Identification of microsatellite markers linked to morphological and biochemical traits in Iranian native apple (Malus × domestica .Borkh) cultivars

شناسایی نشانگرهای ریزماهواره مرتبط با صفات مورفولوژیک و بیوشیمیایی در ارقام سیب بومی ایران (Malus × domestica .Borkh)

جواد فرخی^1و2 ، رضا درویش زاده³، حمید حاتمی ملکی*⁴، لطفعلی ناصری¹، فرهاد اصغری¹

¹گروه باغبانی، دانشکده کشاورزی دانشگاه ارومیه

²جهاد دانشگاهی واحد استان اردبیل

³گروه اصلاح و بیوتکنولوژی گیاهی، دانشکده کشاورزی دانشگاه ارومیه

⁴گروه زراعت و اصلاح نباتات، دانشکده کشاورزی دانشگاه مراغه

تاریخ دریافت: 24/04/1392، تاریخ پذیرش: 12/03/1393

چکیده

در این مطالعه، انگشت‌نگاری ژنتیکی 44 رقم سیب بومی ایران با استفاده از 16 جفت آغازگر ریز­ماهواره (SSR) انجام گرفته و سپس ارتباط این نشانگرها با 16صفت مورفولوژیکی و بیوشیمیایی مختلف بررسی شد. بر اساس داده‌های نشانگری، در مجموع 45 آلل توسط 16 جفت آغاز ریزماهواره شناسایی شد. تعداد آلل­‌ها در هر مکان ریزماهواره بین 2 الی 5 عدد متغیر بود و متوسط تعداد آلل 8/2 به دست آمد. در این مطالعه میانگین تعداد آلل مؤثر 2/2 بود محتوای اطلاعات چندشکل از 18/0(Hi03ao3) الی 76/0(CH03c02) نوسان داشت و میانگین آن 49/0 بود. برای شناسایی نشانگرهای مرتبط با صفات مورد مطالعه، تجزیه رگرسیون گام به گام بین داده‌های نشانگری (متغیرهای مستقل) و صفات مورد مطالعه (متغیرهای وابسته) انجام گرفت. نتایج تجزیه ارتباط نشان داد که برای سه صفت زاویه شاخه، شاخص کلروفیل و مساحت مقطع عرضی تنه هیچ نشانگر پیوسته­‌ای وجود ندارد. با توجه به نتایج تجزیه ارتباط، سیزده صفت شامل وزن میوه، حجم میوه، طول میوه، قطر میوه، سفتی میوه، تعداد روز برای رسیدن، اسید آلی، میزان مواد جامد محلول، ویتامین ث، pH، اندازه برگ، طول میان‌گره­‌ها و ارتفاع درخت دارای نشانگرهای ریزماهواره مرتبط با آن‌ها بودند. بیش‌ترین تعداد الل (6 عدد) برای صفت تعداد روز برای رسیدن و کمترین تعداد الل (1 عدد) برای صفات pH، وزن میوه، سفتی میوه و ارتفاع درخت مشاهده گردید. با توجه به پیوستگی برخی از آلل‌های ریزماهواره با برخی از صفات، می­‌توان از این نشانگرها در برنامه‌های به‌نژادی سیب به طور موثری استفاده نمود.

کلمات کلیدی: سیب، انگشت‌نگاری ژنتیکی، نشانگر ریزماهواره، تجزیه ارتباط.

مقدمه

جنس سیب (Malus) از خانوادۀ Rosaceae و زیر­خانوادۀ Pomoideae، آلو­پلی­پلوئیدی از دو خانوادۀ Spiroideae (9x=) و Prunoideae (8x=) است که منجر به ایجاد پایه هاپلوئیدی (17x=) در این زیر خانواده گردیده است (Lespinase et al., 1999). اکثر گونه‌­های زراعی سیب (Malus× domestica. Borkh) دیپلوئید می­باشند و این در حالی است که در داخل برخی از گونه‌­ها سطوح مختلف پلوئیدی نیز دیده می­‌شود (Way et al., 1989). سیب نه تنها به خاطر ارزش اقتصادی آن، همچنین به دلیل اندازه کوچک نسبی ژنومی­‌اش (75Mb/hapliod) به صورت یک گونه مدل برای تحقیقات کاربردی ژنومی در اکثر نهاندانگان چوبی مورد استفاده قرار می­گیرد (Way et al., 1989). کشور ایران با تولید سالیانه حدود 2 میلیون و 431 هزار ونهصد ونود تن سیب دارای رتبه پنجم تولید در جهان است (FAOSTAT, 2011). . علی­رغم اهمیت این محصول در ایران کارهای اصلاحی زیادی در مورد افزایش مقاومت به بیماری‌ها، آفات و کیفیت محصول در ارقام بومی صورت نگرفته و بیشتر از ارقام شناخته‌شده خارجی (وارداتی) استفاده می­شود. با توجه به ژرم پلاسم غنی سیب موجود در کشور، می­بایستی مطالعه پس زمینه ژنتیکی صفات مورفولوژیک ارقام بومی را جدی‌تر دنبال نمود تا گام عمده‌ای در زمینه اصلاح سیب برداشته شود. یکی از ابزارهای شناخت ژنتیکی هر محصولی استفاده از نشانگرهای مولکولی است (Goldstein et al., 1995). نشانگرهای مختلفی برای بررسی تنوع ژنتیکی سیب به کار رفته­‌اند ولی هیچ یک از آن‌ها کارایی نشانگرهای SSR‌ را نداشته­اند. به طوری که اکثر کارهای تحقیقاتی در زمینه بررسی تنوع ژنتیکی سیب­های بومی ایران با استفاده از نشانگر SSR  انجام گرفته است (Naghshin et al., 2008; Gharghari et al., 2009; Jahromi-Shirazhi et al., 2009). شناسایی مکان­های ژنی کنترل‌کننده صفات و گزینش به کمک نشانگر، ابزاری مناسب برای گزینش صفات با وراثت‌پذیری پایین و با قابلیت ظهور در مراحل انتهایی رشد و توسعه گیاه می­باشند (Davies et al., 2006; Ender et al., 2008 ). مکان­یابی ژن­های کنترل‌کننده صفات مورفولوژیک در سیب بر اساس تجزیه­های مبتنی بر پیوستگی (Linkage-based analysis) و با استفاده از نشانگرهای مولکولی انجام گرفته است (Liebhard et al., 2002; Silfverberg-Dilworth et al., 2006). اولین گروه پیوستگی با استفاده نشانگرهای SSR به همراه نشانگرهای آیزوزایم‌ و RFLP در یک جمعیت مشتمل بر 152 دانهال حاصل از تلاقی ارقام Prima × Fiesta ایجاد شد که منجر به ارائه 17 گروه پیوستگی ژنی گردید (Maliepaard et al., 1999). سالها پیش نقشه کامل ژنوم سیب با 129نشانگر ریز ماهواره و تعداد زیادی از نشانگرهای غالب مثل AFLP و همچنین RAPD ایجاد گردیه است (Liebhard et al., 2002). با این وجود تهیه نقشه ژنتیکی به این روش محدودیت­های خاص خود را دارد از جمله آن اینکه امکان مکانی‌یابی دقیق ژن‌ها و QTL ها مقدور نبوده، شناسایی نواحی کروموزومی مشکل‌تر بوده و احتمال بروز کراسینگ اور نیز در جمعیت در حال تفرق زیاد است. همچنین نیازمند تهیه جمعیت در حال تفرق است که نیازمند زمان بیشتری است (Abdollahi et al., 2010). بنابر­این می­‌توان با انجام یک آنالیز ارتباط از داده‌­های فنوتیپی چند­ساله استفاده نمود. کارایی این آنالیز در مکان­‌یابی و کنترل صفات مندلی در چندین محصول زراعی به اثبات رسیده است. برای مثال در بررسی 55 لاین گندم با 55 نشانگر ریزماهواره، 38 نشانگر SAMPL و 54 نشانگرAFLP  ملاحظه شد که حداقل با یکی از 14 صفت زراعی مورد مطالعه مرتبط بوده و می­‌تواند به عنوان نشانگر کارآمدی برای برنامه‌های گزینش به کمک نشانگر این صفات معرفی شود (Roy et al., 2006). همچنین تجزیه ارتباط بر روی 68 ژنوتیپ بادام‌زمینی ایرانی با 13 جفت آغازگر SSR نشان داد که همه مکان‌ها بجز pPGPseq-2C11 روی صفات مورد مطالعه موثر بودند (Abdollahi et al., 2010). در مورد استفاده از تجزیه‌ ارتباط برای شناسایی نشانگرهای مرتبط با صفات مورفولوژیک در ارقام بومی و خارجی سیب گزارش‌های محدودی وجود دارد. در این پژوهش، پس از ثبت ژنوتیپی (با استفاده از نشانگرهای SSR) و ثبت فنوتیپی (در سه سال زراعی) 44 رقم سیب شناخته‌شده ایرانی، نشانگرهای پیوسته با صفات مورفولوژیک با استفاده از تجزیه ارتباط شناسایی گردیدند.

 مواد و روش‌ها

مواد گیاهی و ثبت فنوتیپی افراد: در این مطالعه، تعداد 44 ژنوتیپ سیب با خاستگاه­های مختلف از بانک ژن ایستگاه تحقیقات کشاورزی کهریز واقع در استان آذربایجان غربی انتخاب گردیدند (جدول 1). درختان کاشته شده ده ساله بوده و در قالب طرح آماری آگمنت (هر بلوک 17 ژنوتیپ با سه ژنوتیپ شاهد) کاشته شده بودند. فاصله کاشت 5 در 5 متر بود و انجام هرس و سایر مراقبت‌های زراعی بر اساس آنچه که برای تمام باغات سیب معمولی متداول است، اعمال شد. انتخاب ارقام از بلوک‌های مختلف صورت گرفت. تعداد 16 صفت مورفولوژیکی مختلف بر روی میوه، برگ و نیز خود درخت در محل باغ مورد بررسی قرار گرفت. صفات گیاهی و وسیله  و روش اندازه گیری آن ها عبارت بودند از: وزن میوه (گرم) توسط ترازوی دیجیتالی، حجم میوه (سانتیمتر مکعب) توسط غوطه ورسازی در استوانه مدرج، طول و قطر میوه توسط کولیس دیجیتالی، سفتی میوه به وسیله حذف پوست میوه توسط سفتی سنج مگنس- تیلور مجهز به پروب 8 میلی متری برای میوه های کوچک و 11میلی متری برای اقسام بزرگ تر، تعداد روز برای رسیدن براساس تعداد روزهای لازم بعد از تمام گل تا اولین برداشت، مواد جامد محلول توسط رفرکتومتر دستی، ویتامین ث میوه (میلی گرم در صد میلی لیتر) و اسیدآلی میوه ( گرم در 100 میلی لیتر)  هر دو توسط روش توضیح داده شده (Rangana, 1977) ،pH  میوه به وسیله pH متر، اندازه برگ  توسط دستگاه  LAIمتر، طول میانگره‌ها، ارتفاع درخت و مساحت مقطع عرضی تنه هر سه توسط متر نواری، زاویه شاخه با امتیاز دهی به صورت: ]بسته =1 ، نیمه باز=2 و باز=3 [ و  شاخص کلروفیل(میلی گرم در صد گرم) توسط SPAD مدل (502 Japan,). اندازه­گیری صفات بر اساس دیسکریپتور مخصوص برای این محصول و زیر نظر معیارهای پذیرفته‌شده سازمان تحقیقات جهاد کشاورزی بود. در این مطالعه، به دلیل مبارزه شیمیایی با آفات و بیماری‌های درختان موجود درکلکسیون، به بررسی آن‌ها پرداخته نشد.

جدول 1- اسامی 44 رقم سیب مورد مطالعه بر اساس دیسکریپتور.

Table 1- The Names of 44 studied apple cultivars based on descriptor.

استخراج DNA ژنومی: استخراج DNA از برگ با استفاده از روش (Dellaporta et al., 1983) انجام شد. کیفیت DNA ژنومی استخراجی به وسیله الکتروفورز ژل آگارز 1 درصد تعیین گردید. از بین 60 جفت آغازگر SSR تعداد 16 جفت بر اساس الگوی چندشکلی اولیه انتخاب گردیدند (جدول 2). آغازگرهای سریCH  عمدتاً توسط (Liebhard et al., 2002) توسعه یافته­‌اند. هر 4 آغازگر بکار رفته سری Hi دارای توالی تکراری کامل به صورت n(AG/CT) می‌‌باشند که‌‌ توسط (Silfverberg - Dilworth et al., 2006) طراحی شده‌اند (جدول 3). ثبت ژنوتیپی افراد با نشانگر ریز ماهواره: واکنش زنجیره­ای پلی­‌مراز (PCR) در حجم 25 میکرولیتر شامل 5/12 میکرولیتر کیت PCR از شرکت سیناژن [200 میلی­مولار Tris-Hcl با pH=8.55، 160 میلی­مولار 2 SO4(NH4) یک درصد، 3 میلی­مولار MgCl₂، 4/0 میلی­مولار dNTPs و (یک واحد)U 1[Taq DNA polymerase، 1 میکرومولار از هر آغازگر و 50 نانوگرم از DNA الگو در دستگاه ترموسایکلر (PerkinElmer–Applied Biosystems)® انجام گرفت. الگوی دمایی مورد استفاده در واکنش PCR عبارت بود از: یک چرخهC °95 به مدت 2 دقیقه برای واسرشت سازی اولیهDNA ، 35 چرخه شامل: به ترتیبC °93 به مدت 45 ثانیه دمای واسرشت سازی، C°50 تا 55 دمای اتصال (بسته به هر جفت آغازگر) به مدت 60 ثانیه و C°72 دمای گسترش به مدت 45 ثانیه و بالأخره در انتها جهت تکمیل مرحله گسترش یک چرخه C°72 به مدت 10 دقیقه اعمال گردید.

جدول 2- توالی معکوس و پیشرو آغازگرهای بکار رفته در این مطالعه.

Table 2 - Reverse and Forward Sequences of used primers for this study.

فراورده­های PCR پس از اضافه نمودن 10 میکرولیتر بافر نمونه­گذاری به آن‌ها، توسط ژل آگارز 3 درصد از همدیگر تفکیک شدند. برای اطمینان از اندازه آللی هرمکان ژنی و درستی تکثیر آن ها از نشانگر وزن مولکولی kb1 در هر ژل استفاده شد. اندازه قطعات نشانگر وزن مولکولی بین 100 تا 1000 bp متغیر بود. رنگ­امیزی و عکس­برداری از ژل‌ها به ترتیب با استفاده از ماده اتیدیوم بروماید (1μg/ml) و دستگاه ژل داک (Gel Logic 212 PRO, USA) صورت گرفت.

جدول 3- دامنه اندازه آللی، تعدادآلل ،تعدادآلل‌های موثر و محتوای اطلاعاتی حاصل از چندشکلی ارقام تحت بررسی.

Table 3- Size range of alleles, number of alleles, number of effective alleles and polymorphic information content (PIC) values of studied cultivars.

تجزیه داده­ها

امتیازدهی الگوی باند­ها، به صورت یک برای وجود نوار و صفر برای عدم وجود نوار انجام شد. شاخص PIC با استفاده از فرمول محاسبه گردید. در این فرمول Pi فراوانی آللiام در یک مکان مشخص است. تعداد آلل‌ موثر برای هر جایگاه ریزماهواره­ای به کمک نرم‌افزارPopgene  نسخه31/1 (Yeh et al., 1999) محاسبه شد. برای شناسایی نشانگرهای مرتبط با صفات مورفولوژیک مورد مطالعه، تجزیه رگرسیون گام به گام با در نظر گرفتن نشانگرها به عنوان متغیر مستقل و صفات مورفولوژیک به عنوان متغیرهای وابسته و با استفاده از نرم‌افزار SPSS نسخه 15 (Levesque, 2007) انجام گردید.

نتایج و بحث

نتایج نشان داد که همه مکان‌های ریزماهواره مورد استفاده دارای الگوی نواری چندشکل می­باشند. چندشکلی نشانگرهای ریزماهواره در ارقام تحت بررسی با بررسی­های(Guilford et al.,1997; Silfverberg-Dilworth et al., 2006) مطابقت داشت. در مجموع، 45 آلل توسط آغازگرهای ریزماهواره­ای تولید شد (جدول 2). متوسط تعداد آلل، 8/2 در هر مکان ژنی به دست آمد (جدول 2). این ارزش عددی مشابه با متوسط تعداد آلل­های SSR به دست آمده در مورد گیاهان خود گرده­افشان و یک ساله مانند گوجه‌فرنگی 5/1 تا 1/3 آلل در هر مکان ژنی (Broun and Tanksly, 1996)، گندم 8/3 آلل (Devos et al., 1996) سورگوم 3/2 آلل (Brown et al., 1996) خیار 6/2 تا 9/2 (Katzir et al., 1996) و هندوانه 2 آلل در هر مکان ژنی (Jarret et al., 1996) است. در این تحقیق، بیش‌ترین تعداد آلل (5) در مکان ژنی CH03c02 مشاهده شد که اندازه آن‌ها بین 116 الی 136 جفت باز متغیر بود (جدول2). از طرفی تعداد ‌آلل­های ایجاد شده خیلی کمتر از موارد گزارش شده با استفاده از این آغازگرها در مطالعات قبلی بود (Liebhard et al., 2002; Silfverberg-Dilworth et al., 2006). فقط تعداد آلل مربوط به مکان ژنی CH03c02، با مطالعات قبلی در توافق بود. علیرغم اینکه سیب گیاهی دگرگرده­افشان است و انتظار می­رود که تعداد آلل­های بالایی را در هر مکان ژنی نشان دهد (Gianfrancesch et al., 1998; Hokanson et al., 1998)، نتایج نشان داد که تعداد آلل به دست آمده در مقایسه با مقادیر محاسبه شده در تحقیقات قبلی پایین است. نتایج نشان داد که میانگین تعداد آلل موثر 2/2 است که از 4/1 در مکان ژنی CH02h11a الی 68/3 در مکان ژنی CH03c02 متغیر است (جدول2). شاخص PIC نشان‌دهنده تعداد زیاد آلل و چندشکلی بالا است (Powell, 1996). در تحقیق حاضر کمترین مقدار محتوی اطلاعات چندشکل (PIC) در مکان ژنیHi03ao3 (18/0) و بیشترین مقدار آن در مکان ریزماهواره­ای CH03c02 (76/0) مشاهده گردید. میانگین PIC، 49/0 می­باشد که دلالت بر ظرفیت نسبتاً متوسط آغازگرهای مورد استفاده در توجیه چندشکلی موجود در ژرم پلاسم سیب دارد (جدول2). در مطالعه­ای که روی ارقام سیب گلاب ایرانی انجام گردید، مقدار شاخص PIC در محدوده 37/0 تا 77/0 و با میانگین 68/0 گزارش گردید (, 2008.Naghshin et al). همچنین در تحقیقی دیگر که بر روی 24 ژنوتیپ سیب بومی ایران و 5 پایه بومی و خارجی سیب انجام گرفت، متوسط شاخصPIC ، 8/0 به دست آمد (Jahrommi- Shirazhi et al., 2009).

نتایج تجزیه ارتباط ژنوتیپ­ها بر اساس نشانگرهای ریز ماهواره و ارزش فنوتیپی آن با استفاده از تجزیه رگرسیون گام به گام برای شناسایی نواحی ژنومی دخیل در کنترل این صفات در سیب در جدول 4 درج شده است. نتایج تجزیه واریانس رگرسیون نشان داد که اکثر مکان­های ریزماهواره­ای مورد مطالعه با 2 یا 3 صفت مورفولوژیک در ارتباط می­باشند (جدول 4). در این مطالعه، صفات زاویه شاخه، شاخص کلروفیل و قطر تنه رابطه معنی­دار با هیچ یک از نشانگرهای SSR نداشتند. در مجموع 45 آلل از 16 نشانگر ریزماهواره مورد استفاده ارتباط معنی­دار با تغییرات 13 صفت داشتند. صفت تعداد روز تا رسیدن میوه با 6 آلل و صفات ارتفاع درخت، وزن میوه، سفتی میوه و pH  هریک با 1 آلل به ترتیب بیش‌ترین و کمترین تعداد آلل مرتبط را داشتند(جدول 4). مکان ژنی 3 با صفات حجم میوه، وسعت پهنای برگ (اندازه برگ) و تعداد روز برای رسیدن پیوستگی زیادی (بالای 80/0) نشان داد (جدول4). احتمال می­رود که این مکان با عوامل ژنی دخیل در تولید میوه درشت، قرمز خوش‌رنگ و دیررس در ارتباط باشد. نشانگرهایی که بیش‌ترین و حتی کمترین درصد تغییرات را در این تحقیق توجیه می­نمودند، در گروه­های پیوستگی 3، 2، 6 و 12 حاصل از نقشه ژنتیکی سیب قرار دارند (Silfverberg - Dilworth et al., 2006; Liebhard et al., 2002). در این تحقیق، صفت ارتفاع درخت با آلل دوم مکان ژنی CH03d12 پیوستگی دارد (جدول 4) که این مکان ریزماهواره­ای روی گروه پیوستگی 11 در ژنوم سیب قرار دارد (Liebhard et al., 2002). این مکان ژنی 23درصد تغییرات مربوط به صفت ارتفاع درخت را کنترل می­نماید (جدول 4).

تحقیقات قبلی نشان داده که مکان­های ریزماهواره­ای CH03d11 و CH02a010 مسئول رشد ستونی درخت بوده که به ترتیب در روی کروموزوم‌های 10 و 15 قرار دارند (Sheng and Bao, 2005). تمامی این نشانگرها بجز نشانگر CH03e03 دارای توالی تکراری کاملی هستند. سری نشانگرهای Hi در سیب، به خاطر استفاده بیشتر از تکرارهای دو نوکلئوتیدی (GT, AG) درجه چندشکلی بالایی دارند (Silfverberg - Dilworth et al., 2006). در این بین فقط جفت آغازگر Hi03e03 دارای 2 آلل است. در این تحقیق نیز هماند گزارشات قبلی (Selvaraj et al., 2009) گروه بندی خاصی بین مکان‌های ژنی توجیه کننده صفات روی کروموزوم‌ها وجود ندارد بطوریکه یک کروموزوم می­تواند حامل نشانگرهای مرتبط با برخی صفات بوده و این در حالی است که همان کروموزوم ممکن است با صفات دیگر پیوسته نباشد. در داخل یک مکان ژنی منفرد نیز سطوح آللی تاثیرهای مختلفی بر روی صفات دارد. برای مثال آلل سوم مکان ژنی CH03g12z که کمترین ارتباط را با سفتی میوه دارد درحالی‌که آلل اول همان مکان ژنی بیش‌ترین پیوستگی را با صفت حجم میوه نشان می‌دهد. مکان‌های مشترک برای برخی صفات شاید به دلیل پیوستگی مکان‌های مربوطه باشد.

جدول 4– نتایج حاصل از رگرسیون گام به گام بین صفات مورفولوژیک و داده‌های مولکولی برای شناسایی نشانگرهای مرتبط با ارقام مورد مطالعه.  

Table 4- Results of stepwise regression between morphological and molecular data to define informative markers with studied genotypes.                   

نتیجه گیری کلی

تهیه نقشه ژنتیکی و شناسایی QTL ها در درختان چوبی چندساله براحتی محصولات زراعی عمدتا یکساله یا دو ساله صورت نمی گیرد. بنابر­این می­‌توان با استفاده از تجزیه ارتباط از داده‌­های فنوتیپی چند­ساله استفاده نمود. با توجه به اینکه مکان های ریزماهواره ای مورد مطالعه بر روی صفات مورد مطالعه موثر بودند، بنابراین احتمال دارد تا بتوان از این مکان های ژنی در برنامه های اصلاحی برای شناسایی والدین برای تهیه جمعیت های نقشه یابی و نیز تولید هیبرید استفاده نمود.

تقدیر و تشکر

 نویسندگان مقاله بر خود لازم می­دانند تا مراتب تشکر و قدردانی خویش را از کارکنان محترم سازمان تحقیقات کشاورزی کهریز واقع در ارومیه و پژوهشکده زیست فناوری دانشگاه ارومیه به دلیل فراهم آوردن مواد گیاهی و امکانات لازم، به عمل آورند.