiyan M (2001). First report of esca of grapevine in Iran. Phytopathologia Mediterranea 40: 481.
Kuntzmann P, Villaum S, Larignon P, Bertsch C (2010). Esca, BDA and eutypiosis: foliar symptoms, trunk lesions and fungi observed in diseased vinestocks in two vineyards in Alsace. Vitis 49: 71–76.
Larignon P, Dubos B (2001). The villany of Black dead arm. Wines and Vines 3: 86–89.
Larignon P, Fulchie R, Cere L, Dubos B (2001). Observations on black dead arm in French vineyards. Phytopathologia Mediterranea 40: S336–S342.
Luque J, Martos S, Aroca A, Raposo R, Garcia-Figueres F (2009). Symptoms and fungi associated with declining mature grapevine plants in northeast Spain. Journal of Plant Pathology 91: 381–390.
Marchi G, Peduto F, Mugnai L, Di Marco S, Calzarano F, Surico G (2006). Some observations on the relationship of manifest and hidden esca to rainfall. Phytopathologia Mediterranea 45: 117–126.
Martin MT, Cobos R, Martin L, Lopez-Enriquez L (2012). Real-Time PCR Detection of Phaeomoniella chlamydospora and Phaeoacremonium aleophilum. Applied and Environmental Microbiology 78: 3985–3991.
Michailides TJ (1991). Pathogenicity, distribution, sources of inoculum, and infection courts of Botryosphaeria dothidea on pistachio. Phytopathology 81: 566–573.
Milholland RD (1991). Muscadine grapes: Some important diseases and their control. Plant Disease 75: 113–117.
Mohammadi H, Banihashemi Z, Gramaje D, Armengol J (2013). Fungal pathogens associated with grapevine trunk diseases in Iran. Journal of Agricultural Science and Technology 15: 137–150.
Mostert L, Groenewald JZ, Summerbell RC, Gams W, Crous PW (2006). Taxonomy and pathology of Togninia (Diaporthales) and its Phaeoacremonium anamorphs. Studies in Mycology 54: 1–115.
Mugnai L, Graniti A, Surico G (1999). Esca (black measles) and crown wood-streaking: Two old and elusive diseases of grapevines. Plant Disease 83:404–418.
O’Donnell K, Cigelnik E (1997). Two divergent intragenomic rDNA ITS2 types within a monophyletic lineage of the fungus Fusarium are nonorthologous. Molecular and Phylogenetic Evolution 7: 103–116.
Pascoe I, Cottral E (2000). Developments in grapevine trunk diseases research in Australia. Phytopathologia Mediterranea 39: 68–75.
Phillips AJL (2002). Botryosphaeria species associated with diseases of grapevines in Portugal. Phytopathologia Mediterranea 41: 3–18.
Phillips AJL (1998). Botryosphaeria dothidea and other fungi associated with excoriose and dieback of grapevines in Portugal. Journal of Phytopathology 146: 327–332.
Phillips AJL, Alves A, Correia A, Luque J (2005). Two new species of Botryosphaeria with brown, 1-septate ascospores and Dothiorella anamorphs. Mycologia 97: 513–529.
Rego MC, Oliveira H, Carvalho A, Phillips A (2000). Involvement of Phaeoacremonium spp. and Cylindrocarpon destructans with grapevine decline in Portugal. Phytopathologia Mediterranea 39: 76–79.
Sidoti A, Buonocore E, Serges T, Mugnai L (2000). Decline of young grapevines associated with Phaeoacremonium chlamydosporum in Sicily (Italy). Phytopathologia Mediterranea 39: 87–91.
Smith H, Kemp GHJ, Wingfield MJ (1994). Canker and die-back of Eucalyptus in South Africa caused by Botryosphaeria dothidea. Plant Pathology 43: 1031–1034.
Sun P-L, Ju Y-M (2011). Onychomycosis caused by Phaeoacremonium parasiticum: first case report. Mycoses 54: 172–174.
Surico G, Marchi G, Ferrandino FJ, Braccini P, Mugnai L (2000). Analysis of the spatial spread of esca in some Tuscan vineyards (Italy). Phytopathologia Mediterranea 39: 211–224.
Surico G, Mugnai L, Marchi G (2006). Older and more recent observations on esca: a critical overview. Phytopathologia Mediterranea 45: S68–S86.
Tamura K, Peterson D, Peterson N, Stecher G, Nei M, Kumar S (2011). MEGA5: Molecular Evolutionary Genetics Analysis using Maximum Likelihood, Evolutionary Distance, and Maximum Parsimony Methods. Molecular Biology and Evolution 28: 2731–2739.
Úrbez-Torres JR, Leavitt GM, Guerrero JC, Guevara J, Striegler K, Allen A, Gubler WD (2007). Identification of fungal pathogens associated with grapevine cankers in the main grape-growing areas of the United States and Mexico. Phytopathologia Mediterranea 46: 109–110.
Van Niekerk JM, Fourie PH, Halleen F, Crous PW (2006). Botryosphaeria spp. as grapevine trunk disease pathogens Phytopathologia Mediterranea 45: S43–S54.
Van Niekerk JM, Bester W, Halleen F, Crous PW, Fourie PH (2011). The distribution and symptomatology of grapevine trunk diseas pathogens are influenced by climate. Phytopathologia Mediterranea 50: S98–S111.
Van Niekerk JM, Crous PW, Groenewald JZ, Fourie PH, Halleen F (2004). DNA phylogeny, morphology and pathogenicity of Botryosphaeria species on grapevines. Mycologia 96: 781–798.
White TJ, Bruns T, Lee S, Taylor J (1990). Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics. In: Innis MA, Gelfand DH, Sninsky JH, White TJ (eds.), PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications. San Diego, California: Academic Press pp. 315–322.
Fungal flora associated with internal symptoms of grapevine decline in Kerman province
Arabnezhad M. 1, Mohammadi H. *2, Massumi H. 3, Farahmand H. 4
1 M.Sc. student, Department of Plant Protection, College of Agriculture, Shahid Bahonar University of Kerman, Kerman, Iran.
2 Assistant professor, Department of Plant Protection, College of Agriculture, Shahid Bahonar University of Kerman, Kerman, Iran.
3 Professor, Department of Plant Protection, College of Agriculture, Shahid Bahonar University of Kerman, Kerman, Iran.
4 Assistant professor, Department of Horticulture, College of Agriculture, Shahid Bahonar University of Kerman, Kerman, Iran.
Abstract
To study of fungi and symptoms associated with vine trunk diseases, various vineyards in Kerman province were inspected during spring and summer of 2012. Samples showing decline symptoms were collected from trunk and branches of vines. Fungal isolation from affected tissues were done on malt extract agar medium (MEA) supplemented with 1 g l–1 streptomycin sulphate (MEAS). A total of 476 fungal isolates from diseased grapevines were obtained. Fungal isolates were identified based on their morphological and molecular characteristics. Morphological identifications of Phaeoacremonium spp. were confirmed by sequence analysis of partial β-tubulin gene (BT) sequences amplification using primers T1 and Bt2b. Botryosphaeria isolates were also confirmed by amplification and sequence of the internal transcribed spacer (ITS) region using the primers ITS4 and ITS5. The most common fungi isolated from vineyards were Phaeoacremonium aleophilum and Phaeomoniella chlamydospora with 103 and 30 isolates, respectively. This is the first report of molecular identification of Pm. aleophilum, Pa. chlamydospora, Pm. parasiticum and Botryosphaeria dothidea associated with different internal symptoms of vine decline in Kerman province.
Key words: Beta tubulin, ITS, Vitis vinifera.
)
