Isolation, cloning and molecular characterization of genes encoding single-strand specific endonucleases from Parsley (Petroselinum crispum L.)

Document Type : Research Paper

Authors

Abstract

Single-strand specific (sss) nucleases (S1/P1 family) are widely used in molecular genetics studies. The most widely used sss-nucleases are those plant endonucleases with the ability of specific cleavage of mismatch loops in heteroduplex DNA molecules. Because of the valuable activity of these endonucleases, enzymatic cleavage of heteroduplex DNA molecules is one of the most common techniques of point mutation detection in genomes. In this study, gene sequences encoding single-strand specific endonucleases were isolated from parsley (Petroselinum crispum L.) using heterologous primers in PCR reactions. The isolated gene sequences, after cloning and molecular identification, were designated as pars I and pars II. Physicochemical, structural and phylogenetic analysis using software tools, verified PARS I and PARS II as two members of S1/P1 family with a substantial homology to heteroduplex DNA specific endonucleases. However, it is essential to produce pure enzyme preparations as native or recombinant forms to determine mechanisms of activity and substrate preferences of these nucleases on heteroduplex DNA substrates.    

Keywords

Full Text

جداسازی، همسانه‌سازی و توصیف ملکولی ژن‌های رمزکننده آنزیم‌های اندونوکلئاز اختصاصی

تک‌رشته از گیاه جعفری (Petroselinum crispum L.)

 

مهدیه میرزایی1، جعفر ذوالعلی*2، آناهیت شالوزاد1

 

1 دانش‌آموخته بیوتکنولوژی کشاورزی، دانشکده کشاورزی، دانشگاه شهید باهنر کرمان.

2 استادیار گروه بیوتکنولوژی کشاورزی، دانشکده کشاورزی، دانشگاه شهید باهنر کرمان.

تاریخ دریافت: 04/03/1392، تاریخ پذیرش: 20/04/1393

 

چکیده

نوکلئازهای اختصاصی تک‌رشته (خانواده S1/P1)، بطور گسترده در تحقیقات ژنتیک مولکولی مورد استفاده قرار می گیرند. پرکاربردترین آنزیم های این خانواده، اندونوکلئازهای گیاهی هستند که از قابلیت برش اختصاصی نواحی جفت شدگی ناجور در مولکول های DNA هترودوپلکس برخوردارند. تکنیک هضم آنزیمی DNA هترودوپلکس مبتنی بر فعالیت این اندونوکلئازها، یکی از متداول‌ترین تکنیک‌های مورد استفاده برای شناسایی جهش‌های نقطه‌ای در ژنوم است. در این تحقیق، توالی‌های ژنی رمزکننده آنزیم‌های اندونوکلئاز اختصاصی تک‌رشته از گیاه جعفری (Petroselinum crispum) با استفاده از آغازگرهای هترولوگ در واکنش PCR جداسازی گردیدند. توالی های ژنی جداسازی شده، پس از همسانه سازی و تعیین ماهیت، به نام‌های PARS I و PARS II نامگذاری شدند. مطالعه نرم‌افزاری خصوصیات فیزیکوشیمیایی، ساختار مولکولی و قرابت ژنتیکی نشان داد که دو آنزیم PARS I و PARS II به خانواده نوکلئازهای S1/P1 تعلق داشته و شباهت زیادی به نوکلئازهای اختصاصی DNA هترودوپلکس نشان می‌دهند. با این حال، تعیین مکانیزم فعالیت و ترجیح سوبسترایی این نوکلئازها، مستلزم بررسی فعالیت نمونه خالص طبیعی یا نوترکیب آنها بر روی سوبسترای DNA هترودوپلکس می باشد.         

واژه‌های کلیدی: نوکلئازهای اختصاصی تک‌رشته، جعفری، هضم آنزیمی DNA هترودوپلکس، همسانه‌سازی.



مقدمه

نوکلئازهای اختصاصی تک‌رشته که به نوکلئازهای خانواده S1/P1 نیز معروف می‌باشند، بطور اختصاصی مولکول‌های اسید نوکلئیک تک‌رشته‌ای و همچنین نواحی تک‌رشته‌ای موضعی در مولکول‌های دو رشته‌ای را هدف قرار می‌دهند (Desai & Shankar, 2003). شهرت نوکلئازهای این خانواده بیشتر به‌دلیل کاربردهای تحقیقاتی گسترده آنها می‌باشد. این آنزیم‌ها بطور گسترده در مطالعات تعیین ساختمان مولکولی اسیدهای نوکلئیک، نقشه‌یابی جهش‌ها و بررسی میان کنش‌های DNA با عوامل مولکولی مختلف مورد استفاده قرار می‌گیرند(Drew, 1984) . این نوکلئازها از منابع بسیار متعددی شامل میکروارگانیزم‌ها، گیاهان و جانوران جداسازی شده‌اند. با کشف اندونوکلئاز CEL I از گیاه کرفس(Oleykowski et al., 1998) ، دسته جدیدی از آنزیم‌های نوکلئاز اختصاصی تک‌رشته با قابلیت برش اختصاصی در باند فسفودی‌استر مجاور ناحیه ΄3 لوپ جفت‌شدگی ناجور در مولکول‌های DNA هترودوپلکس به دنیا معرفی شد. در حال حاضر، تکنیک هضم قطعات DNA هترودوپلکس مبتنی بر فعالیت آنزیمی CEL I و سایر نوکلئازهای مشابه آن به‌منظور شناسایی و آشکارسازی جهش‌های تک‌نوکلئوتیدی و درج و حذف‌های چند نوکلئوتیدی کوچک در جنبه‌های مختلف بیولوژی مولکولی و ژنتیک پزشکی مورد استفاده قرار می‌گیرد (Taylor & Deeble, 1999; Henikoff & Comai, 2003; Till et al., 2004).

پس از کشف آنزیم‌ CEL I، نوکلئازهای گیاهی دیگری با قابلیت مشابه شناسایی و معرفی گردید که از جمله می‌توان نوکلئاز لوبیاسبز (Sung & Laskowski, 1962; Laskowski, 1980)، نوکلئاز SP1 از گیاه اسفناج (Doetsch et al., 1988)، نوکلئازهای سری ZEN از گل آهار (Aoyagi et al., 1998; Perez-Amador et al., 2000)، نوکلئاز DSA6 از سوسن یک‌روزه (Panavas et al., 1999)، نوکلئاز StEN1 از سیب‌زمینی (Nomura et al., 1971; Larsen, 2005)، نوکلئازهای سری Endo از آرابیدوپسیس (Triques et al., 2007)، نوکلئاز TBN1 (SlEN1) از گوجه‌فرنگی (Matousek et al., 2009) و نوکلئازهایی از کرچک، انگور و یونجه را نام برد.

شناسایی فعالیت‌های آنزیمی جدید در عصاره‌های مختلف گیاهی و توصیف آنزیم‌های متناظر، دانش موجود در مورد ساختار و مکانیزم عمل این گروه آنزیمی را افزایش داده و ابزارهای جدیدی را به خزانه آنزیمی مورد استفاده در تحقیقات غربال جهش اضافه می‌نماید. در تحقیق حاضر، با هدف دستیابی به آنزیمی با خصوصیات متفاوت نسبت به نوکلئازهای شناخته‌شده کنونی، ضمن جداسازی و همسانه‌سازی طول کامل cDNA رمزکننده آنزیم‌های اندونوکلئاز اختصاصی DNA هترودوپلکس از گیاه جعفری (Petroselinum crispum L.) و نامگذاری این نوکلئازها به نام های PARS I و PARS II، ساختار مولکولی، خصوصیات بیوشیمیایی و جایگاه فیلوژنتیکی آنها در مقایسه با سایر نوکلئازهای هم‌خانواده مشخص گردید.

 

مواد و روش‌ها

بذرهای جعفری (رقم دامغان) از شرکت بهکود کرمان تأمین شد. گیاهان در گلخانه در شرایط 14 ساعت روشنایی و 10 ساعت تاریکی با دمای 2 ± 25 درجه سانتیگراد پرورش داده شدند. از برگ گیاهان جعفری دو ماهه به منظور استخراج RNA استفاده گردید.

به‌منظور طراحی آغازگرهای دژنره، توالی آمینواسیدی رمزکننده معروفترین اندونوکلئازهای اختصاصی DNA هترودوپلکس، با استفاده از نرم‌افزار Bioedit v. 7.0.9 و به روش ClustalW همردیف شدند. پس از همردیفی توالی‌ها، مناطقی که بیشترین مشابهت را نشان دادند، جهت طراحی آغازگرها انتخاب شدند. بدین ترتیب، هشت آغازگر دژنره مختلف جهت تکثیر قطعات مختلفی از ژن‌های رمزکننده نوکلئازهای اختصاصی تک‌رشته طراحی گردید (جدول 1). پس از بررسی نتایج حاصل از تکثیر قطعات داخل ژنی، دو جفت آغازگر هترولوگ جهت تکثیر قطعه کامل رمزکننده دو آنزیم نوکلئاز اختصاصی تک‌رشته در گیاه جعفری طراحی گردید (جدول 1). طراحی آغازگرها با استفاده از نرم‌افزار Primer Premier v. 3.5 انجام شد.

پس از استخراج RNA کل با استفاده از محلول RNX-Plus Solution  (Cinnagen co, Iran, Cat.No: RN7713C) و تعیین کمیت و کیفیت آن، رشته اولcDNA  با استفاده از 5/0 میکروگرم RNAی کل نمونه‌های گیاهی و کیت First Strand cDNA Synthesis Kit (Fermentas Co, Cat.No: K1611)، مطابق دستورالعمل شرکت سازنده سنتز گردید. پس از سنتز رشته اول cDNA، جهت تکثیر قطعات داخل ژنی، از واکنش‌های PCR در حضور ترکیبات مختلفی از جفت آغازگرهای دژنره استفاده گردید. در هر واکنش از ترکیب 5/2 میکرولیتر بافر واکنش 10X، 5/3 میکرولیتر MgCl2 25 میلی‌مولار، 5/0 میکرولیتر dNTP mix 10 میلی‌مولار، 10 پیکومول از هر آغازگر، 2 میکرولیتر محصول واکنش RT، 25/1 واحد آنزیم Taq DNA polymerase و آب مقطر دیونیزه تا حجم 25 میکرولیتر استفاده شد. پس از آماده‌سازی واکنش‌ها، برنامه PCR در 38 چرخه به قرار: واسرشته‌سازی اولیه در دمای 94 درجه سانتیگراد به مدت سه دقیقه، واسرشته‌سازی در دمای 94 درجه سانتیگراد به مدت 45 ثانیه، اتصال آغازگر در دماهای مختلف (56-47 درجه سانتیگراد) بسته به توالی آغازگرها به مدت 45 ثانیه، بسط در دمای 72 درجه سانتیگراد به مدت یک دقیقه و بسط نهایی در دمای 72 درجه سانتیگراد به مدت شش دقیقه انجام شد. همچنین، به منظور تکثیر قطعات ژنی با طول کامل، از آغازگرهای هترولوگ و آنزیم DNA پلیمراز Long PCR enzyme mix (Fermentas Co, Cat.No: K0181) با خاصیت تصحیح قرائت استفاده شد. در این PCR، اتصال آغازگر در دمای 60 درجه سانتیگراد برای جفت آغازگر PIfwd و PIrev و 56 درجه سانتیگراد برای جفت آغازگر  PIIfwd و PIIrev به مدت 45 ثانیه انجام شد.

 

 

 

جدول1- آغازگرهای مورد استفاده جهت تکثیر قطعات داخلی (8-1) و طول کامل (12-9) ژن‌های رمزکننده نوکلئازهای اختصاصی DNA هترودوپلکس در گیاه جعفری.

Table 1- Oligonucleotide primers used to amplify internal (1-8) and full-length (9-12) fragments of genes encoding heteroduplex DNA specific nucleases in parsley.

نوع آغازگر  (Primer type)

طول قطعه مورد انتظار (Expected band size)

توالی آغازگر  (Primer sequence) 

5´    -      3´

نام آغازگر  (Primer name)   

\

 

 

 

 

 

شماره (No.)

دژنره

(Degenerate)

PIF1/PIR1~288bp

cgt cgc tgt gyg tnt ggc c

PIF1

1

PIF1/PIR2~387bp

ctg gag cca ttc ara ayt tca c

PIF2

2

PIF2/PIR1~135bp

cat gca tag gyt gat gda tat c

PIR1

3

PIF2/PIR2~234bp

gta aga ata aty tct cka tcc c

PIR2

4

PIIF1/PIIR1~445bp

tac tgt aga gay tgc cay ga

PIIF1

5

PIIF1/PIIR2~275bp

gac cgg tgt gtn act ggn gc

PIIF2

6

PIIF2/PIIR1~410bp

atg ctt tca gwa gcr tac

PIIR1

7

PIIF2/PIIR2~240bp

atc att gtg tcc can acr tgr tg

PIIR2

8

هترولوگ

(Heterologous)

PIfwd/PIrev~891bp

atg acg cga tta tat tct gtg ttc

PIfwd

9

tca tgc caa aga atg atc tgc g

PIrev

10

PIIfwd/PIIrev~933bp

atg ggt atg ttg act tat ac

PIIfwd

11

tta cac tat ttc aat att gtt ac

PIIrev

12

 

 

پس از آشکارسازی قطعات ژنی تکثیر شده در ژل الکتروفورز، قطعات مورد نظر با استفاده از کیت Silica Bead Gel Extraction Kit (Fermentas Co, Cat.No: K0513) خالص‌سازی شدند. همسانه‌سازی بر اساس سیستم T/A-cloning و با استفاده از کیت  InsT/AClone™ PCR Cloning Kit (Fermentas Co, Cat.No: K1214) در ناقل پلاسمیدی pTZ57R/T انجام گرفت. جهت تراریزش، از سلول‌های باکتری E. coli سویه JM107 استفاده شد. پلاسمیدهای نوترکیب با استفاده از کیت AccuPrep Plasmid Mini Extraction Kit  (Bioneer Co, Cat.No: K-3030-1) و به روش لیز قلیایی از سلول‌های باکتری استخراج شدند. به‌منظور تأیید پلاسمیدهای نوترکیب و اطمینان از صحت قطعه درج شده، واکنش‌های PCR با آغازگرهای اختصاصی مرتبط با هر قطعه و همچنین واکنش‌های هضم آنزیمی با استفاده از دو آنزیم برشی XbaI وBamHI  بر روی پلاسمیدهای نوترکیب انجام گرفت. توالی نوکلئوتیدی قطعات همسانه‌سازی شده با استفاده از آغازگرهای عمومی M13/pUC که در بالادست و پایین‌دست قطعه درج شده بر روی ناقل pTZ57R/T  قرار دارند، توسط شرکت بیونیر کره جنوبی مشخص شد.

پس از همسانه‌سازی و شناسایی توالی‌های کامل رمزکننده آنزیم‌های مورد نظر، توالی‌های نوکلئوتیدی مزبور با استفاده از نرم‌افزار آنلاین ExPASY translate (http://web.expasy.org) به توالی آمینواسیدی متناظر ترجمه شدند. خصوصیات فیزیکوشیمیایی توالی‌های پروتئینی ترجمه شده با استفاده از برنامه‌های Compute pI/Mw، Protscale، Prosite (http://web.expasy.org)، Signal P و NETNGlyc (http://www.cbs.dtu.dk) مورد بررسی قرار گرفت. ساختار دوم و سوم پروتئین‌ها با استفاده از پایگاه نرم‌افزاری SWISS-MODEL (http://web.expasy.org)، و روابط فیلوژنتیکی آنها با سایر نوکلئازهای اختصاصی DNA هترودوپلکس در نرم‌افزار MEGA v. 5.0 تعیین گردید.

 

نتایج و بحث

جداسازی و همسانه‌سازی توالی‌های ژنی هدف

تکثیر قطعه DNA منطبق بر اندازه مورد انتظار در واکنش‌های PCR با حضور جفت آغازگرهای PIF1/PIR2 (قطعه bp 387)، PIIF1/PIIR2 (قطعه bp 275) و PIIF2/PIIR2 (قطعه bp 240) محقق گردید. واکنش‌های PCR با حضور سایر آغازگرهای دژنره، نتیجه مورد انتظار را در پی نداشتند. پس از همسانه‌سازی و تعیین توالی قطعات تکثیریافته، نتایج جستجوی BLAST نشان داد که قطعه bp 387 تکثیر شده متعلق به زیرگروه آنزیمی CEL I و قطعات bp 275 و bp 240 تکثیر شده متعلق به زیرگروه آنزیمی CEL II از گروه نوکلئازهای اختصاصی DNA هترودوپلکس در خانواده نوکلئازهای S1/P1 می‌باشند. واکنش‌های PCR جداگانه با استفاده از آغازگرهای هترولوگ طول کامل، منتج به تکثیر دو قطعه DNA با اختلاف اندازه تقریبی bp 50 گردید (شکل 1). پس از همسانه‌سازی و تعیین توالی قطعات همسانه‌سازی شده، چارچوب قرائت bp 891 جداسازی‌شده به نام pars I و چارچوب قرائت bp 930 حاصل به نام pars II نامگذاری گردید.


 

 

شکل 1- الکتروفورز محصولات واکنش PCR تکثیر اختصاصی (A) و هضم آنزیمی XbaI و BamHI نمونه‌های پلاسمید نوترکیب (B). نشانگر اندازه DNA: لدر bp100 (Fermentas Co, Cat. No: SM0323)؛ 1 و 3: تکثیر قطعه منطبق بر اندازه مورد انتظار (bp891) به ترتیب مربوط به واکنش RT-PCR و پلاسمید نوترکیب pParsI-TZ؛ 2 و 4: تکثیر قطعه منطبق بر اندازه مورد انتظار (bp930) به ترتیب مربوط به واکنش RT-PCR و پلاسمید نوترکیب pParsII-TZ؛ 5: نمونه پلاسمید نوترکیب pParsI-TZ؛ 6: نمونه پلاسمید نوترکیب pParsII-TZ؛ 7 و 8: قطعات برش‌یافته منطبق براندازه‌ مورد انتظار (bp891 + bp2886 (حاصل از هضم آنزیمی پلاسمید نوترکیب pParsI-TZ؛ 9 و 10: قطعات برش‌یافته منطبق براندازه‌ مورد انتظار (bp930 + bp2886 (حاصل از هضم آنزیمی پلاسمید نوترکیب pParsII-TZ.

Figure 2 - Electrophoresis of specific PCR products (A) and Restriction analysis of recombinant plasmids using XbaI and BamHI (B). DNA size marker: 100 bp DNA ladder (Fermentas Co, Cat. No: SM0323); 1 & 3: Amplification of DNA fragments with the expected size (891 bp) related to RT-PCR reaction and pParsI-TZ plasmid, respectively; 2 & 4: Amplification of DNA fragments with the expected size (930 bp) related to RT-PCR reaction and pParsII-TZ plasmid, respectively; 5: pParsI-TZ recombinant plasmid; 6: pParsII-TZ recombinant plasmid; 7 & 8: Excised DNA fragments with the expected sizes (891bp+2886bp) from pParsI-TZ plasmid; 9 & 10: Excised DNA fragments with the expected sizes (930bp+2886bp) from pParsII-TZ plasmid.

 


بررسی توالی و مقایسه خصوصیات فیزیکوشیمیایی آنزیم‌هایPARS I  و PARS II

توالی‌های رمزکننده نوکلئازهای PARS I و PARS II به ترتیب با شماره‌های دستیابی JN974458 و JN974459 در بانک ژن به ثبت رسیدند. بررسی توالی آمینواسیدی ترجمه شده نشان داد که ژن‌های pars I و pars II به ترتیب 296 و 309 اسیدآمینه را کد می‌نمایند که هر دو پروتئین به خانواده نوکلئازهای S1/P1 تعلق دارند. همچنین بررسی دومن‌های حفاظت‌شده نشان داد که نوکلئاز PARS I دارای دومن اصلی S1/P1 (متشکل از اسیدهای آمینه 23 تا 287) و نوکلئاز PARS II نیز دارای دومن اصلی S1/P1 (متشکل از اسیدهای آمینه 21 تا 284) می‌باشند. این دومن‌ها در حقیقت، توالی پروتئین بالغ را تشکیل می‌دهند. همچنین، بر اساس جستجوی بلاست و با استفاده از توالی دومن اصلی نوکلئازهای PARS I و PARS II، پروتئین‌هایی که بیشترین همولوژی را نسبت به نوکلئازهای مزبور نشان دادند، مشخص شدند. بر این اساس، نوکلئازهای CEL I از کرفس و ZEN1 از گل آهار به ترتیب با 99 و 80 درصد تشابه توالی اسیدآمینه، بیشترین شباهت ترادف را نسبت به نوکلئاز PARS I نشان دادند. از طرف دیگر، نوکلئاز CEL II از کرفس با داشتن 95 درصد همولوژی توالی اسیدآمینه، بیشترین شباهت ترادف را نسبت به نوکلئاز PARS II نشان داد.

پروتئین‌های آنزیمی PARS I و PARS II، تمام ویژگی‌ها و مشخصه‌های خاص اندونوکلئازهای خانواده S1/P1 را دارا می‌باشند (شکل 2). نوکلئازهای این خانواده حاوی حداقل چهار سیستئین حفاظت‌شده هستند که این چهار سیستئین، دو پیوند دی‌سولفیدی درون‌مولکولی را ایجاد می‌نمایند و باعث بوجود آمدن ساختار سوم پروتئین می‌شوند (Iwamatsu et al., 1991; Maekawa et al., 1991). بررسی‌ها نشان داد که این سیستئین‌های حفاظت‌شده در اندونوکلئازهای PARS I و PARS II در موقعیت‌های مشابهی قرار گرفته‌اند. علاوه بر این، نه اسیدآمینه حفاظت‌شده مرتبط با اتم‌های فلزی روی در نوکلئازهای PARS I و PARS II همانند سایر نوکلئازهای این خانواده بصورت حفاظت‌شده باقی مانده‌اند. یون‌های فلزی اغلب در تغییر سوبستراها و ایجاد ثبات ساختاری در مولکول پروتئین ایفای نقش می‌کنند. یون روی تا حد زیادی فعالیت DNaseیی نوکلئازها را افزایش می‌دهد (Podzimek et al., 2011). با استفاده از برنامه Compute pI/Mw، وزن مولکولی و نقطه ایزوالکتریک پروتئین‌ ترجمه شده نوکلئاز PARS I به ترتیب برابر 94/33 کیلودالتون و 2/6 pH= و برای نوکلئاز PARS II به ترتیب 819/34 کیلودالتون و 45/6 pH= پیش‌بینی شد.

بر اساس ساختار آمینواسیدی نواحی دارای فعالیت RNaseیی و DNaseیی در نوکلئاز P1 (Maekawa et al., 1991)، دو ناحیه مربوط به فعالیت مشابه در نوکلئازهای PARS I و PARS II مشخص گردید. وجود این مناطق فعال، نشان از فعالیت نوکلئازی این دو آنزیم دارد. همچنین، اندازه‌گیری نمایه آبگریزی در برنامه Protscale نشان داد که هر دوی این نوکلئازها دارای یک توالی بسیار آبگریز در انتهای آمینی خود می‌باشند.


 

 

 

شکل 2- توالی‌ نوکلئوتیدی و آمینواسیدی اندونوکلئازهای PARS I (الف) و PARS II (ب). کدون شروع با حروف بولد و کدون خاتمه با علامت ستاره مشخص شده ‌است. اسیدآمینه‌های سیستئین حفاظت‌شده دخیل در ایجاد پیوندهای دی‌سولفیدی در داخل دایره، نه اسیدآمینه حفاظت‌شده متصل شونده به سه اتم روی بصورت سایه‌دار، ترادف‌های آمینواسیدی سیگنال گلیکوزیلاسیون با خط زیرین، توالی سیگنال پپتید با حروف ایتالیک و مناطق دارای فعالیت RNaseیی و DNaseیی نیز به ترتیب در کادرهای مستطیل و بیضی مشخص شده‌اند.

Figure 2- Nucleotide and amino acid sequences of PARS I (A) and PARS II (B) endonucleases. Start codon is shown by bold letters and asterisk indicates the stop codon. Open circles: conserved cysteine residues involved in the formation of disulfide bonds; Shades: nine conserved residues interacting with Zn atoms; underlines: potential N-glycosylation sites; Italics: signal peptide sequence; Rectangular: site with RNase activity; Oval: site with DNase activity.

 

 

لذا به منظور تعیین حضور توالی سیگنال پپتید در انتهای آمینی این نوکلئازها، توالی رمزکننده آنها با استفاده از برنامه SignalP 4.0 مورد ارزیابی قرار گرفت. نتایج حاصل از بررسی نوکلئاز PARS I نشان داد که این نوکلئاز دارای یک توالی سیگنال پپتید به طول 22 اسیدآمینه در انتهای آمینی خود می‌باشد. منطقه برش نیز در بین اسیدآمینه‌های Ala22 و Trp23 مشخص گردید که این برش توسط آنزیم سیگنال پپتیداز انجام می‌شود. در نوکلئاز PARS II، توالی سیگنال پپتید به طول 20 اسیدآمینه با منطقه برش در بین اسیدآمینه‌های Ser20 و Trp21 مشخص شد (شکل 2). بنابراین، پروتئین بالغ در هر دو نوکلئاز با اسیدآمینه تریپتوفان آغاز خواهد شد. نتیجه حاصل با قانون "1- ،3-" نیز مطابقت دارد، زیرا هر دو اسیدآمینه Val20 و Ala22 در نوکلئاز PARS I و اسیدآمینه‌های Val18 و Ser20 در نوکلئاز PARS II، کوچک و غیرقطبی می‌باشند (Von Heijne, 1985; Nielsen et al., 1997).

جهت تعیین سیگنال‌های گلیکوزیلاسیون، توالی آمینواسیدی نوکلئازهای مورد مطالعه در پایگاه PROSITE و همچنین در نرم‌افزار آنلاین NETNGlyc 1.0 بر اساس حضور توالی Asn-Xaa-Ser/Thr (Marshall, 1979) مورد بررسی قرار گرفت. بر اساس نتایج حاصل مشخص گردید که نوکلئاز PARS I دارای چهار سیگنال گلیکوزیلاسیون متشکل از NLSS در موقعیت 58، NFTS در موقعیت 116، NMTE در موقعیت 134 و NFTE در موقعیت 208 می‌باشد. بر این اساس، پنج سیگنال‌ گلیکوزیلاسیون در نوکلئاز PARS II نیز به ترتیب زیر مشخص گردید: NYTE در موقیت 112، NLTE در موقعیت 131، NITG در موقعیت 205، NCTA در موقعیت 219 و NLTR در موقعیت 290 (شکل 2). مقایسه این مناطق با سایر نوکلئازهای اختصاصی تک‌رشته نشان می‌دهد که تمامی این نوکلئازها دارای آسپارژین‌های گلیکوزیله شونده مشابهی می‌باشند. بنابراین، دو نوکلئاز PARS I و PARS II نیز مانند سایر نوکلئازهای هم‌خانواده خود برای گلیکوزیله شدن، در مسیر ترشحی سلول قرار می‌گیرند.

 

بررسی ساختمان دوم و مدلسازی مولکولی پروتئین‌های آنزیمی PARS I و PARS II

ساختمان دوم و سوم نوکلئازهای PARS I و PARS II با استفاده از مجموعه نرم‌افزاری SWISS-MODEL مورد ارزیابی قرار گرفت. نتایج حاصل از بررسی توالی بالغ این نوکلئازها نشان داد که ساختمان دوم و سوم هر دوی آنها متشکل از 17 مارپیچ آلفا و پنج رشته بتا می‌باشد. بررسی ساختمان سوم با استفاده از مدل‌سازی مبتنی بر همولوژی، یک ابزار کمکی جهت ارزیابی خصوصیات پروتئین های مورد مطالعه است. جهت بررسی ساختمان سه‌بعدی نوکلئازهای PARS I و PARS II به ترتیب از ساختار کریستالی نوکلئاز TBN-1 از گوجه‌فرنگی (با شماره دستیابی 3sng در پایگاه PDB) و نوکلئاز ENDO2 از آرابیدوپسیس (با شماره دستیابی 3w52 در پایگاه PDB) به عنوان الگو استفاده شد. هر دوی این نوکلئازها به خانواده S1/P1 تعلق داشته و به ترتیب 78/76 درصد و 74/57 درصد تشابه توالی با نوکلئازهای PARS I و PARS II نشان می‌دهند. این میزان تشابه برای ایجاد مدل‌های سه بعدی قابل اطمینان کافی است (Podzimek et al., 2011). نتایج حاصل، نشان از اهمیت اسیدآمینه تریپتوفان انتهای آمینی برای فعالیت این پروتئین های آنزیمی داشت. انتهای آمینی در تمام اندونوکلئازهای این خانواده از ساختار مشابهی برخوردار است و اسیدآمینه تریپتوفان در حفره منطقه فعال پروتئین قرار می‌گیرد. تریپتوفان انتهای آمینی با استفاده از بخش‌های آمینو و کربونیل خود، یکی از یون‌های روی را درگیر می‌نماید (Podzimek et al., 2011). این موضوع بایستی در تولید و فعالسازی پروتئولیتیک این آنزیم‌ها و بطور کلی در روش‌های تولید نوترکیب آنها مدنظر قرار گیرد. هماهنگی میان سه اتم روی در منطقه فعال نوکلئازهای گیاهی به احتمال زیاد در نوکلئازهای مورد مطالعه نیز وجود خواهد داشت. مشاهده مدل‌های سه‌بعدی نشان می‌دهد که سه اتم روی در مرکز پروتئین قرار گرفته و دو صفحه بتا نیز در خلاف جهت یکدیگر و در سطح خارجی پروتئین قرار می‌گیرند. نحوه آرایش صفحات بتا به گونه‌ای است که یک ساختار ته‌سنجاقی را ایجاد می‌نمایند. این درحالی است که مارپیچ‌های آلفا بصورت درهم قرار گرفته و دارای نظم خاصی نسبت به یکدیگر نمی‌باشند (شکل 3).

همچنین، جایگاه پیوندهای دی‌سولفیدی در ساختار سه بعدی پروتئین، مورد ارزیابی قرار گرفت. بر این اساس، در نوکلئاز PARS I، سیستئین‌های 91، 99 و 224 به ترتیب با سیستئین‌های 243، 109 و 230، و در نوکلئاز PARS II نیز سیستئین‌های 30 با 61، 95 با 105 و 220 با 227 پیوند دی‌سولفیدی تشکیل می‌دهند. پیوندهای دی‌سولفیدی در هر دو نوکلئاز، در فاصله کمی از یکدیگر و در سطح خارجی پروتئین قرار گرفته‌اند. تعیین موقعیت آسپارژین‌های گلیکوزیله شونده بر روی ساختمان سه‌بعدی نوکلئازهای PARS I و PARS II  نیز نشان داد که این آسپارژین‌ها بر روی سطح خارجی پروتئین قرار گرفته و با اتصال به واحدهای گلیکان، باعث افزایش ثبات پروتئین و مقاومت در برابر پروتئولیز می‌شوند (شکل 3).

مقایسه ساختمان نوکلئازهای PARS I و PARS II نشان داد که اگرچه این دو نوکلئاز تنها 49 درصد مشابهت ساختمان اول نسبت به یکدیگر نشان می‌دهند، ولی در سطح ساختمان سوم، بسیار به یکدیگر شبیه می‌باشند. البته وجود این شباهت در ساختار سه‌بعدی نمی‌تواند دلیل بر عملکرد یکسان این دو نوکلئاز باشد. چنین موضوعی در مورد دو نوکلئاز CEL I و CEL II نیز دیده می شود که این دو نوکلئاز با داشتن تنها 45 درصد شباهت در سطح آمینواسیدی و وجود شباهت بسیار بالا در ساختار سوم، فعالیت آنزیمی متفاوت، وزن مولکولی متفاوت و خصوصیات ساختاری و عملکردی متفاوتی نسبت به یکدیگر نشان می‌دهند (Shandilya et al., 2009). به طور کلی، وجود شباهت در ساختار سه‌بعدی اندونوکلئازهای گیاهی را می‌توان تا حد زیادی به حضور مناطق فعال حفاظت‌شده در این نوکلئازها نسبت داد.

 

بررسی فیلوژنتیکی پروتئین‌های آنزیمی PARS I و PARS II

از آنجا که تاکنون بررسی فیلوژنتیکی جامعی بر روی نوکلئازهای خانواده S1/P1 صورت نگرفته ‌بود، از توالی پروتئینی بالغ مهمترین نوکلئازهای اختصاصی تک‌رشته، مرتبط با دومن اصلی پروتئین‌های این خانواده، جهت ترسیم درخت فیلوژنتیکی استفاده شد. نتایج نشان داد که نوکلئازهای گیاهی به دو زیرگروه CEL I و CEL II تقسیم‌ می‌شوند. در این گروه‌بندی، نوکلئاز PARS I در زیرگروه CEL I و نوکلئاز PARS II در زیرگروه CEL II قرار گرفت (شکل 4).

 

 

شکل 3- مدل ساختار سه‌بعدی نوکلئازهای PARS I (a) و PARS II (b) ایجاد شده با استفاده از پایگاه SWISS-MODEL. a1 و a2: اجزای ساختار دوم (مارپیچ‌های آلفا، رشته ها و چرخش‌های بتا)، اتم های روی (سه دایره مستقل) و موقعیت آسپارژین های گلیکوزیله شونده؛ b1 و b2: موقعیت اسیدآمینه‌های سیستئین و پل های دی سولفیدی حفاظت‌شده.

Figure 3- The 3-D structure models of PARS I (a) and PARS II (b) proteins created by SWISS-MODEL server. a1 and b1: α-helices, β-sheets, beta hairpin, zinc ions (single bulbs) and glycosylated asparagine residues (aggregated bulbs) are clearly visible. a2 and b2: Magenta bulbs represent positions of disulphide bonds.

 

شکل4- آنالیز فیلوژنتیکی توالی آمینواسیدی اندونوکلئازهای اختصاصی DNA هترودوپلکس با استفاده از نرم‌افزار MEGA v5.0 (Tamura et al., 2011) به روش Neighbor-Joining و با ارزش بوتستراپ 1500. توالی آمینواسیدی آنزیم پورین نوکلئوزید فسفوریلاز انسانی بعنوان برون‌گروه مورد استفاده قرار گرفت. شماره‌های موجود بر روی شاخه‌ها، نشان‌دهنده ارزش بوتستراپ می‌باشند.

Figure 4- Phylogenetic analysis of amino acid sequences of heteroduplex DNA specific endonucleases using MEGA v5.0 software (Tamura et al., 2011) with the Neighbor-Joining method and 1500 Bootstrap value. Amino acid sequence of human Purine Nucleoside Phosphorylase (PNP) enzyme was used as out-group. The numbers on branches indicate bootstrap values.

 

 

فعالیت نوکلئازی قوی‌تر عصاره آنزیمی گیاه جعفری در مقایسه با گیاه کرفس علی‌رغم سطح پایین بیان آنزیم متناظر CEL I (آنزیم PARS I) در این گیاه قبلا گزارش شده بود (Zolala et al., 2009). با توجه به این که بیان آنزیم PARS I در جعفری کمتر از بیان آنزیم CEL I در کرفس است، می‌توان فعالیت آنزیمی قوی‌تر عصاره آنزیمی جعفری ایرانی در برش سوبسترای DNA هترودوپلکس را تا حد زیادی به فعالیت متفاوت آنزیم PARS II نسبت داد. نتایج حاصل از جداسازی و توالی‌یابی نوکلئازهای PARS I و PARS II نیز این احتمال را تقویت می‌نماید. مقایسه توالی نوکلئازهای PARS I و CEL I نشان داد که این دو نوکلئاز تنها در دو اسیدآمینه با یکدیگر اختلاف دارند. درحالی که نوکلئازهای PARS II و CEL II، اختلاف بیشتری نسبت به یکدیگر نشان می‌دهند. بنابراین، انتظار می‌رود که نوکلئاز PARS I فعالیتی مشابه نوکلئاز CEL I داشته باشد، اما نوکلئاز PARS II فعالیت آنزیمی خود را با شدت متفاوتی نسبت به نوکلئاز CEL II بروز دهد. فعالیت آنزیمی برش DNA هترودوپلکس در عصاره جعفری قبلاً به اثبات رسیده‌ است، ولی درحال حاضر هیچ اطلاعی از میزان فعالیت هر یک از این دو نوکلئاز، مکانیزم فعالیت و ترجیح سوبسترایی آنها در دست نیست. دستیابی به این اطلاعات ارزشمند، مستلزم بررسی فعالیت نمونه خالص و یا فرم نوترکیب این نوکلئازها بر روی سوبسترای DNA هترودوپلکس است.

 

 

 

منابع

Aoyagi S, Sugiyama M, Fukuda H (1998). BFN1 and ZEN1 cDNAs encoding S1-type DNases that are associated with programmed cell death in plants. FEBS Letters 429: 134-138.

Desai NA, Shankar V (2003). Single-strand specific nucleases. FEMS Microbiology Reviews 26: 457-491.

Doetsch PW, McCray Jr WH, Lee K, Bettler DR, Valenzuela MRL (1988). Nuclease SP1: a novel enzyme from spinach that incises damaged duplex DNA preferentially at site of adenine. Nucleic Acid Research 16: 6935–52.

Drew HR (1984). Structural specificities of five commonly used DNA nucleases. Journal of Molecular Biology 176: 535-557.

Henikoff S, Comai L (2003). Single-nucleotide mutations for plant functional genomics. Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology 54: 375–401.

Iwamatsu A, Aoyama H, Dibo G, Tsunasawa S, Sakiyama F (1991). Amino acid sequence of nuclease S1 from Aspergillus oryzae. Journal of Biochemistry 110: 151–8.

Larsen K (2005). Molecular cloning and characterization of a cDNA encoding endonuclease from potato (Solanum tuberosum). Journal of Plant Physiology 162: 1263-1269.

Laskowski SM (1980). Purification and properties of the mung bean nuclease. Methods Enzymology 65: 263-275.

Maekawa K, Tsunasawa S, Dibo G, Sakiyama F (1991). Primary structure of nuclease Pl from Penicillium citrinum. European Journal of Biochemistry 200: 651–661.

Marshall RD (1979). Glycoproteins. Annual Review of Biochemistry 41: 673–702.

Matousek J, Podzimek T, Pouckova P, Stehlik J, Skvor J, Soucek J, Matousek J (2009). Antitumor effect and cytotoxicity of recombinant plant nucleases. Oncology Research 18: 163–171.

Nielsen H, Engelbrecht J, Brunak S, von Heijne G (1997). Identification of prokaryotic and eukaryotic signal peptides and prediction of their cleavage sites. Protein Engineering 10: 1–10.

Nomura A, Suno M, Mizuno Y (1971). Studies on 3´-nucleotidase nuclease from potato tubers, Purification and some properties of the enzyme. Journal of Biochemistry 70: 993–1001.

Oleykowski CA, Mullins CRB, Godwin AK, Yeung AT (1998). Mutation detection using a novel plant endonuclease. Nucleic Acids Research 26: 4597-4602.

Panavas T, Pikula A, Reid PD, Rubinstein B, Walker EL (1999). Identification of senescence associated genes from daylily petals. Plant Molecular Biology 40: 237–48.

Perez-Amador MA, Abler ML, DeRocher EJ, Thompson DM, Van Hoof A, LeBrasseur ND, Lers A, Green PJ (2000). Identification of BFN1, a bifunctional nuclease induced during leaf and stem senescence in Arabidopsis. Plant Physiology 122: 169–179.

Podzimek T, Matousek J, Lipovova P, Pouckova P, Spiwok V, cek J (2011). Biochemical properties of three plant nucleases with anticancer potential. Plant Science 180: 343–351.

Shandilya H, Gerard GF, Qiu P (2009). Nucleic acid sequences encoding CEL II endonuclease. United States Patent, US7560261B2.

Sung SC, Laskowski Sr M (1962). A nuclease from mung bean sprouts. Journal of Biological Chemistry 237: 506–11.

Tamura K, Peterson D, Peterson N, Stecher G, Nei M, Kumar S (2011). MEGA5: Molecular Evolutionary Genetics Analysis using Maximum Likelihood, Evolutionary Distance, and Maximum Parsimony Methods. Molecular Biology and Evolution 28: 2731-2739.

Taylor GR, Deeble J (1999). Enzymatic methods for mutation scanning. Genetic Analysis 14: 181–6.

Till BJ, Bortner C, Comai L, Henikoff S (2004). Mismatch cleavage by single-strand specific nucleases. Nucleic Acids Research 32: 2632-2641.

Triques K, Sturbois B, Gallais S, Dalmais M, Chauvin S, Clepet C, Aubourg S, Rameau C, Caboche M, Bendahmane A (2007). Characterization of Arabidopsis thaliana mismatch specific endonucleases: application to mutation discovery by TILLING in pea. The Plant Journal 51: 1116-1125.

Von Heijne G (1985). Signal sequences. Journal of Molecular Biology 184:99–105.

Zolala J, Bahrami AR, Farsi M, Matin M, Yassaee V (2009). Comparison of CEL I gene expression and mismatch cleavage activity in some Apiaceae plants. Molecular Breeding 24: 17–24.

 

 

 

Isolation, cloning and molecular characterization of genes encoding single-strand specific endonucleases from Parsley (Petroselinum crispum L.)

 

Mirzaei M.1, Zolala J.* 2, Shalouzad A.1

1 M.Sc. in Agricultural Biotechnology, Faculty of Agriculture, Shahid Bahonar University of Kerman, Kerman, Iran.

2 Agricultural Biotechnology Department, Faculty of Agriculture, Shahid Bahonar University of Kerman, Kerman, Iran.

 

Abstract

Single-strand specific (sss) nucleases (S1/P1 family) are widely used in molecular genetics studies. The most widely used sss-nucleases are those plant endonucleases with the ability of specific cleavage of mismatch loops in heteroduplex DNA molecules. Because of the valuable activity of these endonucleases, enzymatic cleavage of heteroduplex DNA molecules is one of the most common techniques of point mutation detection in genomes. In this study, gene sequences encoding single-strand specific endonucleases were isolated from parsley (Petroselinum crispum L.) using heterologous primers in PCR reactions. The isolated gene sequences, after cloning and molecular identification, were designated as pars I and pars II. Physicochemical, structural and phylogenetic analysis using software tools, verified PARS I and PARS II as two members of S1/P1 family with a substantial homology to heteroduplex DNA specific endonucleases. However, it is essential to produce pure enzyme preparations as native or recombinant forms to determine mechanisms of activity and substrate preferences of these nucleases on heteroduplex DNA substrates.    

Key words: single-strand specific nucleases, Petroselinum crispum, Enzymatic cleavage of heteroduplex DNA, cloning.

 


*  نویسنده مسئول: جعفر ذوالعلی                                        تلفن: 03431322654                              Email: j.zolala@uk.ac.ir

* Corresponding Author:  Zolala J.                Tel: 03431322654                      Email:  j.zolala@uk.ac.ir

References

Aoyagi S, Sugiyama M, Fukuda H (1998). BFN1 and ZEN1 cDNAs encoding S1-type DNases that are associated with programmed cell death in plants. FEBS Letters 429: 134-138.
Desai NA, Shankar V (2003). Single-strand specific nucleases. FEMS Microbiology Reviews 26: 457-491.
Doetsch PW, McCray Jr WH, Lee K, Bettler DR, Valenzuela MRL (1988). Nuclease SP1: a novel enzyme from spinach that incises damaged duplex DNA preferentially at site of adenine. Nucleic Acid Research 16: 6935–52.
Drew HR (1984). Structural specificities of five commonly used DNA nucleases. Journal of Molecular Biology 176: 535-557.
Henikoff S, Comai L (2003). Single-nucleotide mutations for plant functional genomics. Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology 54: 375–401.
Iwamatsu A, Aoyama H, Dibo G, Tsunasawa S, Sakiyama F (1991). Amino acid sequence of nuclease S1 from Aspergillus oryzae. Journal of Biochemistry 110: 151–8.
Larsen K (2005). Molecular cloning and characterization of a cDNA encoding endonuclease from potato (Solanum tuberosum). Journal of Plant Physiology 162: 1263-1269.
Laskowski SM (1980). Purification and properties of the mung bean nuclease. Methods Enzymology 65: 263-275.
Maekawa K, Tsunasawa S, Dibo G, Sakiyama F (1991). Primary structure of nuclease Pl from Penicillium citrinum. European Journal of Biochemistry 200: 651–661.
Marshall RD (1979). Glycoproteins. Annual Review of Biochemistry 41: 673–702.
Matousek J, Podzimek T, Pouckova P, Stehlik J, Skvor J, Soucek J, Matousek J (2009). Antitumor effect and cytotoxicity of recombinant plant nucleases. Oncology Research 18: 163–171.
Nielsen H, Engelbrecht J, Brunak S, von Heijne G (1997). Identification of prokaryotic and eukaryotic signal peptides and prediction of their cleavage sites. Protein Engineering 10: 1–10.
Nomura A, Suno M, Mizuno Y (1971). Studies on 3´-nucleotidase nuclease from potato tubers, Purification and some properties of the enzyme. Journal of Biochemistry 70: 993–1001.
Oleykowski CA, Mullins CRB, Godwin AK, Yeung AT (1998). Mutation detection using a novel plant endonuclease. Nucleic Acids Research 26: 4597-4602.
Panavas T, Pikula A, Reid PD, Rubinstein B, Walker EL (1999). Identification of senescence associated genes from daylily petals. Plant Molecular Biology 40: 237–48.
Perez-Amador MA, Abler ML, DeRocher EJ, Thompson DM, Van Hoof A, LeBrasseur ND, Lers A, Green PJ (2000). Identification of BFN1, a bifunctional nuclease induced during leaf and stem senescence in Arabidopsis. Plant Physiology 122: 169–179.
Podzimek T, Matousek J, Lipovova P, Pouckova P, Spiwok V, cek J (2011). Biochemical properties of three plant nucleases with anticancer potential. Plant Science 180: 343–351.
Shandilya H, Gerard GF, Qiu P (2009). Nucleic acid sequences encoding CEL II endonuclease. United States Patent, US7560261B2.
Sung SC, Laskowski Sr M (1962). A nuclease from mung bean sprouts. Journal of Biological Chemistry 237: 506–11.
Tamura K, Peterson D, Peterson N, Stecher G, Nei M, Kumar S (2011). MEGA5: Molecular Evolutionary Genetics Analysis using Maximum Likelihood, Evolutionary Distance, and Maximum Parsimony Methods. Molecular Biology and Evolution 28: 2731-2739.
Taylor GR, Deeble J (1999). Enzymatic methods for mutation scanning. Genetic Analysis 14: 181–6.
Till BJ, Bortner C, Comai L, Henikoff S (2004). Mismatch cleavage by single-strand specific nucleases. Nucleic Acids Research 32: 2632-2641.
Triques K, Sturbois B, Gallais S, Dalmais M, Chauvin S, Clepet C, Aubourg S, Rameau C, Caboche M, Bendahmane A (2007). Characterization of Arabidopsis thaliana mismatch specific endonucleases: application to mutation discovery by TILLING in pea. The Plant Journal 51: 1116-1125.
Von Heijne G (1985). Signal sequences. Journal of Molecular Biology 184:99–105.
Zolala J, Bahrami AR, Farsi M, Matin M, Yassaee V (2009). Comparison of CEL I gene expression and mismatch cleavage activity in some Apiaceae plants. Molecular Breeding 24: 17–24.

Files

Share

How to cite

Statistics