Genetic diversity and pathogenesity of Fusarium solani isolates of chickpea using RAPD and AFLP markers in Razavi and Northern Khorasan provinces

تعیین تنوع ژنتیکی و بیماریزایی جدایه‌های Fusarium solani نخود ایرانی با استفاده‌از نشانگرهای RAPD و AFLP در استانهای خراسان رضوی و شمالی

فاطمه حسن زاده داورانی*^1،2

¹استادیار، دانشگاه آزاد اسلامی واحد رفسنجان، گروه بیماری شناسی گیاهی، رفسنجان، ایران

²عضو باشگاه پژوهشگران جوان و نخبگان دانشگاه آزاد اسلامی واحد رفسنجان، رفسنجان، ایران

تاریخ دریافت: 22/07/1392، تاریخ پذیرش: 01/04/1393

چکیده

بیماری پوسیدگی سیاه ریشه نخود با عامل f. sp pisi Fusarium solani یکی از مهمترین بیماری‌های قارچی نخود در ایران از جمله ‌استان خراسان رضوی و شمالی به شمار می‌رود. با توجه خلاء علمی در خصوص تنوع ژنتیکی جمعیت‌های این قارچ، از نشانگرهای RAPD و AFLP با هدف تعیین تنوع ژنتیکی و بیماریزایی جدایه‌های استفاده گردید. لذا از 50 مزرعه در مناطق عمده نخود کاری استان‌های خراسان رضوی و شمالی نمونه برداری صورت گرفت. پس از جداسازی، خالص سازی و اثبات بیماریزایی 28 جدایه بیماری‌زا F. solani به دست آمد. بررسی دامنه میزبانی جدایه‌های بیماری‌زای حاکی از عدم بیماری‌زایی روی گیاهانی همچون عدس، لوبیا، ماش، سویا، نخودفرنگی، گوجه فرنگی، خربزه و هندوانه بود و تنها در دو گونه گیاهی نخود و نخود فرنگی علائم پوسیدگی ریشه را مشاهده گردید. نتایج تنوع ژنتیکی با استفاده ‌از 12 نشانگر RAPD نشان داد که ‌هفت آغازگر چند شکلی را به خوبی نشان می‌دهند. بر این اساس 28 جدایه F. solani بدون توجه به منطقه جغرافیایی در گروههای ژنوتیپی مختلفی قرار گرفتند. کاربرد AFLP با استفاده‌از چهار ترکیب آغازگری EcoRI/MseI، تعداد 330 باند قابل امتیازدهی ایجاد کرد، که 110 باند (حدود 34% باندها) چند شکلی نشان دادند. فاصله ژنتیکی بین جفت جدایه ها بین 06/0 تا 78/0 متغیر بود. دندروگرام ترسیم شده با استفاده ‌از روش UPGMA، چهار گروه ژنوتیپی در 20 جدایه F. solani f. sp pisi مشخص و تجزیه چند بعدی نیز آن را تایید نمود. تکنیک AFLP به خوبی توانست جدایه‌ها با توان بیماریزایی مشابه را تفکیک کند.

کلمات کلیدی:  F. solani f. sp. pisi، تنوع ژنتیکی، RAPD، AFLP.

مقدمه

پوسیدگی سیاه ریشه نخود اولین بار از آمریکا و هند در سال 1969 گزارش و عامل آن Fusarium solani معرفی شد (Kraft, 1969; Sharma et al., 1983). قارچ F. solani  خاکزاد بوده و از پراکنش وسیعی برخوردار بوده و حداقل سه جنس و 87 گونه گیاهی را آلوده می‌کند (Bogale et al., 2009). جدایه‌های F. solani  از نظر بیماری‌زایی متفاوت بوده و بر اساس دامنه میزبانی و آزمون بیماری‌زایی به فرم‌های تخصص یافته‌ای تقسیم می‌شوند. تا کنون 11 فرم تخصص یافته در این گونه شناسایی شده ‌است (Suga et al., 2002). در پژوهش Westerlund et al. (1974) جدایه‌های F. solani به دست آمده­‌از نخود ایرانی بر روی نخودفرنگی نیز بیماری‌زا بودند و نشان داده شد که پوسیدگی سیاه ریشه در نخود در حقیقت همان فرم اختصاصی F. solani f. sp pisi است که در نخودفرنگی نیز پوسیدگی ریشه را ایجاد می‌کند. در پژوهشی Mohammadi and Banihashemi (2005) 53 جدایه F. solani از مناطق مختلف استان فارس جداسازی و فرم اختصاصی آنها را F. solani f. sp pisi گزارش نمودند. بررسی تنوع ژنتیکی در قارچ فوزاریوم از طریق مطالعه‌های معمول مورفولوژیکی و گروه‌های سازگار رویشی دارای محدودیت‌هایی می‌باشد و از حساسیت کافی برای تمایز جدایه‌ها برخوردار نیستند. تاکنون روش‌های مولکولی و بیوشیمیایی جهت تخمین تنوع ژنتیکی درون و بین گونه‌ای فوزاریوم با موفقیت به کار رفته ‌‌است (O Donnel 2000, Godoy et al., 2004, Zahng et al., 2006) و این روش‌ها نشان دادند که F. Solani یک گونه مرکب شامل بیش از 26 گونه مشخص فیلوژنتیکی است. کاربرد روش RAPD که در آن از یک آغازگر چند نوکلئوتیدی کوتاه تصادفی برای تکثیر توالی های DNA استفاده می‌شود، به علت عدم نیاز به‌اطلاعات توالی DNA ژنوم بیمارگر، سرعت و سهولت کاربرد آن توسعه زیادی یافته‌‌است. به ویژه ‌استفاده ‌از RAPD برای تعیین تفاوت و تنوع درون گونه‌ای در میکروارگانیسم‌ها موفقیت‌آمیز بوده‌است. کاربرد نشانگر‌های مبتنی بر AFLP در تعیین تنوع بین و درون گونه‌ای در قارچ‌ها مخصوصا" گونه‌های فوزاریوم کمک زیادی نمود به عنوان مثال مطالعه فیلوژنی گونه‌های جنس فوزاریوم (Abd- Elsalam et al., 2003)، تعیین تنوع جدایه‌های F. oxysporum f. sp. lentis (Abdel- Satar et al., 2003)، گوناگونی جدایه‌های F. solani در اتیوپی (Bogale et al., 2009) و طراحی آغازگرهای اختصاصی مشتق از نشانگر AFLP در ردیابی F. solani عامل پوسیدگی قهوه‌ای ریشه بادام زمینی (Casasnovas et al., 2013).

در پژوهشی Moradzade Eskandari et al (2009) با استفاده‌از نشانگر مولکولی [1]FAFLP ساختار ژنتیکی 149 جدایه ‌ایرانی F. solani از چهار جمعیت میزبانی (سیب زمینی، کدوئیان، لوبیا و نخود) را بررسی و گزارش نمودند میانگین تنوع ژنتیکی برای همه جدایه‌های مورد بررسی و تمامی جایگاه‌های ژنی مورد مطالعه بر اساس ضریب Nei برابر 3883/0 بود و تنوع ژنتیکی مشاهده شده با میزبان و مناطق جغرافیایی جدایه‌ها ارتباطی نداشت و چهار جمعیت میزبانی یک دودمان کلونی هستند و احتمال جریان ژنی بین جمعیت‌ها وجود دارد. پر واضح است که برنامه ریزی علمی جهت کنترل این فرم تخصص یافته و خسارت حاصل از آن در عرصه کشاورزی بدون حصول اطلاعات دقیق بیماری‌زایی و ژنتیکی امکان پذیر نخواهد بود.

سطح زیر کشت نخود در ایران حدود 550 هزار هکتار و در استان خراسان در سال 84-83 معادل 33800 هکتار بوده‌است که 2800 هکتار از آن به کشت آبی و 31000 هکتار به کشت دیم اختصاص داده شده‌است. از این رو در بین حبوبات تولیدی در ایران مقام اول را به خود اختصاص داده‌است. با توجه به‌اهمیت تولید گیاه نخود در استان خراسان و میزان خسارت بیماری مهم پوسیدگی سیاه ریشه، این پژوهش با هدف تعیین تنوع ژنتیکی، دامنه میزبانی و بیماریزایی جدایه‌های F. solani نخود ایرانی با استفاده ‌از نشانگرهای RAPD و AFLP در استانهای خراسان رضوی و شمالی انجام شد.

مواد و روشها

جمع آوری نمونه‌ها

نمونه‌برداری از 50 مزرعه نخود از مناطق مختلف استان‌های خراسان رضوی و شمالی شامل شهرهای مشهد، قوچان، چناران، کاشمر، فاروج، تربت حیدریه، بجنورد، فریمان، شیروان و خواف صورت گرفت. از هر مزرعه 10-8 بوته که دارای علائم زردی، پژمردگی و پوسیدگی ریشه بودند با بیلچه و به طور کامل از خاک خارج (طوری که ریشه‌ها آسیب نبینند) و در کیسه‌های پلاستیکی قرار داده شد و به آزمایشگاه منتقل گردید.

جداسازی قارچ Fusarium solani

برای جداسازی، اندام گیاهی و به خصوص ریشه‌ها با آب معمولی شسته و از قسمت‌های مختلف ریشه، طوقه ساقه قطعات 5-3 میلی متری تهیه و در هیپوکلریت سدیم5/0% به مدت 2-5/1 دقیقه برای ضدعفونی دقیقه قرار داده. پس از سه مرتبه شستشو با آب مقطر استریل، قطعات با استفاده از کاغذی خشک و در تشتک‌های پتری حاوی محیط کشت PDA اسیدی قرار داده شدند. تشتک‌های پتری در دمای C°25 و تاریکی به مدت 5 تا 7 روز قرار گرفتند. کلنی‌های رشد کرده خالص سازی و پس از تهیه کشت‌های تک اسپوری در لوله‌های حاوی محیط کشت PDA برای آزمایشات بعدی نگهداری شدند.

تشخیص F. solani

تشخیص جدایه‌‎های بدست آمده بر اساس خصوصیات موفولوژیکی اندام‌های تولید مثل رویشی همچون اسپوردوکیوم‌ها، ماکروکنیدیوم‌ها، شکل و رنگ پرگنه، چگونگی تولید میسلیوم و میکروکنیدیوم‌ها صورت گرفت Nelson et al. 1994) 1994; Burgess et al.).

سنجش بیماری‌زایی جدایه‌های Fusarium solani

پرورش مایه تلقیح جدایه‌ها

برای اثبات بیماری‌زایی و تعیین فرم اختصاصی جدایه‌ها، پرورش مایه تلقیح  بر روی دانه گندم صورت گرفت. بذور گندم به مدت یک شب در فلاسک‌های حاوی آب معمولی خیسانده شدند و پس از شستشو سه دفعه (به صورت یک روز در میان) و هر دفعه به مدت 30 دقیقه در اتوکلاو (دمای 121 و فشار 1 اتمسفر) سترون شدند. به هر فلاسک 5-4 بلوک میسیلیومی ار هر جدایه اضافه و در دمای 25 درجه سانتی‌گراد به مدت 20-14 روز در تاریکی نگهداری شد.

کاشت بذور نخود

بذور نخود به مدت 15-12 دقیقه با هیپوکلریت سدیم 5 /0% گند زدایی و سه دفعه و هر دفعه به مدت 5 دقیقه با آب مقطر شسته شدند، سپس به مدت یک شب در ظروف یکبار مصرف حاوی آب مقطر قرار گرفتند. پس از این مدت آب ظرفها خارج و پارچه مرطوبی روی بذور کشیده و ظروف جهت جوانه‌زنی بذر در دمای c°25  قرار داده شدند. بعد از 3- 2 روز بذور جوانه‌زده به طور مستقیم در گلدان‌ها کشت گردیده و در گلخانه نگهداری شدند.

بررسی بیماریزایی جدایه‌ها بر روی نخود و تعیین فرم اختصاصی

برای مایه‌زنی گیاهان نخود با جدایه‌های F. solani، ابتدا در هر گلدان 4 عدد بذر نخود گندزدایی شده با هیپوکلریت سدیم کشت گردید. پس از رشد گیاهچه‌های نخود خاک اطراف هر بوته کنار زده شد و دور طوقه ‌هر بوته پنج عدد بذر گندم کلنیزه شده با قارچ ریخته شد (Westerlund et al. 1974). گلدان‌ها در گلخانه در دمای 25-20 نگهداری و هر روز جهت مشاهده علائم پژمردگی از گلخانه بازدید به عمل آمد. هر جدایه قارچی  سه تکرار و هر تکرار شامل 4 گیاه بود. جهت تعیین فرم اختصاصی جدایه‌ها، گیاهان لوبیا، عدس، ماش، سویا، گوجه فرنگی، خربزه، نخود فرنگی و هندوانه مشابه روش فوق ماِیه‌زنی شدند.

ارزیابی بیماریزایی جدایه‌ها

برای ارزیابی شدت بیماریزایی جدایه‌ها از شاخص 9 درجه‌ای پیشنهاد شده برای فوزاریوم‌های مولد پژمردگی و پوسیدگی ریشه در نخود استفاده شد (Bhatii and Kraft, 1992).

 نمره 1؛ گیاه به طور کامل سالم بوده و هیچ علائمی ندارد، نمره 3؛ مشاهده علائم پژمردگی در تعداد کمی از برگها، یا کمتر از ده درصد سیستم ریشه بافت مرده شده‌است، نمره 5؛ حدود 20 درصد شاخ و برگها دچار پژمردگی شده یا 25 درصد هیپوکوتیل توسط لکه‌های بافت مرده پوشیده شده‌است، نمره 7؛ حدود 50 درصد شاخ و برگها دچار پژمردگی شده و گیاهان نسبت به گیاهان سالم از رشد کمتری برخوردارند یا حدود 50 درصد سیستم ریشه و هیپوکوتیل توسط لکه‌های بافت مرده پوشیده شده و تعداد ریشه‌ها کاهش می یابد، نمره 9؛ گیاهان دچار پژمردگی و کاهش رشد شدید شده و در نهایت می میرند یا سیستم ریشه و هیپو کوتیل به شدت پوسیده و در نهایت گیاه خشک می شود. اعداد 2، 4، 6 و 8 برای مواردی است که علائم مشاهده شده حد واسط اعداد گفته شده‌است.

بررسی تنوع ژنتیکی جدایه‌های Fusarium solani

استخراج DNA

برای استخراج DNA، جدایه‌های قارچی به مدت48 تا 72 ساعت در محیط کشت PDB بر روی شیکر قرار داده شدند. پس از بدست آوردن میسیلیوم جدایه‌ها،‌ ‌از روش CTAB برای خالص سازی DNA استفاده گردید (Weising et al. 1995). کمیت و کیفیت DNA خالص شده به ترتیب با استفاده از ‌الکتروفورز روی ژل آگارز 1 درصد و اسپکتوفتومتر تعیین شد.

تنوع ژنتیکی جدایه‌ها با استفاده از نشانگر RAPD-PCR

در این پژوهش از 12 آغازگر 10 نوکلئوتیدی کاملا تصادفی (شرکت سیناژن) استفاده شد (جدول 1). واکنش‌ها در حجم 25 میکرولیتری شامل MgCl2 50Mm (2)، PCR-Buffer 10x (5/2)، d NTP Mix 10Mm (5/0)، Primer 10pmol (5/1)،lµDNA 25ng/ (3)، Taq DNA Polymeraz (25/0)، dd H2O (25/15) بود. شاهد منفی در واکنش‌ها، شامل تمام مواد فوق به ‌استثنای DNA الگو بود. چرخه‌های دمایی به کار رفته در PCR شامل یک چرخه واسرشت‌سازی در دمای 94 به مدت 3 دقیقه و چهل چرخه شامل مراحل واسرشت سازی در دمای 94 به مدت 30 ثانیه، اتصال در دمای 35 به مدت 1 دقیقه و بسط در دمای 72 به مدت 3 دقیقه و در خاتمه یک چرخه بسط نهایی در دمای 72 به مدت 10 دقیقه بود (Williams et al. 1990). پس از اتمام عمل 7 میکرولیتر از تولیدات  روی ژل آگارز 5/1 درصد و تحت ولتاژ 75 و جریان 500 میلی آمپر به مدت 5/2 ساعت الکتروفورز شدند. ژل الکتروفورز پس از نیم ساعت رنگ آمیزی با اتیدیوم بروماید و 45 دقیقه رنگ بری غیر اختصاصی در آب مقطر توسط دستگاه  مشاهده و عکس‌برداری شد.

جدول 1- توالی آغازگرهای RAPD مورد استفاده جهت تفکیک جدایه‌های F. solani

Table 1- Primers sequence used in RAPD.

تنوع ژنتیکی جدایه‌ها با استفاده از نشانگر AFLP

برای برش آنزیمی هر نمونه 40 میکرولیتری حاوی 500 نانوگرم DNA ژنومی، 4 میکرولیتر بافر OPA، 5 واحد از هر کدام از آنزیم‌های برشی EcoRI و Tru9I (جدول 2) و 40/30 میکرولیتر آب دوبار تقطیر سترون شده بود. واکنش برش در دمای 37 درجه سانتی گراد به مدت 12 ساعت انجام گرفت (Vos et al. 1995). برای اطمینان از برش موفق، از الکتروفورز در ژل آگارز 2/1 درصد با شرایط ولتاژ ثابت 80 به مدت 5/1 ساعت استفاده شد. عدم وجود باند در ناحیه DNA ژنومی نشان از انجام صحیح برش بود.

اتصال قطعات برشی به رابط‌ها

به منظور دو رشته‌ای کردن رابط ها 5 میکرولیتر از هر کدام از رشته­های رفت و برگشت رابط EcoRI و 5 میکرولیتر از هر کدام از رشته‌های رفت و برگشت رابط Tru9I در چرخه دمایی 65 (10 دقیقه)، 37 (10 دقیقه) و 25 درجه سلسیوس (10دقیقه) قرار گرفتند. برای انجام واکنش‌های اتصال، هر نمونه 45 میکرولیتری حاوی 40 میکرولیتر قطعات DNA برش خورده، پنج میکرولیتر رابط دو رشته‌ای مربوط به EcoRI،50 میکرولیتر رابط دو رشته‌ای مربوط به Tru9I، یک میکرولیتر بافر، 2 میلی مولار ATP، یک واحد از دو آنزیم برشی و یک واحد T4 DNA Ligase در دمای 37 درجه سلسیوس به مدت سه ساعت قرار گرفت (Vos et al., 1995).

جدول 2- آنزیم‌های برشی، آداپتورها و آغازگرهای تکثیر انتخابی در تکنیک AFLP.

Table 2- Restriction enzymes, adaptors and primers for selective amplification in AFLP technique.

تکثیر پیش انتخابی

هیچ تکثیر انتخابی در این مرحله برای آغازگرها در نظر گرفته نشد. اجزای یک محلول 25 میکرولیتری عبارت بودند از 4 میکرولیتر DNA پنج برابر رقیق شده حاصل از مرحله‌اتصال، 50 نانوگرم از هر کدام از آغازگرهای پیش انتخابی، 5/2 میکرولیتر بافر PCR غلظت 1X،2 میلی مولار MgCl2، 2/0 میلی مولار مخلوط نوکلئوتیدی، یک واحد تک پلی مراز و 8/14 میکرولیتر آب سترون. واکنش در دستگاه ترمال سایکلر انجام شد.

تکثیر انتخابی

آغازگرهای انتخابی نیز از شرکت SIB Enzyme (کشور روسیه) خریداری شدند و دارای دو نوکلئوتید انتخابی بودند (جدول 2). مخلوط 20 میکرولیتری واکنش متشکل از 3 میکرولیتر DNA سه بار رقیق شده حاصل از تکثیر پیش انتخابی، 50 نانوگرم از هر کدام از آغازگرهای انتخابی، یک میکرولیتر بافر PCR غلظت 1X، 5/2 میلی مولار MgCl2، 1/0 میلی مولار مخلوط نوکلئوتیدی، یک واحد تک پلی مراز و 3/11 میکرولیتر آب سترون بود.

الکتروفورز عمودی و رنگ آمیزی ژل‌ها

محصولات تکثیری روی ژل پلی اکریلامید 6% واسرشت کننده در دستگاه‌الکتروفورز عمودی مدل پایا پژوهش تزریق شد. یک محلول 110 میلی‌لیتری ژل با استفاده‌از 50 گرم اوره، 11 میلی­لیتر TBE پنج برابر، 25/19 میلی لیتر محلول اکریلامید 40% و تا حجم 110 میلی لیتر آب سترون تهیه شده و 750 میکرولیتر آمونیوم پر سولفات 10 درصد همراه با 150 میکرولیتر تمد به آن اضافه شد. پس از واسرشت سازی نمونه‌ها و انجام الکتروفورز مقدماتی الکتروفورز فراورده‌ها در ولتاژ ثابت 1000 و به مدت 3 ساعت در دمال 50 درجه سانتی گراد انجام شد.به منظور مشاهده باندها از روش رنگ آمیزی نیترات نقره ‌استفاده گردید.

تجزیه و تحلیل باندها

برای تجزیه و تحلیل داده­های ملکولی، علامت 1 برای حضور باند و علامت 0 برای عدم حضور باند در نظر گرفته شد. داده‌های حاصل در نرم افزار Pop Gene 32 برای نشانگرهای غالب وارد شد و رسم دندروگرام با نرم افزار NTYSIS صورت گرفت.

نتایج و بحث

پرگنه‌ی جدایه‌های F. solani از نظر رنگ و مورفولوژی بسیار متنوع بود (شکل 1). بعضی جدایه‌ها دارای رنگریزه و رشد آنها به صورت دوایر متحدالمرکز منظم و یا یا نامنظم بود.

ماکروکنیدیوم‌ها معمولاً دارای چهار تا پنج دیواره عرضی و کمی حالت خمیدگی داشتند. سلول انتهایی آنها گرد و درشت و سلول پایه کمی فرورفته بود. طول ماکروکنیدیوم‌ها 48- 38 میکرون و عرض آنها 5- 7/3 میکرون اندازه‌گیری شد (شکل 1). ماکروکنیدیوم‌ها بر روی فیالیدهای حاصل از اسپورودکیوم در محیط CLA تشکیل و به رنگ کرم  و تا سبز مایل به آبی بودند. میکروکنیدیوم‌ها به تعداد زیاد و عموماً تک سلولی و گاهی دو سلولی، بیضی شکل ، تخم مرغی و قلوه‌ای شکل مشاهده شد. میکروکنیدیوم‌ها به صورت مجتمع بر روی منوفیالیدهای خیلی بلند، ساده و یا در سرهای دروغین تشکیل شدند. از 78 جدایه به دست آمده 28 جدایه به F. solani تعلق داشت. علائم بیماری در آزمون‌های بیماری‌زایی شامل زردی و پژمردگی اندام‌های هوایی و پوسیدگی ریشه بود (شکل 2).

شکل 1- تنوع رشدی (A)، ماکرو‌کنیدی (B) و  میکروکنیدی تولید شده بر روی فیالید‌های بلند (C) و اسپوردوکیوم ( D) در جدایه‌های f. sp. pisi Fusarium solani.

Figure 1- Growth diversity (A), macroconidia (B), microconidia produced on long phialides (C) and spordochium (D) in  of Fusarium solani f. sp. pisi isolates.

در دامنه میزبانی علائم فقط روی نخود و نخود فرنگی مشاهده شد و فرم اختصاصی قارچ به عنوان F. solni f. sp. pisi شناسایی شد. در تکنیک RAPD از میان 12 آغازگر تست شده روی 28 جدایه با منشاء جغرافیایی متفاوت، تعداد هفت آغازگر چند شکلی خوبی را نشان دادند. آغازگر  VBC300در اکثر نمونه‌ها تکثیری نشان نداد. اندازه محصولات تکثیر شده بین bp500 - 3500 بود. در واکنش های شاهد منفی نیز هیچ باندی مشاهده نگردید (شکل 3). کاربرد نشانگر نشان داد که تنوع ژنتیکی نسبتاً زیادی در بین این جدایه‌ها وجود دارد. آغازگر VBC222 بیشترین باند چند شکل (18 باند) و آغازگر VBC82 کمترین باند چند شکل (6 باند) را تولید کردند. آغازگر VBC83 چون شاخص تنوع ژنتیکی بالایی نسبت به بقیه آاغازگرها داشت (37/0%) به عنوان بهترین آغازگر شناخته شد. نتایج نشان داد که تکنیک RAPD از پتانسیل بالایی در تعیین تنوع ژنتیکی جدایه‌های F. solani f. sp. pisi برخوردار است و در سطح تشابه 65%، 16 گروه ژنوتیپی (از A تا P) تفکیک گردید. نتایج محاسبه فاصله ژنتیکی نشان داد که دو جدایه FA، FS9 (به ترتیب از مشهد و فریمان) با فاصله ژنتیکی 13/0 از بقیه جدایه‌ها به یکدیگر نزدیک‌ترند و در کمترین فاصله ژنتیکی نسبت به‌هم قرار دارند (شکل 4). بیشترین فاصله ژنتیکی نیز بین جدایه‌های FS16، FS7 (هر دو از منطقه فریمان)، N2، FS7 (به ترتیب ازنیشابور و فریمان) و دو جدایه FS25، FS7 (به ترتیب از فاروج و فریمان) با فاصله ژنتیکی 88/0 به دست آمد. رابطه آشکاری بین منشا جغرافیایی جدایه‌ها با گروه­بندی ژنوتیپی حاصل از نشانگر RAPD مشاهده نشد و جدایه‌های مربوط به یک منطقه جغرافیایی برخی مواقع در گروه‌های ژنوتیپی مجزا و جدایه‌های جمع آوری شده ‌از چند منطقه مختلف در یک گروه ژنوتیپی قرار گرفتند.

نتایج حاصل از نشانگر RAPD در این مطالعه با نتایج دیگر محققین در استفاده ‌از این نشانگر جهت بررسی تنوع F. solani  جدا شده ‌از کدوئیان (Alymanesh et al., 2009)، مرکبات  (Hatam-Mostafa et al., 2013)، لوبیا (Khodagholi et al., 2011) و Fusarium oxysporum  جدا شده ‌از میزبان های مختلف  (Jae- Min et al., 2006) مطابقت داشت و تنوع ژنتیکی بالایی در جدایه‌های مورد مطالعه تشخیص داده شد. تجزیه AFLP بیست جدایه F. solani f. sp. pisi با پراکنش جغرافیایی متفاوت با استفاده‌از چهار جفت آغازگر (E-AC, M-AG)، (E-AG, M-AC)، (E-AG, M-AG) و (E-AG, M-CG) در مجموع 330 باند قابل امتیاز دهی با ‌اندازه بین bp 100- 900 ایجاد نمود. از کل باندهای ایجاد شده 110 باند (حدود 34%باندها) چند شکلی نشان دادند (شکل 5). میانگین تعداد باندهای تکثیر شده به‌ازای هر جفت آغازگر 5/82 و میانگین تعداد باندهای چند شکلی به ‌ازای هر جفت آغازگر 5/27 بود. توانایی جفت آغازگرهای مختلف در آشکار سازی چند شکلی در بین جدایه‌های F. solani f. sp. pisi متغییر بود. در این میان ترکیب آغازگری E-AC, M-AG  دارای بیشترین تعداد باند چند شکل (31 باند) و ترکیب آغازگری E-AG, M-CG دارای کمترین تعداد باند چند شکل (25 باند) بود متوسط تعداد آلل موثر در هر لوکوس (Ne) برای تمام ترکیبات آغازگری 13210/0 ± 5432/1 محاسبه گردید، که با توجه به نزدیک بودن این عدد به تعداد آلل واقعی یعنی دو، دلیل بر تاثیر خوب آلل‌ها در چند شکلی بالا و برآورد تنوع ژنتیکی می­باشد. شاخص تنوع ژنی بر اساس داده‌های به دست آمده‌ از هر جفت آغازگر بین 29/0 تا 38/0 متغییر بود. کمترین مقدار شاخص تنوع ژنی برای ترکیب آغازگری E-AC, M-AG و بیشترین مقدار این شاخص برای ترکیب آغازگری E-AG, M-CG محاسبه شد. به منظور محاسبه سطح تنوع ژنتیکی بین نمونه‌ها از ماتریس فاصله ژنتیکی استفاده شد. بر اساس داده‌های AFLP، فاصله ژنتیکی جفت نمونه‌ها بین 06/0 تا 78/0 متغییر بود و میانگین فواصل ژنتیکی بین تمام جفت نمونه‌ها 43/0 محاسبه گردید. نتایج محاسبه فاصله ژنتیکی نشان داد که دو جدایه H1 و H3 (هر دو مربوط به منطقه خواف) با فاصله ژنتیکی 06/0 از بقیه جدایه‌ها به یکدیگر نزدیکترند و در کمترین فاصله ژنتیکی نسبت به‌ هم قرار دارند. جدایه‌های MP و FS28 (به ترتیب از منطقه خواف و بجنورد) و همچنین دو جدایه FS25 و FS28 (به ترتیب از فاروج و بجنورد) با فاصله ژنتیکی 78/0 در دورترین فاصله ژنتیکی نسبت به‌هم قرار گرفتند. دندروگرام حاصل از گروه بندی خوشه‌ای جدایه‌ها با استفاده‌از روش UPGMA در فاصله تشابه ژنتیکی نزدیک به 65%، چهار گروه ‌اصلی (حروف A تاD) را در بین 20 جدایه F. solani f. sp. pisi مشخص نمود (شکل 6). گروه ‌اول (A) جدایه‌های (H1, H3 FS2, FS7, CH, N2, FS5, FS9, FA, MP)، گروه دوم (B) (FS25, FS18, FS31)، گروه سوم (C) (FS18, FS20, FS36, FSF, FS14, FS16) و گروه چهارم (D)  FS28 بودند. در گروه ژنوتیپی A جدایه‌هایی با درجه بیماریزایی بالا و متوسط قرار گرفتند. در گروه ژنوتیپی B جدایه‌هایی با درجه بیماریزایی متوسط و در گروه ژنوتیپی C جدایه‌هایی با درجه بیماریزایی متوسط و پایین قرار گرفتند. جدایه غیر بیماریزای FS28 از منطقه بجنورد در گروه ژنوتیپی D به صورت مجزا قرار گرفت. گروه بندی حاصل از داده‌های AFLP در سطح تشابه ژنتیکی نزدیک به 65% تقریباً جدایه‌های با توان بیماریزایی مشابه را به خوبی تفکیک کرد. در گروه ژنوتیپی A جدایه‌های H3 و H1  هر دو از یک منطقه جغرافیایی (خواف) جدا شده بودند. این دو جدایه ‌از لحاظ درجه بیماریزایی (درجه بیماریزایی 9) نیز یکسان بودند. در همین گروه دو جدایه CH و  FS5با اینکه ‌از دو منطقه متفاوت (به ترتیب از کوه سرخ کاشمر و مزرعه دانشکده) بودند، اما در فاصله ژنتیکی بسیار کمی قرار گرفتند. لذا، به نظر می رسد رابطه آشکاری بین منشا جغرافیایی جدایه‌ها با گروه بندی خوشه‌ای جدایه‌ها وجود ندارد. نتایج این مطالعه با نتایج پژوهش  Abdel – Elsalam et al (2003)  مطابقت داشت. در تحقیق وی نشانگر AFLP تنوع ژنتیکی بین و داخل گونه‌های فوزاریوم از میزبان های مختلف در مصر را نشان داد و 46 جدایه‌از پنج میزبان مختلف را متمایز و در پنج کلاستر قرار داد، اما رابطه آشکاری بین مناطق جغرافیایی و ژنوتیپ میزبان با گروه بندی جدایه‌ها بر اساس نشانگر ژنتیکی وجود نداشت. نتیجه تحقیق حاضر با نتیجه تحقیق انجام شده در خصوص  بررسی تنوع ژنتیکی 28 جدایه‌ایرانی F. solani  بر اساس نشانگرهای PCR توسط Baghayi et al (2006) ضمن نشان از وجود تنوع ژنتیکی بین جدایه‌ها، عدم ارتباط این تنوع را با منشا جغرافیایی جدایه‌ها تایید کردند. قابلیت نشانگر AFLP در تمایز جدایه‌ها با قدرت بیماریزایی مختلف با نتایج تحقیق Bogale et al (2006) همخوانی داشت. در این پژوهش محققان در بررسی تنوع جدایه‌های F. solani در کشور اتیوپی نشان دادند که نشانگر AFLP تنوع بالایی را در جدایه‌ها دارد و لذا دودمان فیلوژنتیکی جدیدی را با توجه به شرایط آب و هوایی  کشور اتیوپی مشخص کردند. در مجموع، این پژوهش به خوبی نشان داد که تکنیک AFLP با توجه به قابلیت بالای خود در پوشش گسترده تنوع ژنومی و آشکارسازی چند شکلی بالا در ارزیابی تنوع جدایه‌های F. solani f. sp. pisi  موفق بود.  بنابراین استفاده‌از  AFLP درجه بالایی از تمایز و تشخیص جدایه‌های مختلف فوزاریوم را نشان داده و این قابلیت، کاربردی و مفید می­باشد.