Alpha amylase production by a native thermophilic strain Bacillus licheniformis-AZ2 isolated from Qinarje Hot spring in Ardebil Province

Document Type : Research Paper

Authors

Abstract

Thermophilic microorganisms are the main sources of valuable thermostable hydrolytic enzymes hence they have very importance in different industries. In comparison with other amylolytic enzymes, application of alpha amylase in starch processing industries, fermentation and carbohydrate products is a great importance and they could also be substituted with chemical hydrolysis of starch in industries. Determination of optimal conditions for thermostable α-amylase production by native strain Bacillus licheniformis was the aim of this study. Bacillus licheniformis strain has been isolated from Qinarje Hotspring (Ardebil Prov.) recently which have been identified and registered as the name of Bacillus licheniformis-AZ2 in bacterial collection of agricultural biotechnology department of Bu-Ali Sina University. In this article, possibility of the amylolytic activity of this microorganism has been evaluated using Gram’s iodine staining method. Results showed that maximum growth rate and also amylase production in basal medium conditions which was inoculated with 1% (V/V) inoculums achieved at 40˚C and pH=9, 84 hours after inoculation. Amylase assay also showed that the optimum enzyme activity was achieved at 80˚C and pH=7, so this enzyme has been considered to be thermostable. Our results showed that Bacillus licheniformis-AZ2 strain produced thermostable α-amylase with characteristics suitable for application in starch processing and other food industries.

Keywords

Full Text

تولید آنزیم آلفا­آمیلاز از سویه گرمادوست بومی Bacillus licheniformis-AZ2  جدا­سازی شده از چشمه آبگرم قینرجه در استان اردبیل

 

علی دلجو*1، ایمان آرضی2

1 دانشیار گروه بیوتکنولوژی کشاورزی، دانشکده کشاورزی، دانشگاه بو­علی سینا همدان

2دانشجوی کارشناسی ارشد بیوتکنولوژی کشاورزی، دانشکده کشاورزی، دانشگاه بو­علی سینا همدان

تاریخ دریافت: 12/08/1392، تاریخ پذیرش: 05/10/1393

چکیده

باکتری­های گرمادوست منابع با ارزشی از آنزیم­های هیدرولیتیک مقاوم به دمای بالا هستند که در صنایع مختلف دارای اهمیت بسیار می­باشند. در مقایسه با سایر آنزیم­های هیدرولیز کننده نشاسته، کاربرد تجاری آنزیم آلفا­آمیلاز در فرآوری نشاسته، تخمیر و تهیه محصولات کربوهیدراتی از اهمیت خاصی برخوردار است و توانسته جایگزین هیدرولیز شیمیایی نشاسته در فرآوری صنعتی شود. هدف از انجام این تحقیق تعیین شرایط مطلوب برای تولید آنزیم آلفا­آمیلاز مقاوم به دمای بالا توسط یک سویه باسیلوس بومی است که به تازگی از چشمه آبگرم قینرجه در استان اردبیل جداسازی و به نام Bacillus licheniformis-AZ2 در کلکسیون باکتریایی گروه بیوتکنولوژی کشاورزی دانشگاه بو­علی سینای همدان، شناسایی و ثبت گردیده است. در این مطالعه با استفاده از روش رنگ آمیزی یداین، امکان فعالیت آمیلولیتیکی باکتری مورد بررسی قرار گرفته است. نتایج آزمایش­ها نشان می­دهد که بیشترین فعالیت زیستی سلول و تولید آنزیم در شرایط محیط کشت پایه­ که بوسیله یک درصد مایه تلقیح اولیه (حجمی/حجمی) تلقیح شده بود، پس از 84 ساعت در 9=pH و دمای ˚C40 محقق شده است. همچنین آزمایش­های مربوط به تعیین فعالیت آنزیم نیز نشان داد که آنزیم تولید شده، بالا­ترین فعالیت خود را در شرایط دمای ˚C80 و بافر Tris- HCl با 7=pH بروز می­دهد. بر اساس این نتایج، آنزیم تولید شده بوسیله سویه بومی (Bacillus licheniformis-AZ2) مقاوم به دمای بالا بوده و دارای ویژگی­های مورد نیاز برای فرآوری نشاسته و کاربرد در صنایع غذایی می­باشد.

واژه­های کلیدی: باسیلوس لیکنی فورمیس، آلفا­آمیلاز مقاوم به دما، بهینه­سازی، محیط تولید.



مقدمه

نشاسته، یکی از اجزای اصلی رژیم غذایی روزانه ما را تشکیل می­دهد (Rasooli et al., 2008). علاوه براین نشاسته فراوانترین شکل از پلی­ساکارید­های ذخیره­ای ساخته شده توسط گیاهان بوده و منبعی ارزان قیمت برای تولید شربت­های قندی حاوی گلوکز، فروکتوز یا مالتوز به شمار می­آید و به طور وسیعی در صنایع غذایی مورد استفاده قرار گرفته است. هم چنین قند­های تولید شده توسط این آنزیم می­تواند برای تخمیر و تولید اتانول مورد استفاده قرار گیرد (Goyal et al., 2005). در گرانول­های نشاسته، مولکول­ها به صورت متراکم در یک حالت پلی­کریستالین (بسیار متبلور) با پیوند­های بیرون و درون مولکولی به هم فشرده شده­اند، از اینرو در آب سرد نامحلول بوده و به اکثر مواد شیمیایی و آنزیم­ها مقاوم هستند (Hamilton et al., 1999). آمیلاز­ها [α- آمیلاز، ß- آمیلاز و گلوکو­آمیلاز] از مهمترین آنزیم­ها، در بیوتکنولوژی نوین محسوب شده و بدلیل کاربرد گسترده از اهمیت بیشتری برخوردار می­باشند ( Ziaei ziabari et al., 2008; Rasooli et al., 2009). این آنزیم­ها بین 30-25 درصد از بازار جهانی آنزیم­های مهم تجاری را به خود اختصاص داده و جایگزین هیدرولیز شیمیایی نشاسته در فرآوری صنعتی شده­اند (Rasooli et al., 2009). آلفا­آمیلاز (α-1,4 -D-glucanohydrolase, E.C.3.2.1.1) در طبیعت توسط جانوران، گیاهان و میکرورگانیسم­ها تولید می­شود. این آنزیم، یک اندوهیدرولاز است که به طور تصادفی اتصالات گلیکوزیدی 4و1-α را در ترکیبات نشاسته­ای، گلیکوژن و پلی ساکارید­های مرتبط با آن­ها هیدرولیز کرده و اولیگوساکارید­هایی با موقعیت آلفا 1 و در اندازه­های متعدد به وجود می­آورد (Antranikian, 1990). خواص شیمیایی، فیزیکی و مکانیسم عمل آلفا­آمیلاز­ها تا حدودی به منبع آنزیم بستگی دارد. هر چند که آنزیم آلفا­آمیلاز پستانداران و دانه­های گیاهان زیاد مورد مطالعه قرار گرفته­اند، اما این آلفا­آمیلاز­های باکتریایی هستند که امروزه در صنعت و تجارت مورد استفاده قرار می­گیرند. معمولاً آلفا­آمیلاز­های حاصل از منابع باکتریایی بر اساس الگوی عمل بر روی نشاسته به دو دسته تقسیم می­شوند: الف) شیرین­ساز، ب) مایع­ساز (Dordick, 1991). از ابتدای دهه 1960 میلادی زمانی که آلفا­آمیلاز حاصل از Bacillus subtilis و گلوکوآمیلاز تولید شده بوسیله Aspergillus niger به عنوان جایگزین کاتالیز اسیدی در تولید دکستروز مورد استفاده قرار گرفتند، افزایش چشمگیری در تولید و کاربرد آن­ها اتفاق افتاد (Bhutto and Dahot, 2010). علیرغم تولید آمیلاز­ها در موجودات مختلف، منابع میکروبی، یعنی آمیلاز­های قارچی و باکتریایی، بدلیل مزایایی از جمله هزینه کمتر، پایداری بیشتر، صرفه­جوئی در زمان و مکان مورد نیاز برای تولید و سادگی فرآیند بهبود و بهینه­سازی، در تولید صنعتی بیشتر مورد استفاده گرفته­اند (El-Tayeb et al., 2007). آمیلاز­های باکتریایی بدلیل برخی مزایای ویژه نسبت به آمیلاز­های قارچی بیشتر ترجیح داده می­شوند (Pandey and Nigam, 2000). تقریباً همه اعضای جنس باسیلوس آلفا­آمیلاز تولید می­کنند. بنابراین این جنس پتانسیل بالقوه بیشتری در صنایع آنزیمی دارد و برای تولید آن مورد استفاده قرار می­گیرد (Pretorius et al., 1986). برخی نژاد­های باسیلوس در فاز لگاریتمی آمیلاز تولید می­کنند، این درحالی است که برخی دیگر در اواسط فاز سکون، آنزیم مورد نظر را تولید می­نمایند. به طور کلی شباهت­هایی در الگوی رشد و منحنی تولید آنزیم آمیلاز در Bacillus spp. وجود دارد، ولی شرایط بهینه برای تولید آمیلاز­ها به طور وسیعی بسته به نوع سویه متفاوت است (Thippeswamy et al., 2006). تولید آمیلاز­ها طی فرایند تخمیر به طور کامل بررسی شده است، آمیلاز­ها اکثراً خارج سلولی بوده و توسط عوامل فیزیکوشیمیایی مختلفی تحت تأثیر قرار می­گیرند. در بین این عوامل می­توان به ترکیب محیط کشت، سن و حجم مایه تلقیح، pH، دما، تکان دهی، منابع غیرآلی، اکسیژن محلول، القاء­کننده­ها، منابع نیتروژنی و کربنی به عنوان مهمترین عوامل در تولید آمیلاز اشاره کرد (Forgaty and Kelly, 1980; Forgaty and Joyce, 1974; Lonsane and Ramesh, 1990; Priest, 1977; Kuddus and Roohi, 2010). علاوه بر­این، در موارد متعددی گزارش شده که محصولات جانبی و ضایعات مختلف کشاورزی مثل سبوس گندم، سبوس برنج، ملاس نیشکر، پوسته ذرت، شیرابه­های گلوکزی و نشاسته ذرت جایگزین منبع کربنی اصلی در محیط تخمیر شده، و علاوه بر افزایش تولید آلفا­آمیلاز، به لحاظ اقتصادی نیز محیط­های تخمیری ارزان قیمتی را ارائه کرده است (Singh et al., 2009; Ul-Haq et al., 2003; Mahmoud et al., 1978). با توجه به همه موارد فوق، در مطالعه حاضر پتانسیل تولید آنزیم آلفا­آمیلاز از سویه گرما­دوست بومی Bacillus licheniformis-AZ2 که به تازگی از چشمه آبگرم قینرجه در استان اردبیل جدا­سازی شده و هم چنین شرایط محیط کشت و فعالیت آنزیم از جمله دما،  pHو مدت زمان انکوباسیون مورد بررسی قرار گرفته است.

 

مواد و روش­ها

میکرو ارگانیسم

سویه بومی Bacillus licheniformis-AZ2 از کلکسیون باکتریایی گروه بیوتکنولوژی کشاورزی دانشگاه بو­علی سینا همدان که به عنوان یک سویه گرمادوست نسبی از چشمه آبگرم قینرجه (در نزدیکی روستای موئیل در 15 کیلو­متری جنوب مشکین شهر، استان اردبیل، با مختصات جغرافیایی طول ˚46 , ΄39 شرقی و عرض ˚36 , ΄53 شمالی و دمای آب ˚C82) جداسازی و شناسایی شده است، فراهم گردید.

 

بررسی پتانسیل تولید آمیلاز توسط باکتری

باکتری جداسازی شده به منظور تعیین خصوصیات آمیلولیتیکی با آزمون هیدرولیز نشاسته بر روی پتری­های آگار حاوی نشاسته یک درصد (وزنی/حجمی) مورد ارزیابی قرار گرفت. سویه میکروبی به شکل لکه­ای بر روی این پتری­ها کشت و در دمای ˚C40 به مدت 24 ساعت نگهداری شدند. پس از سپری شدن دوره نگهداری، پتری­های آگار با محلول یداین (تازه تهیه شده) رنگ آمیزی شدند. ظهور هاله­ای شفاف در اطراف کلونی نشانگر هیدرولیز نشاسته توسط باکتری است (شکل 1) که آنرا به عنوان تولید­کننده آمیلاز برای بررسی­های بیشتر مورد توجه قرار می­دهد.

 

 

 

شکل 1- تعیین فعالیت آمیلازی باکتری Bacillus licheniformis-AZ2 براساس تغییر رنگ در حاشیه کلونی.

Figure 1- Detection of amylolytic activity in Bacillus licheniformis-AZ2 based on appearance of clear zones around the growing colonies.

 


اندازه گیری رشد باکتری

به منظور بررسی وضعیت رشد باکتری، میزان تراکم سلولی با روش کدورت سنجی و جذب در طول موج 600 نانومتر با استفاده از دستگاه اسپکتروفتومتر (Varian-UV-vis 100) در مقایسه با کنترل منفی تعیین شد (Cappuccino and Sherman, 1996).

تهیه مایه تلقیح

سویه Bacillus licheniformis-AZ2 بر روی پتری­های آگار حاوی محیط کشت LB برای مدت 24 ساعت در دمای ˚C40 نگهداری شدند. پس از آن، محیط مایع LB با دو لوپ از سلول­های این پتری­ها تلقیح شد و فلاسک­ها به مدت 24 ساعت در شیکر انکوباتور و در دمای ˚C40 وسرعت rpm 120 نگهداری و در ابتدای فاز لگاریتمی به عنوان مایه تلقیح استفاده شدند (شکل 2).


 

 

 

 

شکل 2- منحنی رشد Bacillus licheniformis- AZ2 در محیط کشت مایع LB.

Figure 2- Growth curve of Bacillus licheniformis-AZ2 in LB medium.

 


تولید آلفا­آمیلاز

حجم مایه تلقیح یک درصد (حجمی/ حجمی) محیط تولید در نظر گرفته شد. برای هر فلاسک 250 میلی­لیتری مقدار 100 میلی لیتر محیط تولید (حاوی نشاسته g/ℓ10، عصاره مخمر g/ℓ3، پپتون g/ℓ5، NaCl g/ℓ3 و MgSO4.7H2O g/ℓ5/0) استفاده شد (Suman and Ramesh, 2010). پس از تلقیح، فلاسک­ها برای مدت 120 ساعت در دمای ˚C40 روی شیکر با سرعت rpm120 نگهداری شدند. فعالیت آمیلولیتیکی آلفا­آمیلاز با استفاده از واکنشگر 3 و 5- دی نیتروسالیسیلیک اسید (DNS) تعیین شد (Bernfield, 1955). هر 6 ساعت یکبار نمونه­گیری انجام گردید و سلول­ها با کمک سانتریفوژ یخچالدار (˚C4) با سرعت rpm 10000 به مدت 10 دقیقه از محیط کشت جدا شدند. مایع رویی برای سنجش فعالیت آنزیم آلفا­آمیلاز مورد استفاده قرار گرفت.

سنجش فعالیت آلفا­آمیلاز

فعالیت آلفا­آمیلازی با روش اسپکتروفتومتری تعریف شده توسط ریک و استگبوئر تعیین گردید (Rick and Stegbauer, 1974). بر طبق روش مورد نظر فعالیت آلفا­آمیلازی با اضافه کردن یک میلی لیتر آنزیم (عصاره خام/ مایع رویی براث تخمیر شده) به یک میلی لیتر محلول یک درصد نشاسته محلول در بافر Tris- HCl ، 05/0 مولار با 2/7=pH در لوله آزمایش اندازه گیری شد. لوله­های آزمایش با پنبه پوشانده شده و برای 10 دقیقه در حمام آب گرم با دمای ˚C 65 نگهداری شدند. سپس 2 میلی لیتر از واکنشگر DNS (3و5-دی نیترو سالیسیلیک اسید) به منظور توقف واکنش به هر یک از لوله­ها اضافه گردید و دقیقاً به مدت 5 دقیقه در آب جوش قرار داده شدند. پس از سرد شدن در حمام آب سرد، میزان جذب نمونه­ها در طول موج 540 نانومتر با استفاده از دستگاه اسپکتروفتومتر (Varian-UV-vis 100) قرائت شد. یک واحد فعالیت آلفا­آمیلازی برابر با مقدار آنزیمی است که بتواند یک میلی­گرم قند احیاء­کننده معادل با مالتوز را در شرایط واکنش از سوبسترای نشاسته­ای آزاد کند.

 

بررسی مدت زمان انکوباسیون، شرایط محیط کشت و فعالیت آلفا­آمیلاز

به منظور بررسی اثر مدت زمان انکوباسیون، 120 ساعت پس از تلقیح محیط تولید، رشد و تولید آلفا­آمیلاز در فواصل زمانی 6 ساعته اندازه­گیری شده و منحنی­های مربوط به رشد باکتری و تولید آلفا­آمیلاز رسم گردید. هم چنین برای تعیین بهترین شرایط محیط تولید، رشد باکتری و تولید آلفا­آمیلاز در دامنه دمایی بین ˚C 10 تا ˚C 70 وpH  محیط تولید در دامنه بین 4 تا 11 مورد بررسی قرار گرفت. میزان pH بهینه برای فعالیت آلفا­آمیلاز به کمک تغییرات pH در واکنش سنجش آنزیمی با استفاده از بافر­های 05/0 مولار در دامنه pH بین 3 تا 11 بررسی شد (برای pHهای 3 ،4 و 5 از بافر استات سدیم/ اسید استیک، pH 6 و7 از بافر فسفات سدیم، pH 8 و 9 از بافر تریس/ اسید کلریدریک و برای pH­های 9، 10 و 11 نیز از بافر گلیسین/ هیدروکسید سدیم استفاده شد). هم چنین میزان درجه حرارت مطلوب فعالیت آلفا­آمیلاز با اندازه­گیری فعالیت آلفا­آمیلاز در بافر 05/0 مولار تریس/ اسید کلریدریک (Tris-HCl) با 2/7=pH در دامنه دمایی بین ˚C30 تا ˚C100 تعیین گردید. همه آزمایش­ها در سه تکرار انجام شد. داده­های ارائه شده میانگین سه تکرار می­باشند.

نتایج و بحث

تأثیر دما بر رشد، تولید و فعالیت آلفا­آمیلاز

انتخاب دامنه دمایی مورد استفاده در این آزمایش با در نظر گرفتن منابع مشابه موجود (Ul-Haq et al., 2005; Thippeswamy et al., 2006; Rasooli et al., 2009) صورت گرفت. مقادیر OD600nm مورد اندازه­گیری در شکل 3 نشان داده شده است. طبق این نتایج در دما­های ˚C10 تا ˚C20 سرعت تقسیم سلولی بسیار کند و روند تغییرات منحنی رشد قابل توجه نبوده است اما در فاصله ˚C30 تا ˚C40 افزایش چشمگیری در تراکم سلولی مشاهده شد و حداکثر آن در دمای ˚C40 اتفاق افتاده است، مشابه چنین الگوی رشد ارگانیسم و تولید آلفا­آمیلاز نیز توسط سویه Bacillus licheniformis GCB-36 مشاهده شده است (Hamad Ashraf, 2004). هر چند که این سویه باکتری توانسته است در دمای ˚C70 هم به حیات خود ادامه دهد و دمای چشمه مورد نمونه­برداری هم ˚C82 بوده است، اما بالاترین سرعت رشد مربوط به دمای ˚C40 می­باشد. Baysal et al. (2003) نیز با جداسازی سویه Bacillus subtilis از چشمه آبگرمی در ترکیه که دمای فصلی آن در دامنه ˚C62 تا ˚C85 است، دریافتند که دمای بهینه رشد این باکتری ˚C37 می­باشد. این تفاوت می­تواند ناشی از آن باشد که هر چند ارگانیسم قادر به رشد و تولید آنزیم در دما­های بالا می­باشد، اما بهینه دمایی سایر فرآیند­های دخیل در رشد، متابولیسم و بیوسنتز آنزیم­ها در دمای پایین­تری اتفاق می­افتد. سویه­ای گرمادوست از Bacillus licheniformis که توسطAshraf et al. (2005) از خاک جداسازی شده است نیز بیشترین تولید آنزیم را در دمای ˚C40 و بیشترین فعالیت خود را در دمای ˚C65 داشت. Rasooli et al.  (2009) نیز سویه Bacillus licheniformis shahed-07 که از خاک غربالگری شده بود را مورد مطالعه قرار دادند و گزارش کردند که حداکثر میزان آلفا­آمیلاز در دمای ˚C50 تولید شد، درحالیکه فعالیت مطلوب این آنزیم در دمای ˚C70 بود. سویه گرمادوستی از Bacillus subtilis که از شیر تازه گوسفند جدا شده نیز وجود دارد که بیشترین میزان تولید آلفا­آمیلاز خارج سلولی مقاوم به دمای بالا را در دمای ˚C40 داشته است ولی دمای بهینه فعالیت آن در حضور نشاسته و کلسیم در 5/6 = pH ، ˚C135 می­باشد (Konsula and Liakopoulou-Kyriakides, 2004). بنابراین می­توان نتیجه گرفت که معمولاً بیشترین فعالیت آنزیم در دمایی بسیار بالاتر از دمای بهینه رشد باکتری اتفاق می­افتد و بالاتر بودن بهینه فعالیت آلفا­آمیلاز بدست آمده از این سویه نسبت به سویه­های جداسازی شده از خاک می­تواند بدلیل شرایط محیط مبدأ جداسازی آن و تغییرات ژنتیکی که طی سال­ها در این سویه برای سازگار شدن با محیط پیرامونی خود بوده است، باشد. مشابه دمای بهینه رشد و تولید آلفا­آمیلاز در سویه مورد بررسی در گونه­های B. licheniformis SPT27 (Dharani Aiyer, 2004)، Bacillus sp. Marini (Ashiwini et al., 2011)، B. megaterium (Bhutto and Dahot, 2010)، B. licheniformis BS1 ، B. licheniformis FS1 و B. licheniformis GS1 (Vaseekaran et al., 2010)،  B. subtilis GCBM-2 (Ul-Haq et al.,2005) نیز گزارش شده است به طوری که حد مطلوب دمای رشد و تولید آلفا­آمیلاز برای این سویه­ها ˚C37 است. تأثیر دما بر تولید آنزیم به رشد میکروارگانیسم وابسته است. که این موضوع به وضوح در نتایج مشاهده گردید و با افزایش و کاهش رشد در دما­های مختلف میزان تولید آلفا­آمیلاز نیز متناسب با تغییرات رشد در دما­های مختلف بود. دامنه وسیع دما بین (˚C35 تا ˚C80) برای رشد و تولید بهینه آلفا­آمیلاز در باکتری­ها گزارش شده است (Burhan et al.,2003). در پژوهشیSatio and Yamamoto (1975) نیز اظهار داشتند که تفاوت­های موجود در بهینه دما در جنس­های مختلف ممکن است بدلیل تأثیر دما در سطح تولید آلفا­آمیلاز باشد. به عبارت دیگر زمانی که دمای انکوباسیون افزایش می­یابد همراه با افزایش در سطح تولید آنزیم­های تثبیت شده به سلول، میزان آلفا­آمیلاز آزاد شده از سلول توسط باکتری B. stearothermophilus کاهش می­یابد، که نشان می­دهد فعالیت آلفا­آمیلازی کل (آزاد شده و تثبیت شده به سلول) کم و بیش در هر دو دما یکسان خواهد بود. این موضوع اشاره بر آن دارد که تفاوت مشاهده شده ممکن است بدلیل اثر مستقیم دما بر تولید آلفا­آمیلاز نباشد. بنابراین توضیح دیگر می­تواند این باشد که دما ممکن است به طور غیر مستقیم سطح آلفا­آمیلاز رها شده از سلول را در محیط کشت تحت تأثیر قرار دهد (Mamo and Gessesse, 1999). بعضی از آنزیم­های تولید شده در داخل سلول قابلیت انتشار در محیط کشت را نداشته و فقط در تشکیل بلوک­های ساختمانی و اجزاء سلولی دخیل هستند. اما پاره­ای دیگر از این آنزیم­ها در داخل سلول تجمع نیافته و به منظور تجزیه مواد غذایی پیرامون برای فعالیت­های عملکردی سلول و تولید ترکیبات پیچیده­تر از طریق فرآیند آنابولیسم به محیط رشد باکتری آزاد می­شوند (Priest, 1977). May و Elliott (1968) دریافتند که در Bacillus subtilis حذف دیواره سلولی به طور چشمگیری با تولید آنزیم خارج سلولی تداخل ایجاد می­کند. بنابراین آنزیم آلفا­آمیلاز جزء دسته آنزیم­های خارج سلولی محسوب می­شود. سلول­های باکتریایی مکانیسم­های مختلفی دارند که به آن­ها امکان کنترل دقیق ترشح آنزیم را می­دهد. تغییرات در طبیعت پوشش سلول می­تواند رها­سازی آنزیم­های خارج سلولی را به محیط کشت تحت تأثیر قرار دهد (Antranikian, 1990). دما یکی از فاکتور­هایی است که این چنین تغییراتی را در غشاء سلولی و دیواره سلولی القاء می­کند. هم چنین گزارش شده که در باسیل­ها لایه پروتئینی سطحی (لایه- S) کنترل آزاد­سازی آنزیم­های خارج سلولی را در اختیار دارد. تغییر در این لایه سطحی می­تواند با تفاوتی در سطح اکسیژن القاء شده باشد. بنابراین، دمای انکوباسیون ممکن است با تحت تأثیر قرار دادن ساختار­های ماورائی غشاء سلولی و یا لایه- S با تغییر در سطح اکسیژن حل شده باعث تفاوت­هایی در بهینه­های دما برای رشد و تولید آنزیم شود (Mamo and Gessesse, 1999). آلفا­آمیلاز­های جنس باسیلوس پایداری گرمایی دارند و این ویژگی مطلوبی در صنایع ذوب نشاسته به شمار می­رود. علی رغم مطالعات زیادی که روی آلفا­آمیلاز مقاوم به دمای بالا در Bacillus licheniformis انجام شده است، اما منشاء طبیعی تحمل­پذیر بودن دمای بالا هنوز به صورت یک معما باقی مانده است به این معنی که آیا B. lichenifromis آلفا­آمیلاز مقاوم به دمای بالا را به صورت تصادفی تولید می­کند و یا تحت شرایط انتخابی در دمای بالا یا دیگر شوک­های محیطی آلفا­آمیلاز تولید می­شود (Rasooli et al.,2009). این موضوع می­تواند منشاء ژنتیکی داشته و به تغییرات در توالی آمینو­اسید­ها و ساختار آنزیم نسبت داده شود. اما در برخی منابع نیز آمده است که پایداری و فعالیت آلفا­آمیلاز در حضور یون کلسیم و ایجاد یک پیوند سه گانه­ی کلسیم- سدیم- کلسیم افزایش می­یابد، این پیوند کلسیمی باعث اتصال نواحی A و B آنزیم شده و مقاومت و پایداری دمایی آن را افزایش می­دهد (Machius et al.,1995). با توجه به فراوانی وجود یون­های فلزی مختلف از جمله کلسیم در آب چشمه­های آبگرم این مسئله توجیه پذیر است. برای سنجش دمای بهینه فعالیت آلفا­آمیلاز با توجه به دمای چشمه مبدأ باکتری (˚C82) میزان فعالیت آنزیم در شرایط دمایی بین ˚C30 تا ˚C100 و با فواصل ˚C10 مورد بررسی قرار گرفت. نتایج نشان می­دهد دمای بهینه برای فعالیت آلفا­آمیلاز در واکنش سنجش آنزیمی برای سویه B. licheniformis-AZ2 ˚C80 می باشد. دما­های بهینه مختلفی برای فعالیت آلفا­آمیلاز­ها در جنس­های مختلف باسیلوس گزارش شده است که نتایج بدست آمده با نتایج Mamo و Gessesse (1999)، Velcheva و Galabova (1985) و Farahmand et al. (2008) با بهینه فعالیت ˚C75 تا ˚C80 ، ˚C80 تا ˚C90 و ˚C80 به ترتیب در سویه­های Bacillus sp. Strain WN11 (Mamo and Gessesse, 1999)، Bacillus licheniformis MB-80 (Velcheva and Galabova, 1985) و Anoxybacillus pushchinoensis (Farahmand et al.,2008) مطابقت دارد.

 

 

شکل 3- تأثیر دما بر رشد باکتری، تولید و فعالیت آلفا­آمیلاز.

Figure 3- Effect of temperature on bacterial growth, alpha amylase production and activity.

 


تأثیر pH بر رشد، تولید و فعالیت آلفا­آمیلاز

با توجه به مطالعات مشابه انجام شده (Rasooli et al., 2009) تولید آلفا­آمیلاز و رشد باکتری B. licheniformis-AZ2 در دامنه pH معادل 4 تا 11 مورد بررسی قرار گرفت. همانطور که در شکل 4 مشاهده می­شود افزایش pH از 6 تا 9 در ˚C40 محرکی برای رشد و تولید آنزیم بود به طوری که در 9=pH  با بیشینه تراکم سلولی، تولید آنزیم نیز افزایش یافت،  pHآب چشمه در زمان نمونه­برداری 5/6 بوده است. این تفاوت بین pH مبدأ باکتری و pH بهینه رشد را نشان می­دهد. Farahmand et al. (2008) نیز آزمایش مشابهی را روی باکتری­های جداشده از چشمه آبگرم خرقان انجام دادند که pH چشمه معادل 8/5 بوده اما بهینه رشد در pH حدود 7 تا 8 گزارش شده است. شباهت نتایج این دو آزمایش نشان می­دهد که تفاوت­های دیده شده بین pH آب چشمه و pH بهینه محیط کشت واقعی بوده و ممکن است تحت تأثیر تفاوت­های موجود بین آب چشمه­ها و ترکیبات محیط کشت­های مصنوعی باشد زیرا اطلاع دقیقی از عناصر و املاح موجود در آب چشمه­ها در دست نیست. از طرف دیگر تحمل غلظت­های بالای نمک بوسیله این باکتری (90 گرم بر لیتر) می­تواند نشانه نمک دوست بودن این باکتری و توجیه­کننده بهینه تولید آنزیم در pH های قلیایی (در حدود 9) باشد. قبلاً نیز 9=pH به عنوان pH بهینه برای سویه­های Bacillus licheniformis SPT27 و Bacillus sp. DM-15 گزارش شده است. در مورد اول مبدأ جداسازی این سویه مشخص نیست اما در مورد سویه دوم از چشمه آبگرم سیفتهان واقع در نجده، ترکیه جداسازی شده است (Dharani Aiyer, 2004; Akcan et al., 2011). نتایج همچنین نشان داد باکتری در pH­های پایین­تر از 5 و بالاتر از 10 رشد رضایت بخشی نداشت و در نتیجه آن تولید آلفا­آمیلاز نیز به طور معنی­داری در این pH­ها کاهش یافت. در بین پارامتر­های بررسی شده، pH محیط کشت نقش مهمی را در تغییرات فیزیولوژیکی ارگانیسم و تولیدآنزیم ایفا می­کند (Rasooli et al., 2008). تغییر pH در طی رشد ارگانیسم بر روی پایداری آنزیم تولید شده موثر است. هم چنین معلوم شده است که ترکیب دیواره سلولی و غشای پلاسمایی میکرو ارگانیسم­ها تحت تأثیر pH قرار می­گیرد و با تغییر در طبیعت دیواره سلولی و غشای سلولی ممکن است دامنه دمای رشد میکرو ارگانیسم­ها را نیز تحت تأثیر قرار دهد (Mamo and Gessesse, 1999). اسیدیته بهینه رشد و تولید آنزیم در بیشتر سویه­های باسیلوس که به طور تجاری برای تولید آلفا­آمیلاز مورد استفاده قرار می­گیرند، بین 6 تا 9 است (Rasooli et al., 2008). دامنه pH بین 5 تا 9 برای تولید آلفا­آمیلاز بهینه در سویه­های باکتریایی B. subtilis CM3 (Swain et al.,2006)، B. brevis (Tsvetkov and Emanuilov, 1989)، B. coagulans (Medda and Chandra, 1980)، B. licheniformis CUMC305 (Krishnan and Chandra, 1983)،B. thermooleovorans NP54 (Malhotra et al.,2000)،  B. subtilis (Baig et al., 1984)، B. subtilis AX20 (Najafi et al., 2005)،  B. licheniformis (Hung et al., 2003) نیز گزارش شده است. اثر pH بر پایداری و فعالیت آلفا­آمیلاز، بهینه­هایی را نشان می­دهد که وابسته به زمان است علاوه بر این اثرpH و دما نیز با یکدیگر مرتبط هستند. دما نه تنها می­تواند بهینه pH را تحت تأثیر قرار دهد بلکه pH نیز می­تواند منحنی پایداری دمایی را نیز تحت تأثیر قرار دهد (Hamad Ashraf, 2004). به طور کلی بهینه فعالیت آلفا­آمیلاز­های حاصل از سویه Bcillus licheniformis در pH­های اسیدی، پایین است و ساختار آن به گونه­ای است که تحمل بیشتری نسبت به pH­های قلیایی نشان می­دهد (Shaw et al., 1986). در این مطالعه بیشترین فعالیت آلفا­آمیلازی در حضور بافر Tris- HCl با 7 =pH بدست آمد. با توجه به رشد باکتری در غلظت­های بالای نمک و 9=pH و خصوصیات نسبی نمک دوستی که این سویه از خود نشان می­دهد، سویه مورد نظر برای رشد، متابولیسم و تولید آلفا­آمیلاز به pH­های قلیایی نیاز داشته ولی بهینه پایداری و فعالیت آلفا­آمیلاز بدست آمده در 7=pH رخ می­دهد، که تفاوت تقریبی بین pH تولید و فعالیت آلفا­آمیلاز را توجیه می­کند. مشابه این رفتار در سویه Bacillus sp. DM-15 که به­لحاظ خصوصیات رشدی کمی قلیا دوست بوده اما فعالیت آلفا­آمیلاز بدست آمده از آن در شرایط pH کمی اسیدی اتفاق می­افتد، مشاهده شده است (Akcan et al., 2011). در پژوهشی Rasooli et al. (2009) نیز گزارش کردند که آنزیم مورد نظر بیشترین فعالیت خود را در 5/7=pH داشته و فعالیت آن در pH­های 7 و 8 (بالاتر و پایین­تر) نسبت به pH بهینه به میزان قابل توجهی کاهش یافته است. اهمیت pH فعالیت آلفا­آمیلاز­ها به کاربرد این آنزیم­ها در صنعت بر­می­گردد. آلفا­آمیلاز­های مختلفی با دامنه تحمل به pH­های اسیدی و یا قلیایی وجود دارند که هر کدام بسته به نیاز در صنایع مختلف به کار می­روند. برای مثال در صنایع شویندگی این آنزیم­ها بایستی نسبت به pH­های قلیایی تحمل بالایی داشته باشند. یا در صنعت مایع­سازی نشاسته که در pH 5/4 انجام می­شود، بایستی نسبت به pH­های اسیدی تحمل بالایی داشته باشند. آلفا­آمیلاز­های با تحمل به اسیدیته بالا نیز اغلب توسط قارچ­ها از جمله گونه­های مختلف Aspergillus تولید می­شوند (Hamad Ashraf, 2004). آلفا­آمیلاز مورد نظر ما دارای فعالیتی بهینه در اسیدیته خنثی بوده و می­تواند کاربرد­هایی در زمینه صنایع ذوب نشاسته داشته باشد.

 

 

 

شکل 4- تأثیر pH بر رشد باکتری، تولید و فعالیت آلفا­آمیلاز.

Figure 4- Effect of pH on bacterial growth, alpha amylase production and activity.

 




تأثیر مدت زمان انکوباسیون

تولید آلفا­آمیلاز و رشد باکتری در مقاطع زمانی مختلف در شکل 5 نشان داده شده است. بیشترین تولید آلفا­آمیلاز و رشد ارگانیسم 84 ساعت پس ازتلقیح محیط تولید مشاهده گردید. در پژوهشی Park and Rivera (1982) اشاره بر این موضوع داشتند که مدت زمان انکوباسیون اساساً تحت ویژگی­های ارگانیسم کشت شده و الگوی تولید آنزیم آن قرار می­گیرد. در سویه­های Bacillus megaterium Aq-2007 (Bhutto and Dahot, 2010)، Bacillus sp. Strain KCPSS-12ss (Suman and Ramesh, 2010)،SPT27  Bacillus licheniformis (Dharani Aiyer, 2004) و Bacillus licheniformis shahed-07 (Rasooli et al., 2009) بیشترین تولید آلفا­آمیلاز به ترتیب پس از 12، 24، 24 و 26 ساعت انکوباسیون گزارش شده است. هم چنین Huang et al. (2003) گزارش کردند که بیشترین تولید آلفا­آمیلاز توسط B. subtilis JS-2004 پس از 48 ساعت انکوباسیون بدست آمده و پس از 96 ساعت بتدریج تولید آنزیم کاهش یافته است. بیشترین تولید آلفا­آمیلاز توسط Bacillus licheniformis-AZ2 نیز زمانی مشاهده شد که جمعیت توده سلولی در فلاسک لرزشی به اوج خود رسید (شکل 5). پس از این مدت زمان رشد باکتری و تولید آلفا­آمیلاز بتدریج کاهش یافت. این کاهش می­تواند بدلیل اثر مهار کاتابولیتی قند­های آزاد شده در محیط بر تولید آنزیم، دناتوره شدن آنزیم بدلیل میانکنش آن با سایر اجزاء محیط کشت، تغییر اسیدیته و یا بدلیل تخلیه مواد غذایی در دسترس میکروارگانیسم باشد (Ghasemi et al., 2007; Akcan, 2011). گفته شده تولید آنزیم در ارتباط با رشد میکروارگانیسم قرار دارد و رشد میکروارگانیسم ممکن است به دلیل مواد غذایی ناکافی به مرحله­ای برسد که به طور غیر مستقیم تولید متابولیت­های ثانویه را ارتقاء بخشد (Akcan et al., 2011). در برخی از منابع زمان تولید آنزیم به فاز رشد باکتری نسبت داده شده است. Wanderley et al. (2004) اعتقاد داشتند که القاء بیشتر تولید آلفا­آمیلاز در Crypyococcus flavus اتفاق نمی­افتد، مگر زمانی که رشد به فاز سکون خود رسیده باشد و سایر منابع در دسترس از جمله قند­هایی که به سادگی در دسترس هستند از محیط تخلیه شده باشند. Sudharhsan et al. (2007) نیز به این موضوع اشاره داشتند که معمولاً تولید آلفا­آمیلاز طی فاز لگاریتمی رشد آغاز شده و در اوائل فاز سکون به بالاترین میزان خود می­رسد. هم چنین تشخیص داده شده است که شرایط محیط رشد تأثیر زیادی بر تولید آلفا­آمیلاز دارد. در پژوهشی Ghosh and Chandra (1984) اظهار داشتند نیاز­های غذایی و ویژگی­های کشت  CBML-152  Bacillus apiariues ، تولید­کننده آلفا­آمیلاز مقاوم به دمای بالا، پتانسیل­های این سویه را برای تولید صنعتی آلفا­آمیلاز نشان می­دهد. این سویه یک طبیعت رشد دو فازی را در محیط پیچیده نشان می­دهد. تحت شرایط کشت ساکن و لرزشی، بیشترین میزان تولید آنزیم به ترتیب در ابتدای فاز لگاریتمی و ابتدای فاز سکون آن بدست می­آید. بهینه مدت زمان انکوباسیون برای تولید آلفا­آمیلاز توسط این سویه در کشت­های ساکن و لرزشی به ترتیب 38-32 ساعت و 25-20 ساعت بوده است. هم چنین Ul-Haq et al. (2010) گزارش دادند استفاده از فرمانتور برای تولید آلفا­آمیلاز در سویه موتانت Bacillus amyloliqeifaciens EMS-6 علاوه بر افزایش 4/1 برابری در تولید آنزیم، مدت زمان انکوباسیون را از 72 ساعت به 48 ساعت کاهش داد که می­تواند بدلیل شرایط رشد متفاوت به لحاظ همزدن، هوادهی و سطح اکسیژن بالاتر در شرایط فرمانتور باشد. همانطور که در شکل 5 نیز مشاهده می­شود، تولید آنزیم در این سویه از ابتدای فاز لگاریتمی آغاز شده و همگام با رشد ارگانیسم میزان آن افزایش یافته است و در فاز سکون به حداکثر میزان خود رسیده است و پس از آن میزان تولید آنزیم احتمالاً بدلیل اثر مهار کاتابولیتی قند­های آزاد شده در محیط بر تولید آنزیم کاهش یافته است.

 

 

 

شکل 5- تأثیر مدت زمان انکوباسیون بر رشد باکتری و تولید آنزیم آلفا­آمیلاز.

Figure 5- Effect of incubation time on bacterial growth, alpha amylase production and activity.

 


نتیجه گیری

سویه بومی Bacillus licheniformis-AZ2 سطح مطلوبی از آلفا­آمیلاز مقاوم به دمای بالا (˚C 80) را تولید می­کند. با توجه به آنچه در این تحقیق بدست آمد، می­توان چنین نتیجه گرفت که این آنزیم از نظر صنعتی بسیار مهم و پر کاربرد بوده و دارای قابلیت مناسبی در فرآوری نشاسته و صنایع غذایی می­باشد. فرآیند تولید صنعتی این آنزیم می­تواند با بهینه­سازی سایر ترکیبات محیط کشت، در سطح تجاری مطرح شود.

 

 

منابع

Akcan N (2011). High level production of extracellular Alpha-amylase from Bacillus Licheniformis ATCC 12759 in Submerged Fermentation. Romanian Biotechnology Letters 16: 6833-6840.

Akcan N, Uyar F, GÜven A (2011). Alpha- amylase production by Bacillus subtilis RSKK96 in submerged cultivation. Kafkas Universitesi Veteriner Fakultesi Dergisi 17: 17-22.

Antranikian G (1990). Physiology and enzymology of thermophilic anaerobic bacteria degrading starch. FEMS Microbiology Reviews 75: 201-218.

Ashraf H, Rana K, Zainab H, Ul-Haq I (2005). Production of alpha amylase by a thermophilic strain of Bacillus licheniformis. Journal of Food Technology 3: 64-67.

Ashwini K, Gaurav K, Karthik L, Bhaskara Rao KV (2011). Optimization, production and partial purification of extracelluar α-amylase from Bacillus sp. Marini. Archives of Applied Science Research 3: 33-42.

Baig MA, Pazlarova J, Votruba J (1984). Kinetics of α-amylase production in a batch and fed-batch culture of Bacillus subtilis. Folia Microbiology 38: 77-80.

Baysal Z, Uyar F, Aytekin C (2003). Production of α-amylase by thermotolerant Bacillus subtilis in the presence of some carbon, nitrogen containing compounds and surfactants. Annals of Microbiology 53: 323-328.

Bernfield P (1955). Amylase alpha and beta. Methods of Enzymology 1: 149-158.

Bhutto MA, Dahot MU (2010). Effect of alternative carbon and nitrogen sources on production of alpha- amylase by Bacillus megaterium. World Applied Sciences Journal (Special Issue of Biotechnology & Genetic Engineering) 8: 85-90.

Burhan A, Nisa U, Gokhan C, Omer C, Ashabil A, Osman G (2003). Enzymatic properties of a novel thermostable, thermophilic, alkaline and chelator resistant amylase from an alkaliphilic Bacillus sp. isolate ANT-6. Process Biochemistry 38: 1397-1403.

Cappuccino J, Sherman N (1996). Microbiology (a laboratory manual). Benjamin/ Cumming publishing company INC, USA, pp.13-16.

Dharani Aiyer PV (2004). Effect of C:N ratio on alpha amylase production by Bacillus licheniformis SPT27, African Journal of Biotechnology 3: 519-522.

Dordick JS (1991). Biocatalysis for industry. Plenum Press, New York, pp. 161–180.

El- Tayeb O, Mohammad F, Hashem A, Aboulwafa M (2007). Optimization of the industrial production of bacterial alpha amylase in Egypt. IV. Fermentor production and characterization of the enzyme of two strains of Bacillus subtilis and Bacillus amyloliqueifaciens. African Journal of Biotechnology 7: 4521-4536.

Farahmand M, Mozaffari NA, Mehrabian S, Khavari Nejad R (2008). Characterization of α-amylase produced by thermophilic bacteria isolated from Iranian hotspring waters. Pajouhesh and Sazandegi 81: 161-167.

Forgaty WM, Joyce AM (1974). Enzymes of Bacillus species, Part I. Process Biochemistry 9: 11-24.

Fogarty WM, Kelly CT (1980) Amylases, amyloglycosidases, and related gluconases. In: Rose AH (ed) Economic microbiology- microbial enzymes and bioconversions. Academic Press, New York, pp 115–170.

Ghasemi A, Khajeh K, Ranjbar B (2007). Stabilization of Bacillus licheniformis alpha-amylase by specific antibody which recognizes the N-terminal fragment of the enzyme. International Journal of Biological Macromolecules 41: 162-167.

Ghosh SB, Chandra AK (1984). Nutritional requirements and cultural characteristics of Bacillus apiaries CBML-152 for the production thermostable alpha-amylase. Zentralblatt Fur Bakteriologie-international journal of Medical Microbiology 139: 293-304.

Goyal N, Gupta JK, Soni SK (2005). A novel raw starch digesting thermostable α-amylase from Bacillus sp.I-3 and it’s use in the direct hydrolysis of raw potato starch. Enzyme and Microbial Technology 37: 723-734.

Hamad Ashraf M (2004). Studies on the biosynthesis of alpha amylase by a mutant strain of Bacillus species. Ph.D. Thesis. University of the Punjab, Pakistan.

Hamilton LM, Kelly CT, Fogarty WM (1999). Purification and properties of the raw starch degrading α-amylase of Bacillus sp. IMD 434. Biotechnology Letters 21: 111–115.

Huang H, Ridgway D, Gu T, Moo-Young M (2004). Enhanced amylase production by Bacillus subtilis using a dual exponential feeding strategy. Bioprocess and Biosystem Engineering 27: 63-69.

Hung H, Ridgway D, Gu T, Moo- Young M (2003). A segregated model for heterologous amylase production by Bacillus subtilis. Enzyme and. Microbial Technology 32: 407-413.

Konsula Z, Liakopoulou-Kyriakides M (2004). Hydrolysis of starches by the action of an α-amylase from Bacillus subtilis. Process Biochemistry 39: 1745-1749.

Krishnan T, Chandra AK (1983). Purification and Characterization of α-amylase from Bacillus licheniformis CUMC305. Applied Environmental Microbiology 46: 430-437.

 Kuddus M, Roohi R (2010). Microbial cold- active α- amylases: From fundamentals to recent developments. Current research Technology and Education. Topics in Applied Microbiology and Microbial Biotechnology 1265-1276.

Lonsone B, Ramesh MV (1990). Production of bacterial thermostable α-amylase by solid state fermentation. Advances in Applied Microbiology 35: 181-188.

Machius M, Declerck N, Huber H, Wiegand G (1998). Activation of Bacillus licheniformis α-amylase through a disorder→order transition of the substrate-binding site mediated by a calcium-sodium-calcium metal triad. Structure 6: 281-292.

Mahmoud SAZ, Abdel- Hafez AM, Mashhoor WA, Refaat AAA (1978). Utilization of industrial and agricultural by-products for fungal amylase production. Zentralbl Bakteriol Naturwiss 133: 115-120.

Malhotra R, Noorwez SM, Satyanarayana T (2000). Production and partial characterization of thermostable and calcium-independent α-amylase of an extreme thermophile Bacillus thermooleovorans NP 54. Letters of Applied Microbiology 31: 378-384.

Mamo G, Gessesse A (1999). Purification and characterization of two raw starch digesting thermostable alpha amylase from a thermophilic Bacillus. Enzyme and Microbial Technology 25: 433-438.

May BK, Elliott WH (1968). Selective inhibition of extracellular enzyme synthesis by removal of cell wall from Bacillus subtilis. Biochemica et Biophysica Acta 166: 532-537.

Medda S, Chandra AK (1980). New strains of Bacillus licheniformis and Bacillus coagulans producing thermostable α-amylase active at alkaline pH. Journal of Applied Bacteriology 48: 47-58.

Najafi MF, Deobagkar D, Deobagkar D (2005). Purification and characterization of an extracellular α-amylase from Bacillus subtilis AX20. Protein Expression and Purification 41: 349-354.

Pandey A, Nigam P, Soccol CR, Soccol VT, Singh D, Mohan R (2000). Advances in microbial amylases biotechnology. Applied Biochemistry 31: 135-152.

Park YK, Rivera BC (1982). Alchol production from various enzyme converted starches with or without cooking. Biotechnology and Bioengineering 24: 495-500.

Pretorius IS, Koch MJ, Britz HJ, Potgieter HJ, Lategan PM (1986). Numerical taxonomy of amylase producing Bacillus species. Journal of Applied Bacteriology 60: 351-360.

Priest FG (1977). Extracellular enzyme synthesis in the genus Bacillus. Bacteriology Reviews 41: 711-753.

Rasooli I, Darvish Alipoor Astaneh Sh, Borna H, Azizi Barchini K (2008). A thermostable α-amylase producing natural variant of Bacillus spp. isolated from soil in iran. American Journal of Agriculture and Biology Science 3: 591-596.

Rasooli I, Mousavi Gargari SL, Sorouri Zanjani R, Darvish Alipoor Astaneh Sh (2009). Characterization of a thermotolerant α-amylase producing natural variant of Bacillus species. Journal of Rafsanjan University of Medical Sciences 8: 303-316.

Rick W, Stegbauer HP (1974). Alpha amylase measurement of reducing groups. In: II. Principles of Microbiology. 4th Ed. H.V. Bermeyer, Academic Press, New York, USA, pp. 885-915.

Satio N, Yamamoto K (1975). Regulatory factors affecting α-amylase production in Bacillus licheniformis. Journal of bacteriology 121: 848-856.

Shaw A, Bott R, Day AG (1986). protein engineering of α-amylases for low pH performance. Current Opinion in Biotechnology 10: 349-352.

Singh A, Singh N, Bishnoi NR (2009). production of cellulose by Asperigillus heteromorphus from wheat straw under submerged fermentation. International Journal of Enviromental Science and Engineering 1: 23-26.

Sudharhsan S, Senthikumar S, Ranjith K (2007). Physical and nutritional factors affecting the production of amylase from species of Bacillus isolated from spoiled food waste. African Journal of Biotechnology 6: 430-435.

Suman S, Ramesh K (2010). Production of a thermostable extracellular amylase from thermophilic Bacillus species. Pharmaceutical Sciences and Research 2: 149-154.

Swain MR, Kar SH, Padmaja G, Ray RC (2006). Partial characterization and optimization for production of extracellular α-amylase from Bacillus subtilis isolated from culturable cow dung microflora. Polish Journal of Microbiology 55: 289-296.

Thippeswamy S, Girigowda K, Mulimani VH (2006). Isolation and identification of α- amylase producing Bacillus sp. From dhal industry waste. Indian Journal of Biochemistry and Biophysics 43: 295-298.

Tsvetkov VT, Emanuilov EI (1989). Purification and properties of heat stable α-amylase from Bacillus brevis. Applied Microbiology and Biotechnology 31: 246-248.

Ul- Haq I, Shamim N, Ashraf H, Ali S, Qadeer MA (2005). Effect of surfectants on the biosynthesis of alpha amylase by Bacillus subtilis GCBM-25. Pakistan Journal of Botanics 37: 373-379.

Ul-Haq I, Ali S, Javed MM, Hameed U, Saleem A, Adnan F, Qadeer MA (2010). Production of Alpha-Amylase from a Randomly Induced Mutant Strain of Bacillus amyloliqueifaciens and Its Application As a Desizer in Textile Industry. Pakistan Journal of Botanic 42: 473-484.

Ul-Haq I, Ashraf H, Iqbal J, Qadeer MA (2003). Production of alpha amylase by Bacillus licheniformis using an economical medium. Bioresource Technology 87: 57-61.

Vaseekaran S, Balakumar S, Arasaratnam V (2010). Isolation and Identification of a Bacterial Strain Producing Thermostable α- Amylase. Tropical Agriculture Research 22: 1-11.

Velcheva P, Galabova D (1985). Influence of Na+ and K+ ions on the kinetic parameters of the enzyme action and thermal denaturation of thermostable alpha- amylase. Acta microbiologia Bulgarica 16: 67-72.

Wanderley KJ, Torres FAG, Moraes L, Ulhoa CJ (2004). Biochemical characterization of α-amylase from the yeast Cryptococcus flavus. FEMS Microbiology Letters 231: 165-169.

Ziaei Ziabari M, Faezi Ghassemi M, Ghaemi M (2008). Amylase production by native strain Bacillus sp. (BC18) A comparison between the free and immobilized cells forms. Journal of Biological Sciences Branch of Islamic Azad University of Lahijan 2: 55-66.

 

 

Alpha amylase production by a native thermophilic strain Bacillus licheniformis-AZ2 isolated from Qinarje Hot spring in Ardebil Province

 

Deljou A.*1, Arezi I.2

 

1Assistant professor, Department of Agricultural Biotechnology, Bu-­Ali Sina University, Hamedan, Iran.

2Msc. Students of Agricultural Biotechnology, Bu-­Ali Sina University, Hamedan, Iran.

 

 

Abstract

Thermophilic microorganisms are the main sources of valuable thermostable hydrolytic enzymes hence they have very importance in different industries. In comparison with other amylolytic enzymes, application of alpha amylase in starch processing industries, fermentation and carbohydrate products is a great importance and they could also be substituted with chemical hydrolysis of starch in industries. Determination of optimal conditions for thermostable α-amylase production by native strain Bacillus licheniformis was the aim of this study. Bacillus licheniformis strain has been isolated from Qinarje Hotspring (Ardebil Prov.) recently which have been identified and registered as the name of Bacillus licheniformis-AZ2 in bacterial collection of agricultural biotechnology department of Bu-Ali Sina University. In this article, possibility of the amylolytic activity of this microorganism has been evaluated using Gram’s iodine staining method. Results showed that maximum growth rate and also amylase production in basal medium conditions which was inoculated with 1% (V/V) inoculums achieved at 40˚C and pH=9, 84 hours after inoculation. Amylase assay also showed that the optimum enzyme activity was achieved at 80˚C and pH=7, so this enzyme has been considered to be thermostable. Our results showed that Bacillus licheniformis-AZ2 strain produced thermostable α-amylase with characteristics suitable for application in starch processing and other food industries.

Keywords: Bacillus licheniformis- Thermostable α-amylase, Optimization, Production medium.[1]

 

 

 


* نویسنده مسئول: علی دلجو                           تلفن: 09181111567                                    Email: alideljou@yahoo.com

* Corresponding Author: Deljou A.            Tel: +989181111567                  Email: alideljou@yahoo.com

 

References

Akcan N (2011). High level production of extracellular Alpha-amylase from Bacillus Licheniformis ATCC 12759 in Submerged Fermentation. Romanian Biotechnology Letters 16: 6833-6840.
Akcan N, Uyar F, GÜven A (2011). Alpha- amylase production by Bacillus subtilis RSKK96 in submerged cultivation. Kafkas Universitesi Veteriner Fakultesi Dergisi 17: 17-22.
Antranikian G (1990). Physiology and enzymology of thermophilic anaerobic bacteria degrading starch. FEMS Microbiology Reviews 75: 201-218.
Ashraf H, Rana K, Zainab H, Ul-Haq I (2005). Production of alpha amylase by a thermophilic strain of Bacillus licheniformis. Journal of Food Technology 3: 64-67.
Ashwini K, Gaurav K, Karthik L, Bhaskara Rao KV (2011). Optimization, production and partial purification of extracelluar α-amylase from Bacillus sp. Marini. Archives of Applied Science Research 3: 33-42.
Baig MA, Pazlarova J, Votruba J (1984). Kinetics of α-amylase production in a batch and fed-batch culture of Bacillus subtilis. Folia Microbiology 38: 77-80.
Baysal Z, Uyar F, Aytekin C (2003). Production of α-amylase by thermotolerant Bacillus subtilis in the presence of some carbon, nitrogen containing compounds and surfactants. Annals of Microbiology 53: 323-328.
Bernfield P (1955). Amylase alpha and beta. Methods of Enzymology 1: 149-158.
Bhutto MA, Dahot MU (2010). Effect of alternative carbon and nitrogen sources on production of alpha- amylase by Bacillus megaterium. World Applied Sciences Journal (Special Issue of Biotechnology & Genetic Engineering) 8: 85-90.
Burhan A, Nisa U, Gokhan C, Omer C, Ashabil A, Osman G (2003). Enzymatic properties of a novel thermostable, thermophilic, alkaline and chelator resistant amylase from an alkaliphilic Bacillus sp. isolate ANT-6. Process Biochemistry 38: 1397-1403.
Cappuccino J, Sherman N (1996). Microbiology (a laboratory manual). Benjamin/ Cumming publishing company INC, USA, pp.13-16.
Dharani Aiyer PV (2004). Effect of C:N ratio on alpha amylase production by Bacillus licheniformis SPT27, African Journal of Biotechnology 3: 519-522.
Dordick JS (1991). Biocatalysis for industry. Plenum Press, New York, pp. 161–180.
El- Tayeb O, Mohammad F, Hashem A, Aboulwafa M (2007). Optimization of the industrial production of bacterial alpha amylase in Egypt. IV. Fermentor production and characterization of the enzyme of two strains of Bacillus subtilis and Bacillus amyloliqueifaciens. African Journal of Biotechnology 7: 4521-4536.
Farahmand M, Mozaffari NA, Mehrabian S, Khavari Nejad R (2008). Characterization of α-amylase produced by thermophilic bacteria isolated from Iranian hotspring waters. Pajouhesh and Sazandegi 81: 161-167.
Forgaty WM, Joyce AM (1974). Enzymes of Bacillus species, Part I. Process Biochemistry 9: 11-24.
Fogarty WM, Kelly CT (1980) Amylases, amyloglycosidases, and related gluconases. In: Rose AH (ed) Economic microbiology- microbial enzymes and bioconversions. Academic Press, New York, pp 115–170.
Ghasemi A, Khajeh K, Ranjbar B (2007). Stabilization of Bacillus licheniformis alpha-amylase by specific antibody which recognizes the N-terminal fragment of the enzyme. International Journal of Biological Macromolecules 41: 162-167.
Ghosh SB, Chandra AK (1984). Nutritional requirements and cultural characteristics of Bacillus apiaries CBML-152 for the production thermostable alpha-amylase. Zentralblatt Fur Bakteriologie-international journal of Medical Microbiology 139: 293-304.
Goyal N, Gupta JK, Soni SK (2005). A novel raw starch digesting thermostable α-amylase from Bacillus sp.I-3 and it’s use in the direct hydrolysis of raw potato starch. Enzyme and Microbial Technology 37: 723-734.
Hamad Ashraf M (2004). Studies on the biosynthesis of alpha amylase by a mutant strain of Bacillus species. Ph.D. Thesis. University of the Punjab, Pakistan.
Hamilton LM, Kelly CT, Fogarty WM (1999). Purification and properties of the raw starch degrading α-amylase of Bacillus sp. IMD 434. Biotechnology Letters 21: 111–115.
Huang H, Ridgway D, Gu T, Moo-Young M (2004). Enhanced amylase production by Bacillus subtilis using a dual exponential feeding strategy. Bioprocess and Biosystem Engineering 27: 63-69.
Hung H, Ridgway D, Gu T, Moo- Young M (2003). A segregated model for heterologous amylase production by Bacillus subtilis. Enzyme and. Microbial Technology 32: 407-413.
Konsula Z, Liakopoulou-Kyriakides M (2004). Hydrolysis of starches by the action of an α-amylase from Bacillus subtilis. Process Biochemistry 39: 1745-1749.
Krishnan T, Chandra AK (1983). Purification and Characterization of α-amylase from Bacillus licheniformis CUMC305. Applied Environmental Microbiology 46: 430-437.
 Kuddus M, Roohi R (2010). Microbial cold- active α- amylases: From fundamentals to recent developments. Current research Technology and Education. Topics in Applied Microbiology and Microbial Biotechnology 1265-1276.
Lonsone B, Ramesh MV (1990). Production of bacterial thermostable α-amylase by solid state fermentation. Advances in Applied Microbiology 35: 181-188.
Machius M, Declerck N, Huber H, Wiegand G (1998). Activation of Bacillus licheniformis α-amylase through a disorder→order transition of the substrate-binding site mediated by a calcium-sodium-calcium metal triad. Structure 6: 281-292.
Mahmoud SAZ, Abdel- Hafez AM, Mashhoor WA, Refaat AAA (1978). Utilization of industrial and agricultural by-products for fungal amylase production. Zentralbl Bakteriol Naturwiss 133: 115-120.
Malhotra R, Noorwez SM, Satyanarayana T (2000). Production and partial characterization of thermostable and calcium-independent α-amylase of an extreme thermophile Bacillus thermooleovorans NP 54. Letters of Applied Microbiology 31: 378-384.
Mamo G, Gessesse A (1999). Purification and characterization of two raw starch digesting thermostable alpha amylase from a thermophilic Bacillus. Enzyme and Microbial Technology 25: 433-438.
May BK, Elliott WH (1968). Selective inhibition of extracellular enzyme synthesis by removal of cell wall from Bacillus subtilis. Biochemica et Biophysica Acta 166: 532-537.
Medda S, Chandra AK (1980). New strains of Bacillus licheniformis and Bacillus coagulans producing thermostable α-amylase active at alkaline pH. Journal of Applied Bacteriology 48: 47-58.
Najafi MF, Deobagkar D, Deobagkar D (2005). Purification and characterization of an extracellular α-amylase from Bacillus subtilis AX20. Protein Expression and Purification 41: 349-354.
Pandey A, Nigam P, Soccol CR, Soccol VT, Singh D, Mohan R (2000). Advances in microbial amylases biotechnology. Applied Biochemistry 31: 135-152.
Park YK, Rivera BC (1982). Alchol production from various enzyme converted starches with or without cooking. Biotechnology and Bioengineering 24: 495-500.
Pretorius IS, Koch MJ, Britz HJ, Potgieter HJ, Lategan PM (1986). Numerical taxonomy of amylase producing Bacillus species. Journal of Applied Bacteriology 60: 351-360.
Priest FG (1977). Extracellular enzyme synthesis in the genus Bacillus. Bacteriology Reviews 41: 711-753.
Rasooli I, Darvish Alipoor Astaneh Sh, Borna H, Azizi Barchini K (2008). A thermostable α-amylase producing natural variant of Bacillus spp. isolated from soil in iran. American Journal of Agriculture and Biology Science 3: 591-596.
Rasooli I, Mousavi Gargari SL, Sorouri Zanjani R, Darvish Alipoor Astaneh Sh (2009). Characterization of a thermotolerant α-amylase producing natural variant of Bacillus species. Journal of Rafsanjan University of Medical Sciences 8: 303-316.
Rick W, Stegbauer HP (1974). Alpha amylase measurement of reducing groups. In: II. Principles of Microbiology. 4th Ed. H.V. Bermeyer, Academic Press, New York, USA, pp. 885-915.
Satio N, Yamamoto K (1975). Regulatory factors affecting α-amylase production in Bacillus licheniformis. Journal of bacteriology 121: 848-856.
Shaw A, Bott R, Day AG (1986). protein engineering of α-amylases for low pH performance. Current Opinion in Biotechnology 10: 349-352.
Singh A, Singh N, Bishnoi NR (2009). production of cellulose by Asperigillus heteromorphus from wheat straw under submerged fermentation. International Journal of Enviromental Science and Engineering 1: 23-26.
Sudharhsan S, Senthikumar S, Ranjith K (2007). Physical and nutritional factors affecting the production of amylase from species of Bacillus isolated from spoiled food waste. African Journal of Biotechnology 6: 430-435.
Suman S, Ramesh K (2010). Production of a thermostable extracellular amylase from thermophilic Bacillus species. Pharmaceutical Sciences and Research 2: 149-154.
Swain MR, Kar SH, Padmaja G, Ray RC (2006). Partial characterization and optimization for production of extracellular α-amylase from Bacillus subtilis isolated from culturable cow dung microflora. Polish Journal of Microbiology 55: 289-296.
Thippeswamy S, Girigowda K, Mulimani VH (2006). Isolation and identification of α- amylase producing Bacillus sp. From dhal industry waste. Indian Journal of Biochemistry and Biophysics 43: 295-298.
Tsvetkov VT, Emanuilov EI (1989). Purification and properties of heat stable α-amylase from Bacillus brevis. Applied Microbiology and Biotechnology 31: 246-248.
Ul- Haq I, Shamim N, Ashraf H, Ali S, Qadeer MA (2005). Effect of surfectants on the biosynthesis of alpha amylase by Bacillus subtilis GCBM-25. Pakistan Journal of Botanics 37: 373-379.
Ul-Haq I, Ali S, Javed MM, Hameed U, Saleem A, Adnan F, Qadeer MA (2010). Production of Alpha-Amylase from a Randomly Induced Mutant Strain of Bacillus amyloliqueifaciens and Its Application As a Desizer in Textile Industry. Pakistan Journal of Botanic 42: 473-484.
Ul-Haq I, Ashraf H, Iqbal J, Qadeer MA (2003). Production of alpha amylase by Bacillus licheniformis using an economical medium. Bioresource Technology 87: 57-61.
Vaseekaran S, Balakumar S, Arasaratnam V (2010). Isolation and Identification of a Bacterial Strain Producing Thermostable α- Amylase. Tropical Agriculture Research 22: 1-11.
Velcheva P, Galabova D (1985). Influence of Na+ and K+ ions on the kinetic parameters of the enzyme action and thermal denaturation of thermostable alpha- amylase. Acta microbiologia Bulgarica 16: 67-72.
Wanderley KJ, Torres FAG, Moraes L, Ulhoa CJ (2004). Biochemical characterization of α-amylase from the yeast Cryptococcus flavus. FEMS Microbiology Letters 231: 165-169.
Ziaei Ziabari M, Faezi Ghassemi M, Ghaemi M (2008). Amylase production by native strain Bacillus sp. (BC18) A comparison between the free and immobilized cells forms. Journal of Biological Sciences Branch of Islamic Azad University of Lahijan 2: 55-66.
 

Files

Share

How to cite

Statistics