Document Type : Research Paper
Authors
Abstract
Keywords
بیان پروتئین نوترکیب اینترفرون گاما در بذر گیاه توتون
صابر اصغر زاده*1، خدیجه باقری2، مختار جلالی جواران3، فریدون مهبودی4
1دانشجوی کارشناسی ارشد بیوتکنولوژی کشاورزی، گروه زراعت و اصلاح نباتات، دانشکده کشاورزی، دانشگاه زنجان.
2استادیار گروه زراعت و اصلاح نباتات، دانشکده کشاورزی، دانشگاه زنجان.
3دانشیار گروه اصلاح نباتات، دانشکده کشاورزی، دانشگاه تربیت مدرس.
4دانشیار بخش بیوتکنولوژی، انستیتو پاستور ایران.
تاریخ دریافت: 19/12/1391، تاریخ پذیرش: 22/12/1392
چکیده
از مهمترین عوامل موثر بر افزایش تولید پروتئین نوترکیب در گیاه، بیان آن در بافت مناسب و نیز افزایش پایداری و تجمع پروتئین با استفاده از عوامل هدفگیری کننده به جایگاههای مناسب سلول است. در این تحقیق برای بیان اینترفرون گامای انسانی در بذر توتون و هدایت آن به شبکه آندوپلاسمی از پیشبرنده اختصاصی بذر (Napin)، توالی کوزاک در انتهای '5 و توالی KDEL در انتهای '3 ژن IFNγ استفاده شد. ژن IFNγ ابتدا در ناقل pGEM®-T Easy همسانهسازی و پس از تایید صحت آن با استفاده از روش PCR، هضم آنزیمی و توالییابی، در ناقل بیانی گیاهی pBI121 زیرهمسانهسازی گردید. ناقل نوترکیب pBI IFNγ به سویه LBA4404 اگرباکتریوم معرفی و این باکتری برای تراریختی ریزنمونههای برگی توتون استفاده شد. نوساقههای باززائی شده در محیط انتخابی حاوی کانامایسین گزینش شدند. آنالیز گیاهان تراریخت در سطح DNA و مشاهده قطعه 432 جفت بازی IFNγ)) و قطعه 795 جفت بازی (NPTII) در واکنش PCR و هضم آنزیمی بیانگر انتقال سازه مدنظر به ژنوم گیاه بود. همچنین رونویسی از ژن IFNγ با RT-PCR تائید شد. بررسیها در سطح پروتئین با استفاده از SDS-PAGE بیان موفقیت آمیز ژن IFNγ را نشان داد. نتایج حاصل نشان میدهد که بذور گیاهی پتانسیل بالایی برای تولید پروتئینهای نوترکیب دارند.
کلمات کلیدی: پیشبر ناپین، توالی KDEL، توالی Kozak، توتون تراریخت، ، ژن IFNγ .
مقدمه
نیاز روز افزون به داروهای بیولوژیک و ارزش اقتصادی بالای آنها از یک طرف و مزایای سیستمهای بیانی گیاهی از طرف دیگر موجب شده که استفاده از گیاهان به عنوان بیوراکتورهای طبیعی در تولید داروها مورد توجه ویژه قرار گیرد. ﻫﺰﻳﻨﻪ ﺗﻮﻟﻴﺪ ﭘﺮوﺗﺌﻴﻦﻫﺎی ﻧﻮﺗﺮﻛﻴﺐ در ﮔﻴﺎﻫﺎن ﺣﺪاﻛﺜﺮ ﻳﻚدﻫﻢ ﺳﻴﺴﺘﻢ ﺗﺨﻤﻴﺮی و ﻳﻚﻫﺰارم ﺳﻠﻮل ﺟﺎﻧﻮری است (Ghislaine et al., 2008). تغییرات پس از ترجمه که برای فعالیت پروتئینهای نوترکیب لازم است، در گیاهان بهتر و مطلوبتر از پروکاریوتها انجام میشود (Fischer et al., 1999). خطرات ناشی از آلودگی با مواد سمی باکتریایی و عوامل بیماریزای انسانی به حداقل میرسد. از طرفی، امکان هدایت پروتئین سنتز شده به اجسام داخل سلولی با هدف پایداری بیشتر، وجود دارد (Daniell et al., 2001). ﺑﺬور ﮔﻴﺎﻫﻲ به دلایلی از جمله: افزایش پایداری پروتئین، تجمع بالای پروتئین در حجم کوچک و ذخیرهسازی راحت آن، استخراج نسبتا راحت به دلیل کم بودن ترکیبات فنولیک و ترکیبات پیچیده پروتئینی و محدود شدن بیان پروتئین به یک اندام ذخیرهای و جلوگیری از اختلال در رشد بافتهای دیگر بیشتر مورد توجه هستند (Boothe et al., 1997).
علاوه بر نوع بافت گیاه، با استفاده از توالیهای هدفگیری کننده به جایگاههای مناسب در سلول نیز می توان موجبات افزایش تجمع پروتئین نوترکیب را فراهم آورد (Droogenbroeck et al., 2006). شبکه آندوپلاسمی سلول (ER) حاوی پروتئینهای چپرونی[1] مختلف است که موجب بستهبندی صحیح پروتئینها شده و از تجمع و تشکیل ساختارهای 3 بعدی ناصحیح جلوگیری میکند. بنابراین قرارگرفتن پروتئین نوترکیب در ER موجب بستهبندی صحیح پروتئین شده و در نتیجه پایداری و تجمع آن افزایش مییابد. توالی KDEL از جمله توالیهایی است که برای قرارگرفتن پروتئین در شبکه آندوپلاسمی در مطالعات متعددی استفاده و کارایی آن به اثبات رسیده است (Conrad & Fiedler, 1998).
از جمله اهداف دیگر در انتقال ژن، افزایش کارایی ترجمه و بیان ترنس ژن است. براساس گزارش کوزاک، وجود توالی حفاظت شده ACCAUGG در اطراف ناحیه کدن شروع، اثر بسیار مطلوبی بر بیان ژن دارد (Kozak, 1986). به همین دلیل در تحقیق حاضر توالی Kozakدر آغازگر پیشبر سازه pBI IFNγ استفاده شد.
اینترفرون گاما (IFNγ) ارزش درمانی بالا و کاربردهای وسیع در پزشکی دارد. برای بیماران با نقص مادرزادی از جمله گرانولوماتوس مزمن[2] (Woodman et al., 1992)، سالمونلا تیفی موریوم (Nauciel & Espinasse, 1992)، سرطانهای مختلف از جمله نوروبلاستوما (Wandelt et al., 1992) و ملانوما (Abdel-wahab et al., 1997) استفاده میشود.
تلاشهای زیادی در جهت تولید انبوه این پروتئین باارزش صورت گرفته اما پروتئین تولید شده در باکتری E. coli ساختار فضایی مناسب نداشته و بخش اعظم آن به فرم انکلوژن بادی در میآید (Wetzel et al., 1991). استفاده از سلولهای یوکاریوتی جهت تولید آنها نیز هزینه بسیار بالایی دارد. به نظر میرسد که دستورزی ژنتیکی گیاهان برای تولید این گروه از پروتئینهای باارزش، یک روش جایگزین مناسب باشد. در این تحقیق سازه بیانی طوری طراحی و ساخته شد تا پروتئین IFNγ در شبکه آندوپلاسمی بذر گیاه توتون بیان شود.
مواد و روشها
ناقلهای ژنی و سویههای باکتری
از باکتری E.coli سویه 'Top10 F و ناقلهای pGEM®-T Easy Vector و pBI121 برای همسانهسازی استفاده شد. برای تراریختی گیاهان از باکتری اگروباکتریوم (Agrobacterium tumefaciens) سویه LBA4404 استفاده گردید.
تکثیر ژن IFNγ همراه توالیهای Kozak ,KEDL و همسانهسازی آنها در ناقل T Easy vector
ژن اینترفرون گامای انسانی توسط معین رضاخانلو و همکاران در سال 2002 جداسازی و تعیین توالی شد و در بانک ژن با شماره AF506749به ثبت رسیده است. تکثیر ژن IFNγ با استفاده از تکنیک PCR و آغازگرهای اختصاصی رفتی (5´-AGA GGA TCC ATG CAG GAC CCA TAT GTA AAA G-3´) با محل برشی BamHI و آغازگر معکوس (5´-GCAGAGCTCTTACAATTCGTCTTTCTGGGATGCTCTTCG-3´) با محل برشی SacI انجام شد. قابل ذکر است که توالی کوزاک در آغازگر رفتی و توالی KDEL در آغازگر معکوس تعبیه شد. در واکنش PCR از غلظتهای استاندارد اجزای مختلف استفاده شد و دمای اتصال آغازگر با رشته الگو °C 63 انتخاب گردید. پس از تکثیر و تخلیص، ژن موردنظر در ناقلpGEM®-T Easy همسانهسازی گردید. سازه تهیه شده به سلولهای مستعد E.coli سویه 'TOP10F منتقل شد. بر روی کلنیهای سفید رشد کرده در محیط انتخابی حاوی آنتیبیوتیکهای آمپیسیلین و تتراسیکلین، IPTG و X-gal، کلنی-PCR با آغازگرهای اختصاصی ژن IFNγ انجام شد. سپس کلونهای PCR مثبت با هضم آنزیمی نیز تایید شدند و در نهایت کلونهای مثبت توالییابی شدند و نتایج توالییابی با نرم افزارBlast و برنامه Clustalw مورد بررسی قرار گرفت.
تهیه سازه بیانی حاوی ژن IFNγ (pBI IFNγ)
ابتدا در ناقل بیانی pBI121، پیشبر اختصاصی بذر Napin جایگزین پیشبر CaMV35S شده و قطعه‌ی Kozak - IFNγ -KDEL با هضم آنزیمی از T-Vector جدا شده و واکنش اتصال قطعه جدا شده با ناقل pBI121 انجام شد و از PCR و هضم آنزیمی برای تایید صحیح بودن کلونینگ استفاده شد ناقل نوترکیبpBI IFNγ به روش انجماد و ذوب به اگرباکتریوم منتقل (sambrook et al., 2001) و سپس انتقال آن با روش کلنی- PCR تایید شد و از این باکتری برای تراریزش ریزنمونههای برگی استفاده شد.
تراریزش ریزنمونههای توتون و باززایی گیاهان تراریخت
ضدعفونی بذرهای توتون رقم Tobacco Xanthi با استفاده از هیپوکلریت سدیم 5% به مدت 10 دقیقه و 5 بار شستشو با آب مقطر استریل هر بار به مدت 10 دقیقه انجام شد. ﺑﺮای ﺟﻮاﻧﻪزﻧﻲ ﺑﺬور از ﻣﺤﻴﻂ MS در دﻣﺎی°C 26 ﺑﺎ دوره ﻧﻮری 16 ﺳﺎﻋﺖ روﺷﻨﺎﻳﻲ و 8 ﺳﺎﻋﺖ ﺗﺎرﻳﻜﻲ اﺳﺘﻔﺎده ﺷﺪ. بعد از ۲ هفته گیاهان رشد کرده و جوانترین برگها با طول تقریبا ۴ سانتیمتر برای تراریخت نمودن انتخاب گشته (که هرکدام از آنها به ۸ تا ۱۰ قطعه تقسیم شدند) و جهت تلقیح آماده شدند. ﻳﻚ روز ﻗﺒﻞ از اﻧﺠﺎم آﻟﻮدﮔﻲ، ﺗﻚ ﻛﻠﻨﻲﻫﺎی اﮔﺮوﺑﺎﻛﺘﺮﻳﻮم ﺣﺎوی ﺳﺎزه ﻣﻮرد ﻧﻈﺮ در ﻣﺤﻴﻂ (g/ml + LBµ50) ﻛﺎﻧﺎﻣﺎﻳﺴﻴﻦ در دﻣﺎی°C 28 وﺗﺎرﻳﻜﻲ ﻛﺸﺖ داده ﺷﺪ، وﻗﺘﻲ ﻛﻪ OD ﺑﺎﻛﺘﺮی رﺷﺪ ﻛﺮده ﺑﻪ 5/0-1 رﺳﻴﺪ، در دﻣﺎی°C 4 و دور rpm 3500 ﺑﻪ ﻣﺪت 5 -8 دﻗﻴﻘﻪ ﺳﺎﻧﺘﺮﻳﻔﻮژ ﺷﺪ. ﭘﺲ از ﺧﺎرج ﻧﻤﻮدن ﻣﺤﻴﻂ ﻛﺸﺖ ﺑﺎﻛﺘﺮی (LB)، ﻣﺤﻴﻂ ﺗﻠﻘﻴﺢ (MS مایع و هورمون‌های BAP با غلظت mg/l3 و NAA به مقدارmg/l 1/0) ﺑﻪ ﺳﻠﻮﻟﻬﺎی ﺑﺎﻛﺘﺮی رﺳﻮب داده ﺷﺪه اﺿﺎﻓﻪ و ﺳﻠﻮلﻫﺎ ﻛﺎﻣﻼ در آن ﺣﻞ ﺷﺪﻧﺪ. ﺑﻌﺪ ازآﻣﺎده ﻛﺮدن ﺳﻮﺳﭙﺎﻧﺴﻴﻮن ﺑﺎﻛﺘﺮی، رﻳﺰﻧﻤﻮﻧﻪﻫﺎ ﺑﻪ ﻣﺪت 20-30 دقیقه در ﺗﻤﺎس ﺑﺎ ﺳﻮﺳﭙﺎﻧﺴﻴﻮن اﮔﺮوﺑﺎﻛﺘﺮﻳﻮم ﺣﺎوی ناقل ﻣﻮرد ﻧﻈﺮ(pBI IFNγ) ﻗﺮار ﮔﺮﻓﺘﻪ و در ﭘﺘﺮیدﻳﺶﻫﺎی ﺣﺎوی ﻣﺤﻴﻂ ﻫﻢ ﻛﺸﺘﻲ (MS کامل و هورمون‌های BAP با غلظت mg/l3 و NAA به مقدارmg/l 1/0) ﺑﻪ ﻣﺪت48 اﻟﻲ 72 ﺳﺎﻋﺖ در دﻣﺎی°C 26 در ﺗﺎرﻳﻜﻲ ﻗﺮار داده ﺷﺪﻧﺪ. در ﻣﺮﺣﻠﻪ ﺑﻌﺪی اﻳﻦ رﻳﺰﻧﻤﻮﻧﻪﻫﺎ ﺑﺮ روی ﻣﺤﻴﻂ ﻛﺸﺖ اﻧﺘﺨﺎﺑﻲ(MS کامل، هورمون‌های BAP با غلظت mg/l3 و NAA به مقدارmg/l 1/0 و آنتیبیوتیکهای کانامایسین با غلظت µg/ml100-25 و سفوتاکسیم با غلظت µg/ml200 ) (ﺑﻪ ﻣﻨﻈﻮر ﮔﺰﻳﻨﺶ ﮔﻴﺎﻫﭽﻪﻫﺎی ﺗﺮارﻳﺨﺘﻪ) در دﻣﺎ و دوره ﻧﻮری ﻣﺸﺎﺑﻪ ﻣﺮﺣﻠﻪ ﻗﺒﻞ ﺑﻪ ﻣﺪت 4ﻫﻔﺘﻪ ﻧﮕﻬﺪاری ﺷﺪﻧﺪ. واﻛﺸﺖ ﻧﻤﻮﻧﻪﻫﺎ ﺑﻪ ﻓﺎﺻﻠﻪ ﻫﺮ 15 روز ﻳﻚﺑﺎر اﻧﺠﺎم ﺷﺪ. ﺑﺮای ﻃﻮﻳﻞ ﺷﺪن ﺳﺎﻗﻪ از ﻣﺤﻴﻂ طویل شدن ساقه(MS کامل به‌همراه µg/ml100 آنتیبیوتیک کانامایسین) و ﺑﺮای رﻳﺸﻪزاﺋﻲ ﻧﻮﺳﺎﻗﻪﻫﺎی ﺑﺪﺳﺖ آﻣﺪه از ﻣﺤﻴﻂ ریشهزایی (MS کامل به‌همراه µg/ml1/0 هورمون NAA) اﺳﺘﻔﺎده ﺷﺪ. در ﻣﺮﺣﻠﻪ آﺧﺮ، ﮔﻴﺎﻫﺎن رﻳﺸﻪدار ﺷﺪه اﺑﺘﺪا ﺑﻪ ﮔﻠﺪانﻫﺎی ﺣﺎوی ﭘﺮﻟﻴﺖ (در دﻣﺎ و ﻧﻮر ﻣﺸﺎﺑﻪ ﻣﺮﺣﻠﻪ ﻗﺒﻞ) و ﺳﭙﺲ ﺑﻪ ﺧﺎک ﻣﻨﺘﻘﻞ ﺷﺪه و در ﺷﺮاﻳﻂ ﮔﻠﺨﺎﻧﻪ ﻧﮕﻬﺪاری ﺷﺪﻧﺪ. ﺑﺬور ﺟﻤﻊآوری ﺷﺪه از ﮔﻴﺎﻫﺎن ﺗﺮارﻳﺨﺘﻪ ﺟﻬﺖ آﻧﺎﻟﻴﺰﻫﺎی ﺑﻌﺪی ﻣﻮرد اﺳﺘﻔﺎده ﻗﺮارﮔﺮﻓﺖ.
ﺑﺮرﺳﻲ ﻣﻮﻟﻜﻮﻟﻲ ﮔﻴﺎﻫﺎن ﺗﺮارﻳﺨﺘﻪ در ﺳﻄﺢ DNA
DNA ژنومی از ﺑﺮگﻫﺎی ﺟﻮان ﮔﻴﺎﻫﺎن ﺗﺮارﻳﺨﺖ و ﺷﺎﻫﺪ (ﮔﻴﺎه ﻏﻴﺮﺗﺮارﻳﺨﺖ)، ﺑﺎ روش دلاپورتا اﺳﺘﺨﺮاج ﺷﺪ(Dellaporta et al., 1983). ﺳﭙﺲ ﺑﺎ اﺳﺘﻔﺎده از آﻏﺎزﮔﺮﻫﺎی اﺧﺘﺼﺎﺻﻲ ژن nptII و ژن IFNγ واﻛﻨﺶ PCR ﺑﺮ روی ﮔﻴﺎﻫﺎن ﮔﺰﻳﻨﺶ ﺷﺪه در ﻣﺤﻴﻂ اﻧﺘﺨﺎﺑﻲ اﻧﺠﺎم ﺷﺪ. واکنش هضم آنزیمی نیز با آنزیم XbaI بر روی محصول PCR انجام گرفت.
ﺑﺮرﺳﻲ ﻣﻮﻟﻜﻮﻟﻲ ﮔﻴﺎﻫﺎن ﺗﺮارﻳﺨﺘﻪ در ﺳﻄﺢ RNA
ﺑﺮای ﺑﺮرﺳﻲ ﺑﻴﺎن ژن در ﺳﻄﺢ RNA از روش RT-PCR اﺳﺘﻔﺎده ﺷﺪ. استخراج RNA از بافتهای بذری نارس با استفاده از محلول استخراج RNA (RNX-Plus - 25ml RN7713C) تهیه شده از شرکت سیناژن، انجام گردید. ساخت cDNA از روی RNAی استخراج شده، بوسیله کیت دومرحلهای RT-PCR (Vivantis,RTPL12) انجام گرفت. قابل ذکر است که برای استخراج RNA، برداشت بذر از گیاهان PCR مثبت، 20 روز پس از گلدهی انجام شد. برای انجام واکنش PCR از آغازگرهای مرحله قبل استفاده شد.
ﺑﺮرﺳﻲ ﻣﻮﻟﻜﻮﻟﻲ ﮔﻴﺎﻫﺎن ﺗﺮارﻳﺨﺘﻪ در ﺳﻄﺢ پروتئین
ﺑﺮای ﺑﺮرﺳﻲ ﺑﻴﺎن ژن در ﺳﻄﺢ پروتئین از روش الکتروفرزی SDS-PAGE اﺳﺘﻔﺎده ﺷﺪ و استخراج پروتئین کل نیز از بذور رسیده گیاهان تراریخت و شاهد (غیرتراریخت) انجام گرفت.
نتایج
جایگزینی پیشبرنده Napin به جای CaMV35S با استفاده از هضم آنزیمی ( HindIII و BamHI) تایید شد به این ترتیب که قطعه bp1140 (مربوط به Napin) به جای قطعه bp835 (مربوط به (CaMV35S قرار گرفت .
همانطور که انتظار میرفت تکثیر ژن IFNγ یک قطعه حدود bp432 تولید نمود(شکل a1). پس از تایید همسانهسازی این قطعه در ناقل TA برای توالییابی اقدام گردید. همسانهسازی مجدد ژن IFNγ در ناقل بیانی گیاهی pBI121 با روش کلنی-PCR و هضم آنزیمی تایید گردید (شکل b1) و نهایتا سازه pBI IFNγ ساخته شد (شکل 2).
شکل1- تکثیر ژن IFNγ با PCR (a) و تائید کلونینگ آن با هضم آنزیمی (b). A) خط 1: قطعه bp432 تکثیر شده، خط 2: نشانگر bp100 و خط3: کنترل منفی b) خط 1: نشانگر bp100، خط 2: ناقلpBI IFNγ برش داده شده با آنزیم BamHIو SacI و قطعه bp432 آزاد شده.
Figure 1- Amplification of the IFNγ gene by PCR (a) and confirmation of cloning by restriction enzyme digestion(b). a) Lane 1: Amplified IFN_γ gene (500 bp); Lane 2: 100 bp ladder. Lane 3: Negative control. b) Lane 1: 100 bp ladder. Lane 2: digested recombinant pBI121 IFNγ plasmid by SacI and SmaI enzymes.
|
شکل2- تصویر ناحیه T-DNA وکتور دوگانهpBI121 IFNγ ، حاوی ژن nptII (مقاومت به کانامایسین)، پیشبرنده Napin، ژن IFNγ، توالی کزاک و توالی KDEL که در ناقل بیانی pBI121 در بین دو ناحیه LB و RB قرار گرفته است.
Figure 2- Schematic diagram of the T-DNA region in the binary vector pBI121 IFN_γ. Including npt II, coding sequence of the neomycin phosphotransferase II gene; napin promoter; IFNγ, human gamma interferon gene; kozak sequence; KDEL, ER retention signal; RB and LB, T-DNA right and left border, respectively.
تراریختی ریزنمونههای برگی توتون در محیط تلقیح انجام شد. ریزنمونههای آلوده شده با آگروباکتریوم، در قسمت حاشیه نسبت به عملکرد آگروباکتریوم واکنش نشان داده و به سمت بالا خم شدند.
پس از ۲ الی ۳ هفته، پیدایش جوانهها از حاشیه زخمی شدة ریزنمونههای تلقیح شده با آگروباکتریوم تراریخت شده مشاهده گردید. ریزنمونههای برگی که بعنوان شاهد (بدون تلقیح بواسطه آگروباکتریوم تراریخت)، بر روی محیط گزینشگر قرار داشتند، باززایی نشان ندادند و سفید رنگ شدند (شکل3).
شکل 3- باززایی نوساقه ها بعد از تلقیح 1. جوانههای اولیه باززایی شده از ریزنمونههای 2 الی3 هفته پس از تلقیح. 2. عدم بازایی در ریزنمونههای شاهد.
Figure 3- Regeneration of shoots after co-cultivation. 1: Regeneration of shoots from leaf disk explants 2-3 weeks after co-cultivation. 2: non regeneration in control explants.
گیاهچههایی که در مقابل کانامایسین مقاومت کرده و سبز باقی ماندند، پس از رشد مناسب و به منظور طویل شدن ساقه و ریشهزایی، به محیط طویل شدن ساقه و پس از رسیدن گیاهچهها به ارتفاع تقریبا پنج سانتیمتر، به محیط ریشهزائی و درون ظروف بزرگتر انتقال یافتند (شکل4).
گیاهان تراریخت ابتدا به پرلایت و سپس به خاک منتقل شدند. حدود یک ماه پس از مرحله گلدهی بذور گیاهان تراریخت رسیده و آماده برداشت شدند (شکل5).
شکل 4- انتقال گیاهچههای باززایی شده از محیط گزینشگر به محیط طویل شدن ساقه (1) و ریشه زایی (2)
Figure 4- Regenerated plantlets transferred from selection medium to shoot elongation (1) and rooting medium (2(.
شکل 5- انتقال گیاهچهها به خاک (1) و گلدهی آنها (2).
Figuew 5- Rooted plantlets transferred to soil (1) and flowered (2).
بررسی مولکولی گیاهان تراریخت در سطح DNA ، RNA و پروتئین
به منظور بررسی مولکولی گیاهان تراریخت در سطح DNAو اطمینان از انتقال ژن هدف به گیاهان تراریخت، پس از استخراج DNA ژنومی از برگ گیاهان نسل اول (T0) و شاهد، واکنش PCR با استفاده از آغازگرهای ژن nptII و آغازگرهای ژن IFNγ انجام شد، که نتیجه آن تکثیر قطعه bp432 مربوط به ژن IFNγ و تکثیر قطعه bp795 مربوط به ژن nptII بود (شکل6).
شکل 6- بررسی انتقال ژنهای IFNγ و nptII به گیاهچه های توتون با استفاده از تکنیک PCR 1- مارکر وزن مولکولی (1Kb DNA Ladder). 2 و 3: قطعه bp432 برای گیاهان تراریخت. 4: کنترل منفی (گیاه شاهد). 5: قطعه bp432 کنترل مثبت. 6 و 7: قطعه bp795 برای گیاهان تراریخت. 8: کنترل منفی. 9: قطعه bp795 کنترل مثبت.
Figure 6- PCR analysis of IFNγ and nptII gene transfer to tobacco seedlings. 1: 1kb ladder 2, 3: amplified IFN_γ gene (transformed seedlings) 4: negative control (wild type plant) 5: positive control (pBI IFNγ plasmid) 6,7: amplified nptII gene (transformed seedlings) 8: negative control (wild type plant) 9: positive control(pBI nptII plasmid).
همچنین واکنش PCR با استفاده از آغازگر اختصاصی رفتی ژن nptII و آغازگر معکوس ژن IFNγ انجام شد. تکثیر قطعه bp3743 حاوی ژن nptII ، پیشبر napin و ژن IFNγ تائید دیگری بود مبنی بر این که این قطعات بطور صحیح و در کنار هم (پیوسته) به گیاهچهها منتقل شدهاند.(شکلa7).
با توجه به اینکه در سازه IFNγ-121PBI بین پیشبر ناپین و ژن IFNγ یک جایگاه برشی اختصاصی برای آنزیم XbaI وجود دارد، با واکنش هضم آنزیمی قطعه bp3743 (بدست آمده از واکنش PCR) دو قطعه bp432 (مربوط به IFNγ) و bp2311 (مربوط به پیشبرنده ناپین و ژن nptII) مشاهده شد که نشان میدهد سازه منتقل شده به گیاه همان سازه مد نظر ما بوده است (شکلb7).
شکل 7- بررسی انتقال قطعه IFNγ-napin-nptII به گیاهچه های توتون با استفاده از PCR (a)و هضم آنزیمی (b). A )1: مارکر 1Kb. 2،3،4،5:قطعه 3743 جفت بازی تکثیر شده (گیاهان باززایی شده). 6: کنترل منفی (گیاهچههای شاهد). 7: کنترل مثبت (پلاسمید IFNγ-121PBI). b: هضم آنزیمی قطعه 3743 جفت بازی (IFNγ-napin-nptII). 1: قطعه 3743 جفت بازی بدون تیمار با آنزیم برشی. 2: مارکر 1Kb. 3: قطعههای 2311 و 432 جفت بازی ایجاد شده پس از هضم آنزیمی.
Figure 7- Analysis of IFNγ-napin-nptII fragment transfer to tobacco seedlings by PCR (a) and digestion (b). a)1: 1kb ladder 2, 3,4,5 amplified 3742bp IFNγ-napin-nptII fragment (transformed seedlings) 6: negative control (wild type plant) 7: positive control (pBI IFNγ plasmid) b) 1: undigested IFNγ-napin-nptII fragment 2: 1kb ladder 3: digested IFNγ-napin-nptII fragment.
گیاهانی که نتیجه PCR آنها مثبت بود برای استخراج RNA انتخاب و cDNA ساخته شده، بعنوان الگو برای انجام RT-PCR مورد استفاده قرار گرفت. برای انجام RT-PCR از آغازگرهای اختصاصی IFNγ (که قطعه bp432 را تکثیر میکنند) استفاده شد. در مرحله انجام PCR، علاوه بر cDNA سنتز شده، از RNA استخراج شده هم بعنوان الگو (کنترل منفی) استفاده شد، این کار بمنظور اطمینان از خلوص RNA استخراج شده (عدم حضور DNA ژنومی) انجام شد. وجود قطعه bp432 در واکنش RT-PCR، سنتز mRNA از روی ژن IFNγ انتقال یافته به گیاهان توتون را تایید کرد. عدم وجود قطعه مشابه در محصول PCR با الگوی RNA استخراج شده عدم وجود هرگونه آلودگی DNA ژنومی را تایید کرد (شکل8).
شکل 8- تایید سنتز mRNA ژن IFNγ با واکنش RT-PCR. 1: قطعه bp432 محصول واکنش RT-PCR (گیاه تراریخت) 2: کنترل منفی (cDNAگیاه شاهد) 3و4: کنترل منفی (RNA کل بذرهای نارس گیاهان تراریخت و شاهد، بعنوان الگو در PCR استفاده شده است). 5. مارکر 1Kb.
Figure 8- RT-PCR analysis of IFNγ gene transcription in tobacco seeds plants. 1: amplified IFN_γ gene in RT-PCR (transformed seedlings) 2: negative control (wild type plant) 3, 4 : negative control (RNA extracted from transgenic and control seeds was used as a template in PCR) 5: 1kb ladder.
آنالیز SDS-PAGE بر روی پروتئینهای استخراج شده از گیاهان تراریخت وجود قطعه اضافی مشخص با وزن حدود Kda36 را در مقایسه با گیاهان شاهد را نشان داد که دوبرابر وزن مولکولی پروتئین IFNγ (Kda 36=2* Kda18) میباشد (شکل 9).
بحث
این تحقیق با هدف استفاده از پتانسیل بالای گیاهان جهت تولید پروتئین اینترفرون گامای انسانی طراحی و اجرا گردید. بمنظور بیان ژن IFNγ در بذر گیاه، پیشبر ناپین (پیشبر اختصاصی بذر) بجای پیشبر CaMV 35S جایگزین شد. در بذور رسیده کلزا، پروتئین Napin، 30-20% پروتئین کل بذر را تشکیل میدهد (Crouch et al., 1981).
شکل 9- بررسی بیان پروتئین IFNγ با SDS-PAGE. 1. نشانگر پروتئین. 2،3. پروتئین کل استخراج شده از بذر گیاهان تراریخت 4. پروتئین استخراج شده از بذر گیاه شاهد.
Figure 9- SDS-PAGE analysis of IFNγ gene expression in tobacco seeds. 1: protein ladder 2,3 total protein extracted from transgenic tobacco seeds 4: total protein extracted from wild type tobacco seeds.
در مطالعات مختلف به منظور افزایش پایداری پروتئین تولید شده در داخل سلول با استفاده از توالی 4 آسیدآمینه (KDEL) آن را به شبکه آندوپلاسمی هدفگیری نمودهاند. با اینکه نتایج این مطالعات تا حدی باهم متفاوت است اما تقریبا در تمام آنها یک نکته مشترک وجود دارد و آن اینکه این توالی موجب افزایش بیان پروتئین نوترکیب میشود. Schouten et al (1997) گزارش کردند که این توالی به خوبی توسط گیرندههای مربوطه شناسایی شده و موجب نگهداری آنتیبادی تولید شده در ER میشود. این مقدار افزایش تولید (تا 100 برابر حالتی که از توالی KDEL استفاده نشود) به دلیل قرار گرفتن آنتیبادی درER و در امان ماندن آن از تجزیه توسط پروتئازها است. هدف دیگر از اضافه کردن توالی KDEL، ممانعت از ورود پروتئین تولید شده به دستگاه گلژی گیاه است. در غشای سیسترون گلژی، گلیکانهای گیاهی به پروتئین نوترکیب اضافه میشود که این گلیکانها در بدن انسان پاسخهای ایمنی را موجب میشوند، در حالی که حضور توالی KDEL از وارد شدن پروتئین به دستگاه گلژی ممانعت بعمل میآورد. نتایج کار (Frigerio et al (2001 نشان داده که توالی KDEL با کارایی بالایی از قرار گرفتن پروتئین در دستگاه گلژی ممانعت بعمل میآورد از طرف دیگر نتایج مطالعات جدیدتر بیانگر این است که اگر در سازه هدف، از پیشبرنده اختصاصی بذر و توالی KDEL به طور همزمان استفاده شود، میزان بیان پروتئین به طور چشمگیری بالا میرود. در تحقیقی Droogenbroeck et al (2006) گزارش کردند که با استفاده از سازه بیانی اختصاصی بذر و هدفگیری پروتئین نوترکیب به شبکه آندوپلاسمی بالاترین میزان بیان ScFv (بیش از 36% پروتئین محلول کل در بذور آرابیدوپسیس) بدست آمد. نتایج این تحقیق نیز نشان داد که ژن IFNγ با موفقیت به گیاه توتون منتقل شده و در دو سطح رونویسی و ترجمه بخوبی بیان میشود. جهت انتقال ژن به گیاه توتون از روش آگروباکتریوم استفاده گردید که امروزه به طور گستردهای جهت تراریختی گیاهان )خصوصا دولپهایها (مورد استفاده قرار میگیرد. در تراریختی توتون این روش مزایای زیادی نسبت به سایر روشهای انتقال ژن دارد که از آن جمله عبارتند از: گیاه توتون به تلقیح با نژادهای آگروباکتریوم (مانند LBA4404) فوق العاده حساس است، گیاهچهها مستقیما و بدون نیاز به تشکیل کالوس باززایی میشوند، گیاهچهها به آسانی از محل لبهای بریده شده ریزنمونه (برگ) که بوسیله آگروباکتریوم حاوی ناقل تلقیح شده است رشد میکنند و کارایی باززایی از بافتهای گیاهی از این طریق نسبت به سایر روشها بسیار بالاست (Fischer, 2003). بررسیهای مولکولی با تکنیک PCR بر روی گیاهان تراریخت، انتقال ژن IFNγ به گیاهان باززایی شده را تایید کرد. رونویسی از روی ژن IFNγ با تکنیک RT-PCR تایید شد. بیان ژن در سطح رونویسی تاییدی بر عملکرد پیشبر ناپین در گیاه توتون بود. وجود قطعه اضافی مشخص با وزن حدود Kda36 در مقایسه با گیاهان شاهد برروی ژل پلی اکریلآمید، تایید کننده بیان ژن IFNγ در مرحله ترجمه میباشد. قطعه مورد نظر دوبرابر وزن مولکولی پروتئین IFNγ (Kda 36=2* Kda18) میباشد که نشان دهنده ایجاد دایمر در پروتئین IFNγ میباشد. انتهای کربوکسیل یک مونومر IFNγ (Ala-123 to Met-134) بطور کوالانسی میتواند به انتهای آمینی یک منومر IFNγ دیگر متصل شود. بین منومرهای IFNγ وCu,Zn-superoxide dismutase در شرایط سلولی دایمر IFNγ تشکیل میشود. دایمرهای IFNγ از نظر اندازه، عملکرد وساختار، در شرایط مشابه سلول، رفتار مشابهی با منومر IFNγ دارند (Charles A. LunnS, 1992). امید است با تکمیل بررسیهای بعدی در زمینه استخراج و استحصال و افزایش بیان این پروتئین، امکان تولید انبوه و ارزان یک پروتئین نوترکیب با ارزش را فراهم کرد.
سپاسگزاری
با تشکر از راهنماییهای زندهیاد دکتر علی حقنظری که در مراحل مختلف انجام این پروژه با ما همکاری نمودند.
منابع
Abdel-Wahab Z, Weltz C, Hester D, Pickett N, Vervaert C, Barber JR, Jolly D, Seigler HF (1997). A Phase I clinical trial of immunotherapy with interferon-γ gene-modified autologous melanoma cells: monitoring the humoral immune response. Cancer 80: 401-12.
Alicia F, Inmaculada F, Andrea M, Angel, M, Mingo-Castel A, Jon V (2007). Expression of recombinant proteins lacking methionine as N-terminal amino acid in plastids: Human serum albumin as a case study. Journal of Biotechnology 127: 593-604.
Bagheri Kh, Jalali Javaran M, Mahboudi F, Moeini A, Zebarjadi A (2010). Expression of human interferon gamma in Brassica napus seeds. African Journal of Biotechnology 9: 5066-5072.
Barta A (1986). The expression of a noplaline synthase human growh hormone chimaeric gene in transformed tobacco and sunflower callus tissue. Plant Molecular Biology 6:347-357.
Bewley R, Black M )1994(. Seed: physiology of development and germination. Plenum Press, New York.
Boothe JG, Parmenter DL, Saponja JA (1997). Molecular farming in plants: Oilseeds as vehicles for the production of pharmaceutical proteins. Drug Development Research 42: 172-181.
Charles A, Liza D, David D, Satwant K, Paul J, Zavodny S, Daniel L (1992). An Active Covalently Linked Dimer of Human Interferon-gamma. The Journal of Biological Chemistry 267: 17920-17924.
Conrad U, Fiedler U (1998). Compartment-specific accumulation of recombinant immunoglobulins in plant cells: an essential tool for antibody production and immunomodulation of physiological functiond and pathogen activity. Plant Molecular Biology 38:101-109.
Crouch ML and Sussex IM (1981). Development and storage- protein synthesis in Brassica napus L. embryos in vivo and in vitro. Planta 153:64-74.
Daniell H (2003). Medical molecular farming: expression of antibodies, biophar maceuticals and edible vaccines via chloroplast genome. Plant Biotechnology l: 371-376.
Daniell H, Khan MS, Allison L (2002). Milestones in chloroplast genetic engineering: an environmentally friendly era in biotechnology. Trends in Plant Science 7: 84-91.
Daniell H, Lee S B, Panchal T, Wiebe PO (2001). Expression of cholerotoxin B subunit gene and assembly as functional oligomers in transgenic tobacco chloroplasts. Journal of Molecular Biology. 311:1001-1009.
Dellaporta SJ, Wood J, Hicks JB (1983). A plant DNA minipreparation:Version II. Plant Molecular Biology Reporter 1:19-21.
Droogenbroeck BV, Cao J, Stadlmann J, Altmann F, Colanesi S, Hillmer S, Robinson DG, Lerberge EV, Terryn N, Montagu MV, Liang M, Depicker A, Jaeger GD (2006). Aberrant localization and underglycosylation of highly accumulating single-chain Fv-Fc antibodies in transgenic Arabidopsis seeds. PNAS 104(4): 1430-1435.
Fischer R, Emans N, Schuster F, Hellwig S, Drossard J (1999). Towards molecular farming in future: Using plant-cell-suspension culture as bioreactors, Biotechnology and Applied Biochemistery 30:109-112.
Fischer R, Emans N, Twyman RM, Schillberg S (2003). Molecular farming of industrial proteins in plants, In: Fingerman M, Nagabhushanam R (Eds.), Recent advances in marine biotechnology. Volume 9: Biomaterials and bioprocessing. Science Publisher Inc., USA, pp. 279-313.
Frigerio L, Pastres A, Vitale A (2001). Influence of KDEL on the Fate of Trimeric or Assembly-Defective Phaseolin: Selective Use of an Alternative Route to Vacuoles. The Plant cell 13:1109-1126.
Ghislaine T, Helene C, Marie N, Aris M (2008). Translocation of aprotinin, a therapeutic protease inhibitor, into the thylakoid lumen of genetically engineered tobacco chloroplasts. Plant Biotechnology Journal 6: 309-320.
Hiatt AH, Cafferkay R, Bowdish K (1989). Production of antibody in transgenic plants. Nature 342:76-78.
Maliga P (2002). Engineering the plastid genome of higher plants. Current Opinion in Plant Biology 5: 164-172.
Kozak M (1987). An analysis of 5'-noncoding sequences from 699 vertebrate messenger RNAs. Nucleic Acids Research 15 (20): 8125–48.
Mason HS, Lam DM, Arntzen CJ (1992). Expression of hepatitis B surface antigen in transgenic plants. PNAS 89(24): 11745-11749.
Moeenrezakhanlou A, Maghsoudi N, Mahboudi F (2002). Homo sapiens interferon-gamma mRNA, complete cds, from http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgi?db=nuccore&id=20805895.
Nauciel C, Espinasse-Maes F (1992). Role of gamma interferon and tumor necrosis factor alpha in resistance to Salmonella typhimurium infection. Infection and Immunty 60: 450–454.
Pen J, Molendijk L, Quax WJ, Sijmons PC, Van Ooyen AJJ, Van Den Elzen PJM, Rietveld K, Hoekema A (1992). Production of active Bacillus licheniformis alpha-amylase in tobacco and its application in starch liquefaction. Biotechnology 10: 292−296.
Sambrook, J. and Russel, DW (2001). Molecular cloning, a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York. pp 12.1-12.114.
Schouten A, Roosien J, Engelen FA, Jong GAM, Borst-Vrenssen AWM, Zilverentant JF, Bosch D, Stiekema WJ, Gommers FJ, Schots A, Bakker J (1996). The C-terminal KDEL sequence increases the expression level of a single-chain antibody designed to be targeted to both the cytosol and the secretory pathway in transgenic tobacco. Plant Molecular Biology 30:781-793.
Twyman RM, Stoger E, Schillberg S, Christou P, Fischer R )2003.( Molecular farming in plants: host systems and expression technology. Trends in Biotechnology 12: 570-578.
Wetzel R, Perry LJ, Veilleux C (1991). Mutations in human interferon gamma affecting inclusion body formation identified by a general immunochemical screen, Biotechnology 9: 731–737.
Expression of recombinant gamma interferon in tobacco plant seeds
Asgharzadeh S.*1, Bagheri Kh.2, Jalali Javaran M.3, Mahboudi F.4
1M.Sc. Student of Agricultural Biotechnology, Department of Agronomy and Plant Breeding, Faculty of Agriculture, University of Zanjan.
2Assistant Professor of Agronomy and Plant Breeding Department, Faculty of Agriculture, University of Zanjan.
3Associate professor of Plant Breeding Department, Faculty of Agriculture Tarbiat Modares University.
4Associate professor of Biotechnology Department, Pasture Institute of Iran.
Abstract
Some important strategies to increase recombinant protein yield in plants include expression of protein in suitable tissue, improvement of protein stability and accumulation by targeting into subcellular organs using specific targeting signals. In this perspective, seed-based platforms are attractive because they allow recombinant proteins to stably accumulate at a relatively high concentration in a compact biomass, which is beneficial for extraction and downstream processing. On the other hand, the ER contain chaperons and isomerase for folding of nascent proteins, which can promote correct protein folding leading to recombinant protein stability and accumulation. In this research for human Gamma interferon expression in tobacco seeds and targeting into ER, we used seed specific promoter (Napin), Kozak sequence at 5' end and KDEL sequence in 3' end of the IFNγ gene. The fragment was cloned into pGEM®-T Easy vector and after confirmation by PCR, restriction enzyme analysis and sequencing, was subcloned into a plant binary vector (pBI121). This construct cassette was transferred to A.tumefaciens LBA4404 and then used to transform tobacco explants. The transformed plants were screened on antibiotic-contained media. The presence of the transgenes was confirmed in the transformants by PCR and expected 432bp (IFNγ) and 795bp (nptII) sequences were amplified. Digestion result indicated that the mentioned construct completely and correctly transferred into tobacco genome. Transcription of IFNγ gene was confirmed by RT-PCR. Analysis of transgenic plants by SDS-PAGE represented that IFNγ protein is being expressed in seeds. Our results indicate that plant seeds have potential for production of recombinant proteins as ‘natural bioreactors’.
Keywords: Napin promoter, IFNγ gene, KDEL sequence, KOZAK sequence, transgenic tobacco.
)