Study of genetic diversity in rapeseed (Brassica napus L.) genotypes using microsatellite markers

بررسی تنوع ژنتیکی در ژنوتیپ­های کلزا با استفاده از نشانگرهای ریزماهواره

زهرا برزن¹، مسعود دهداری*²، رضا امیری فهلیانی²

¹دانشجوی کارشناسی ارشد اصلاح نباتات، دانشکده کشاورزی، دانشگاه یاسوج

²دانشیار گروه زراعت و اصلاح نباتات، دانشکده کشاورزی، دانشگاه یاسوج

³استادیار گروه زراعت و اصلاح نباتات، دانشکده کشاورزی، دانشگاه یاسوج

تاریخ دریافت: 27/11/1392، تاریخ پذیرش: 23/06/1393

چکیده

گیاهان دانه روغنی نظیر کلزا نقش مهمی در تولید روغن و انرژی مورد نیاز انسان دارند. اطلاع از وجود تنوع ژنتیکی بر پایه نشانگرهای گوناگون بخصوص نشانگرهای مولکولی در برنامه‌های بهنژادی نقش کلیدی در طراحی برنامه‌های اصلاحی دارد. به منظور بررسی تنوع ژنتیکی در 24 ژنوتیپ کلزا، از 10 جفت آغازگر ریزماهواره‌ای با توجه به مطالعات قبلی استفاده گردید. نتایج حاصل نشان داد که متوسط محتوای اطلاعات چند شکلی برای آغازگرهای مورد ارزیابی 55/0 بود و میانگین عدم خلوص مشاهده شده و مورد انتظار برای تمامی آغازگرها به ترتیب 35/0 و 41/0 محاسبه شد. بیشترین میزان شاخص شانون که نشان دهنده تنوع بین جمعیتی است، مربوط به مکان‌ ژنی NA12-E09 به میزان 0893/1 بود، درحالی که مکان‌های ژنی RA2-A11 و OL10-G06 دارای کمترین میزان شاخص شانون بودند. تجزیه خوشه‌ای بر اساس داده‌های مولکولی با استفاده از ضریب تشابه جاکارد و روش UPGMA، ارقام کلزا را در 3 گروه اصلی قرار داد. بر این اساس، رقم  CR3133 با منشأ کانادا در یک گروه جداگانه قرار گرفته است که نشان می‌دهد این رقم تشابه کمتری با دیگر ارقام دارد. به طور کلی نتایج این پژوهش حاکی از تنوع وسیع بین ژنوتیپ‌های کلزا بر اساس نشانگرهای ریزماهواره مورد استفاده بود که نشان می­دهد می­توان از آنها در برنامه­های اصلاحی استفاده نمود.

واژه‌های کلیدی: کلزا، تنوع ژنتیکی، نشانگر ریزماهواره.

مقدمه

دانه‌های روغنی و از جمله کلزا پس از غلات دومین ذخیره غذایی جهان را تشکیل می‌دهند. این محصولات علاوه بر دارا بودن ذخائر غنی اسید چرب، حاوی پروتئین نیز می‌باشند (Latifi et al., 2004). کلزا (Brassica napus L.)، از تیره چلیپائیان می‌باشد که یک گونه آمفی دیپلوئید طبیعی حاصل از تلاقی گونه شلغم روغنی (B. rapa) با کلم وحشی (B. oleracea) و دو برابر شدن کروموزومهای هیبرید حاصل می­باشد Shamsodin Saeed and Farahbakhsh, 2008)). تجزیه و تحلیل مولکولی در سطح DNA روشی مناسب برای ارزیابی تنوع ژنتیکی و اطلاع از خاستگاه اولیه گیاه می­باشد ((Chowdhury and Slinkard, 2000. شناخت و آگاهی از الگوهای تنوع شرایط لازم برای درک بهتر روابط تکاملی میان ژنوتیپ­ها را فراهم می­کند (Bretting and Widrlechner, 1995). روش‌های متفاوتی برای بررسی تنوع در سطح DNA مانند چندشکلی ناشی از طول قطعات برش‌یافته (RFLP)، چند شکلی ناشی از طول قطعات تکثیر شده (AFLP)، رپید و ریزماهواره‌ها (SSR) وجود دارند. ریزماهواره‌ها شامل واحد های تکی، دوتایی، سه تایی، چهارتایی، پنج تایی و یا شش تایی تکرار شونده هستند که در ژنوم بیشتر یوکاریوت­ها پراکنده­اند. نشانگرهای SSR همبارز بوده و جایگاه ویژه‌ای بر روی کروموزوم‌ها دارند و می‌توانند چند شکلی، ناهمگنی و عدم خلوص را به خوبی آشکار کنند Teklu et al., 2007)). از نشانگرهای مولکولی در گونه‌های براسیکا به منظور: الف) استفاده در اصلاح از طریق دورگ­گیری، ب) شناسایی ژن‌های مقاومت به بیماری‌ها، ج) مطالعه ژنتیک صفات کنترل‌کننده کیفیت دانه و کنجاله و د) شناسایی QTL‌ های کنترل کننده صفات مورفولوژیک و مرتبط با عملکرد دانه استفاده شده است Snowdon and Friedt, 2004)).  محتوای اطلاعات چند شکلی (PIC) به عنوان یکی از ویژگی‌های مهم نشانگرهای مولکولی در نظر گرفته شده و می‌تواند برای ارزیابی قدرت تمایز نشانگرها بکار رود (Junjian et al., 2002). برای ارزیابی وضعیت تنوع زیستی، از شاخص شانون استفاده می­شود. شاخص شانون نشان‌دهنده میزان چند شکلی تمام آغازگرها در ارقام است (Sourour and Amara Hajer, 2009). مکان‌های ژنی که میزان شاخص تنوع شانون آن‌ها بالاتر باشد قادرند سطح تنوع بین ژنوتیپ‌ها را نشان دهند. در مطالعه­ای 54 آغازگر SSR در گیاه کلزا مورد استفاده قرار گرفت و 122 نوار قابل نمره‌دهی مشاهده شد. تعداد 77 نوار از این 122 نوار، چند شکلی نشان دادند. درصد چند شکلی 08/71 بود که بیانگر تنوع ژنتیکی بالا در میان ژنوتیپ­ها می­باشد (Moghaddam et al., 2009). مقدار محتوای اطلاعات چندشکلی تابعی از تعداد و فراوانی آلل هاست. دلیل بیشتر بودن این مقدار ممکن است به علت نرخ جهش کمتر در توالی‌های تکراری دی نوکلئوتیدی باشد (Vigoruroux et al., 2005). نتایج مشابهی نیز توسط برخی از محققان (Vaz Patto et al., 2004; Agrama, and Tuinstra 2003) گزارش شده است. در مطالعه­ای نشانگر Na12-E09 دارای بیشترین تعداد آلل و بالاترین PIC (91/0) بود(Moghaddam et al., 2009). به­علاوه آغازگر NA11-C12 کمترین تعداد نوار را تکثیر کرد. در حالی‌که آغازگر RA2-E11 دارای بیشترین تعداد نوار تکثیر­شده[1] بود. طبق همین گزارش آغازگر NA10E02 کمترین درصد چندشکلی را نشان داده (30درصد)، درحالی ‌که نشانگرهای NA12C08، NA14C12، OL12E03، OL12F11 و RA2E03 بیشترین درصد چندشکلی را داشتند (Moghaddam et al., 2009). این نتایج با یافته‌های Agrama and Tuinstra ((2003 مطابقت داشت که نشان داد نشانگرهای SSR بسیار چندشکل هستند. درصد چندشکلی در آغازگر RAPD در گیاه کلزا 14 درصد گزارش شده­است (Roman, et al., 2004). محققان دیگری میانگین تعداد آلل­ها را به ازای هر مکان ژنی 2 آلل گزارش کردند (Rudolph et al., 2000). این گزارشات اطلاعاتی بدست آورد که برای مطالعات و تحقیقات آینده در جهت اثبات شایستگی آغازگرها برای ارزیابی تنوع ژنتیکی و ارتباط بین گونه‌ای در مجموعه‌ی ژرم‌پلاسمی مفید واقع می‌شود. به طور کلی با توجه به این گزارش‌ها نتیجه‌گیری می‌شود که تنوع ژنتیکی هم در بین و هم در داخل گونه‌های براسیکا وجود دارد. همانگونه که مشاهده می­شود نتایج اینگونه مطالعات بستگی به نوع ژنوتیپ و نشانگرهای مورد استفاده دارد. در حال حاضر ژنوتیپ­های زیادی در سطح کشور و دنیا معرفی شده­اند که اطلاعی از میزان تنوع ژنتیکی بین آنها وجود ندارد به همین دلیل این مطالعه با بکارگیری ژنوتیپ‌های مورد کشت و کار در ایران، ژنوتیپ‌های در حال معرفی و برخی ژنوتیپ‌های ارسالی از IPK[2] طراحی گردید. در صورت وجود تنوع از این مواد گیاهی می­توان در برنامه­های آتی اصلاحی از آنها استفاده نمود.

مواد و روش‌ها

در این آزمایش ژنوتیپ‌های کلزا شامل: کبری، طلایه، اکاپی، CR3189، CR3133، CR679، CR3250، CR677، CR3248، CR3141، CR3189، CR3152، CR3195، CR3186، H1750، H4722، H4815، H6059، H6486، H9209، H6018، H609، Q6501، Oct06 و SWK5380 مورد ارزیابی قرار گرفتند (جدول 1). ابتدا بذور با هیپوکلریت سدیم 5/0 در‌صد به مدت 5 دقیقه ضد عفونی و تعداد ٧ الی ٨ عدد بذر از هر ژنوتیپ در گلدان‌های کوچک کشت شدند. به منظور استخراج DNA در مرحله شش تا هشت برگی نمونه برگی برداشت شد. نمونه‌های برگی پس از انجماد در ازت مایع به فریزر 20- درجه منتقل گردیدند و تا زمان استخراج DNA در این دما نگهداری شدند. استخراج DNA با استفاده از روش CTAB تغییر یافته انجام گرفت (Saghai-Maroof et al., 1984). کمیت و کیفیت نمونه‌های DNA با استفاده از روش اسپکتوفتومتری و الکتروفورز ژل آگارز 8/0 در صد تعیین شد (Asghari et al., 2006). نمونه‌های DNA پس از تعیین غلظت، به غلظت 50 نانوگرم در میکرولیتر رقیق شدند و DNAهای ژنومی با کیفیت مطلوب برای انجام واکنش‌هایPCR  مورد استفاده قرار گرفتند. تکثیر DNA ژنومی با واکنش زنجیره‌ای پلیمراز  و با دستگاه ترموسایکلر PCR-MJ Mini-BIO RAD, Germany)) انجام شد برای ارزیابی تنوع ژنتیکی از 10 جفت آغازگر ریز ماهواره با مشخصات موجود در جدول 2 استفاده شد. این آغازگرها طبق مطالعات قبلی انتخاب و توسط شرکت Oligo- Macrogen مشهد، سنتز شدند.

واکنش زنجیره‌ای پلیمراز با حجم نهایی 25 میکرولیتر با اجزای 50 نانوگرم DNA الگو، 5/1 میلی‌مول MgCl₂، 63/0 میلی‌مول dNTP، 6/0 میکرومول از هر آغازگرهای رفت[3] و برگشت[4] ، 3/0 میلی‌مول Taq DNA Polymerase (تهیه شده از شرکت سپاهان طب اصفهان) و بافر PCR x1 تهیه شده از شرکت سپاهان­طب اصفهان، انجام شد. برنامه تکثیر به صورت 94 درجه سانتی­گراد به مدت 5 دقیقه برای واسرشته سازی اولیه و به دنبال آن 35 چرخه شامل سه مرحله: 94 درجه به مدت سی ثانیه، 66-56 درجه سانتی‌گراد به مدت سی ثانیه، 72 درجه سانتی‌گراد به مدت 45 ثانیه و نهایتاً مرحله بسط نهایی در 72 درجه سانتی‌گراد به مدت 3 دقیقه انجام شد. محصول حاصل از واکنش زنجیره‌ای پلیمراز با استفاده از الکتروفورز ژل آگارز (5/1 درصد) Top vision آشکار سازی شد. رنگ آمیزی ژل‌ها با اتیدیوم بروماید (1μg/ml) صورت گرفت. مرحله آخر عکس‌برداری از ژل با اشعه  UV و توسط دستگاه ژل‌داک (Gel Logic QUANTUM ST4, Germany) صورت گرفت.

تجزیه آماری

به منظور تجزیه و تحلیل داده‌ها، عدم وجود و وجود نوار با اعداد صفر و یک و داده‌های گم شده (آلل‌های تهی^[5]) با عدد 9 مشخص شدند Askari et al., 2001)). تجزیه و تحلیل­ها با استفاده از نرم افزارNTSYS PC 2.02  و Popgene32 صورت پذیرفت (Francis et al., 1999). شاخص محتوای اطلاعات چند شکلی PIC  با استفاده از فرمول ΣPi  PIC= 1-محاسبه شد.(Botstein et al., 1980)  در این فرمول  Pi فراوانی آلل iم در یک مکان مشخص میباشد. جهت مقایسه دندروگرام‌های به‌ دست آمده از روش‌های مختلف از جمله ضریب همبستگی و ضریب کوفنتیک استفاده گردید. این ضرایب نشان دادند که دندروگرام و ماتریس تشابه تا چه حد مشابه بودند و هر کدام که دارای بیشترین مقدار ضریب کوفنتیکی بود جهت خوشه‌بندی ژنوتیپ‌ها استفاده شد.

 جدول 1- فهرست ژنوتیپ‌های کلزای مورد استفاده.

Table 1- Description of rapeseed genotypes. 

جدول 2- توالی های رفت و برگشت ده جفت آغازگر ریزماهواره مورد استفاده.

Table 2- Backward and forward sequences of the 10 studied SSR markers.

به منظورگروه­بندی ارقام براساس داده­های SSR، با استفاده از نرم‌افزارNTSYS V.PC 2/02  ابتدا ضریب تشابه دایس، جاکارد و تطابق ساده برای ارقام­ مورد مطالعه محاسبه گردید، بعد از آن با مقایسه ضریب تشابه هر سه ماتریس با ضریب کوفنتیک مربوطه، ضریب تشابه جاکارد (ضریب 75/0) و روش UPGMA[6] به عنوان مناسب­ترین روش برای ترسیم دندروگرام انتخاب گردید.

نتایج و بحث

با بررسی تعداد نوارهای چند شکل، 10 جفت آغازگر SSR مطلوب شناسایی و برای کلیه نمونه ها مورد استفاده قرار گرفتند. الگوهای نواری آغازگر RA2-E07 در برخی از ژنوتیپ‌های مورد مطالعه در شکل 1 نشان داده شده است. آغازگرهای مورد استفاده در مجموع 21 نوار تولید کردند که 80 درصد نوارها چندشکلی نشان دادند. این نتایج تا حدودی مشابه نتایج Kimura et al(2000) بود، به­طوریکه این مجققان از بین 21 آغازگر اختصاصی، 18 باند چندشکل مشاهده کردند. در جدول 3 انواع شاخص­ها و اطلاعات بدست آمده از تجزیه مشاهدات مربوط به نشانگرها آورده شده­اند. تعداد آلل‌ها در هر جایگاه ژنی از 1 تا 4 آلل با میانگین2/2 آلل متغیر بود. حداقل تعداد آلل مشاهده شده مربوط به مکان­های ژنی OL10-G06 و RA2-A11 (یک آلل) و حداکثر تعداد آلل مشاهده شده مربوط به مکان ژنی Na10-B08 (4 آلل) بود. تعداد آلل های موثر در مکانهای ژنی در محدوده  1 تا 94/2  با میانگین 9/1 بود. تعداد آلل موثر در نشانگر NA12-E09 بیشتر از سایر نشانگرها بود که احتمالاً نشان دهنده وجود تنوع بیشتر در این نشانگر است. از 10 مکان ژنی تکثیر شده بیشترین میزان عدم خلوص مشاهده شده مربوط به مکان ژنی RA2-E11 و معادل 82/0 و کمترین  میزان عدم خلوص مشاهده شده مربوط به مکان‌های ژنی  RA2-A11، Na14-C12، OL10-G06 و RA2-G08 (معادل صفر) بود. میانگین عدم خلوص مشاهده شده در تمام مکانهای ژنی برابر 35/0 بود. در مطالعه دیگری نیز نشانگر NA12-E09 بیشترین تعداد آلل را در ژنوتیپ­های مورد مطالعه نشان داده است (Moghaddam et al., 2009). 

جدول 3- شاخص‌های تنوع ژنتیکی به‌دست آمده در ژنوتیپ‌های کلزا با استفاده از 10 مکان ژنی SSR.

Table 3- Genetic diversity indices of SSR markers analysis in rapeseed genotypes.

شکل 1- الگوی نواری 10 رقم کلزا با آغازگر RA2-E07 (آگارز 5/1 درصد از نوع Top Vision پس از نیم ساعت برقراری جریان).

Figure 1- The roll  pattern of 10 Rapeseed primer RA2-E07 (agarose 1/5 percent of Top Vision after half-time flow)  the first left column is related to marker and other columns are related to genotypes.

بیشترین میزان محتوای اطلاعات چند شکلی (PIC) مربوط به مکان‌های NA14-C12، Na12-E09، Na10-B08 و NA12-C08 و کمترین میزان PIC مربوط به مکان­های ژنی RA2-A11 و OL10-G06 بود. این نتایج با یافته‌های Liu and Muse (2005)، مطابقت داشت. محتوای اطلاعات چند شکلی به عنوان یکی از ویژگی‌های مهم نشانگرهای مولکولی در نظر گرفته شده و می‌تواند برای ارزیابی تمایز نشانگرها از هم بکار رود (et al., 2005 Vigoruroux). مقدار PIC در نشانگرهای NA12-E09 و RA2-G05، 19/0 بود که کمترین میزان را در بین سایر نشانگرهای مورد مطالعه دارا بود. این در حالی است که در مطالعه دیگر NA12-E09 بیشترین مقدار PIC را نشان داده است (Moghaddam et al., 2009). دلیل کمتر بودن این مقدار در این دو نشانگر، ممکن است به علت نرخ جهش بالاتر در توالی‌های تکراری دی نوکلئوتیدی باشد (et al., 2005 Vigoruroux). نتایج مشابهی نیز توسط برخی از محققان (Vaz Patto et a., 2005) گزارش شده است. بیشترین میزان شاخص شانون مربوط به مکان ژنی NA12-E09 و کمترین میزان مربوط به مکان‌های RA2-A11 و OL10-G06 بود.

بر اساس دندروگرام حاصل از داده­های آغازگر SSR و آزمون ccc و T² کاذب هوتلینگ، 24 ژنوتیپ کلزا در 3 گروه متفاوت قرار گرفتند (شکل 2). نتایج حاصل نشان داد که ژنوتیپ­های CR3189، W601، K9209، اکاپی، SWK538 و H609 در یک خوشه قرار گرفتند که در این میان 5 ژنوتیپ W601، K9209، اکاپی، SWK538 و H609 در ایران مورد کشت و کار قرار می‌گیرند و با توجه به نزدیکی و تشابه اقلیمی ژنوتیپ­ها تشابه ژنومی این ژنوتیپ­ها قابل توجیه و قابل انتظار بود.

شکل2- گروه­بندی ارقام کلزای مورد مطالعه بر اساس مشاهدات مولکولی نشانگرSSR  به روش UPGMA.

Figure 2- Classification of rapeseed genotypes based on SSR markers using UPGMA method.

در گروه دوم ژنوتیپ­های CR3198، CR679، CR3248، TALAYE، TASILO، CR3152، CR3141، CR3159، H4722، CR3186، H1750J، CR3250، H6486، Q6501، H6059، CR677 و H4815 قرار گرفتند که 9 ژنوتیپ ارسالی از IPK و 8 ژنوتیپ از ایران جمع­آوری شده بودند. به نظر می­رسد این ژنوتیپ­ها که از نظر ژنتیکی بیشترین شباهت را به هم دارند، در اصل بومی یک منطقه بودند و در گروه سوم ژنوتیپ CR3133  از IPK به تنهایی قرار گرفته است. نکته قابل توجه قرار گرفتن ژنوتیپ­های IPK در سه خوشه مجزا است که این نشان می­دهد که تنوع بین ژنوتیپ­های ارسالی از IPK بیشتر از ژنوتیپ­های جمع­آوری شده از ایران می باشد. دلیل آن می‌تواند منشأ متفاوت این ژنوتیپ‌ها باشد (جدول 1). نکته دیگر اینکه ژنوتیپ CR3133 از آلمان در یک گروه جداگانه قرار گرفته است که نشان دهنده­ی تفاوت زیاد با دیگر ژنوتیپ­ها است. در خوشه دوم ژنوتیپ CR3189 از IPK در کنار 5 ژنوتیپ از ایران قرار گرفتند که حاکی از تشابه بالای این ژنوتیپ با ژنوتیپ‌هایی که در ایران کشت و کار می‌شوند، است.

در مطالعه­ای تجزیه و تحلیل خوشه ای به کمک آغازگر RAPD ژنوتیپ­های کلزا را در چهار گروه اصلی جای داد، بر اساس این تجزیه و تحلیل، ارقام زمستانه از ارقام بهاره جدا شدند و هرکدام در گروه­های جداگانه قرار گرفتند (Moghaddam et al., 2009). طبق گزارش دیگر ارقام CR3248، CR3152، CR3152 و CR3141 در یک گروه قرار گرفتند (Ren et al. 1995). در پژوهشی Asghari et al. (2011) در بررسی تنوع ژنتیکی 18 رقم کلزای بهاره وزمستانه از طریق ویژگی­های مورفولوژیکی ژنوتیپ­ها را به سه گروه و از طریق نشانگر رپید وبه کمک روش UPGMA به هفت گروه دسته­بندی نمودند. آنها تنوع زیادی را بر اساس این ویژگی­ها در داخل و بین ژنوتیپ­ها مشاهده کردند. در پژوهش دیگر بر روی 90 لاین کلزا از طریق نشانگرهای SSR تنوع وسیعی گزارش شد و بین گروهبندی حاصل از نشانگر SSR و گروهبندی حاصل از ویژگی­های بذر ارتباط مناسبی مشاهده شد (Cunmin et al. 2012). محققین دیگری از نشانگرهای SSR و به روش UPGMA گونه های مختلف جنس براسیکا را گروهبندی و تنوع بین و داخل گونه­ها را ارزیابی نموده­اند بعنوان مثال در یک مطالعه سه گونه B. rapa Chines، B.rapa ParaChinesis و B. oleracea تنوع وسیعی در داخل و بین گونه­ها نشان داده­اند(Stephanie et al. 2009). و یا در گزارش دیگر ژنوتیپ­های سه گونه B. rapa، B. juncea و B. nupus به دو گروه اصلی و نه زیرگروه تفکیک شدند به نحوی که تنوع ژنتیکی وتنوع جغرافیایی از هم تبعیت نمودند (Alituri et al., 2012). تمامی این گزارش­ها حاکی از کارایی بالای نشانگرهای SSR در بررسی تنوع ژنتیکی جنس براسیکا می باشند.

با توجه به تنوع وسیع مشاهده شده و بر اساس نتایج گروه‌بندی ژنوتیپ‌ها می‌توان ژنوتیپ‌های از گروه‌هایی که با همدیگر فاصله ژنتیکی زیادتری دارند را انتخاب و در دورگه‌گیری از آن‌ها جهت اهداف اصلاحی خاص استفاده نمود. مسلماً با این کار در نتاج هتروزیس و تفکیک زیادتری مشاهده خواهد شد که موجب تسریع در روند اصلاحی می‌شود. لازم به ذکر است در صورتی که انتخاب این ژنوتیپ­ها بر اساس ویژگی­های مورفولوژیکی و در راستای اهداف اصلاحی نیز صورت بگیرد به کارآ تر و موفقیت بیشتر برنامه اصلاحی کمک خواهد نمود.

سپاسگزاری

نگارندگان مقاله مراتب سپاسگزاری خود را از مرکز تحقیقات IPK در آلمان و ایستگاه تحقیقات دیم کشاورزی گچساران بدلیل در اختیار گذاشتن مواد گیاهی بعمل می­آورند.